Alogeninių keratinocitų persodinimo į dirbtinai sukurtus baltųjų žiurkių randus eksperimentinis darbas

Noras išnaudoti ląstelių potencialą ir poreikis rasti naujų veiksmingų metodų randų estetinei išvaizdai pagerinti paskatino idėją pabandyti ištirti keratinocitų transplantacijos ant randų paviršių galimybę.

Siekiant įrodyti keratinocitų kultūros panaudojimo randų išvaizdai pagerinti tikimybę, buvo atliktas eksperimentinis tyrimas su baltomis laboratorinėmis žiurkėmis, kurioms buvo sukurti randų paviršiai. Žiurkių randų modelis buvo gautas užgijus dirbtinai padarytoms žaizdoms nugaroje, palei stuburą. Žiurkėms buvo išpjauti vienodi odos gabalėliai, 2x3 cm dydžio. Praėjus 2,5 mėnesio po „randų modeliavimo“ operacijos, žiurkėms buvo atlikta dermabrazija (viršutinių rando sluoksnių pašalinimas termokaustiniu būdu) ir persodinti alogeniniai keratinocitai, išskirti iš žiurkių jauniklių odos praėjus 2–4 dienoms po gimimo.

Žiurkių epidermio ląstelių išskyrimas ir kultivavimas buvo atliktas Rusijos mokslų akademijos Citologijos instituto ląstelių technologijų laboratorijoje, naudojant šią technologiją.

Oda buvo nuplauta Hanko druskos tirpalu, kuriame buvo 200 U/ml gentamicino, ir supjaustyta mažais 0,2–0,5 cm2 ploto gabalėliais ^. Odos gabalėliai buvo inkubuojami 0,5 % dispazės tirpale subalansuotame druskos fosfato buferiniame tirpale 37 °C temperatūroje 1 valandą. Tada gabalėliai buvo perkelti į Dulbeko fosfato buferinį tirpalą, o epidermis atskirtas nuo dermos. Epidermis buvo inkubuojamas 0,125 % tripsino tirpale 10–15 minučių maišant 50 aps./min. greičiu, po to fermento veikimas buvo sustabdytas pridedant 5 % vaisiaus galvijų serumo. Trečdalis gautos ląstelių suspensijos buvo panaudota gryna forma vienam iš transplantacijos ant randų variantų, antrasis trečdalis buvo auginamas ant biologiškai suderinamų buitinių plėvelių dangų „Polypor“, o trečiasis – Petri lėkštelėse be substrato. Gautų randų dermabrazijos operacija žiurkėms ir vėlesnė žiurkių epidermio ląstelių transplantacija ant jų buvo atlikta eterinėje anestezijoje, naudojant terminį pridegiklį.

Pirmajai žiurkių grupei po dermabrazijos ant nupoliruoto, fiziologiniu tirpalu nuplauto ir nusausinto rando paviršiaus buvo uždėti sterilūs batisto gabalėliai, ant kurių buvo užtepta suplakta alogeninių žiurkių epidermocitų suspensija, kurios koncentracija buvo 1,5 milijono ląstelių 1 ml (remiantis Citologijos instituto duomenimis). Batisto gabalėliai buvo uždėti ant nupoliruoto rando taip, kad ląstelės gulėtų ant rando paviršiaus. Ant viršaus buvo uždėtas kelių sluoksnių marlės tvarstis, kuris buvo prisiūtas prie rando kraštų.

Dalis gautos ląstelių suspensijos buvo pasėta į Petri lėkšteles ant sterilių „Polypore“ plėvelių, išpjautų pagal lėkštelių formą, kita dalis – ant Petri lėkštelių be plėvelės. Kultivavimas buvo atliktas FAD terpėje, sudarytoje iš DMEM ir F12 terpės mišinio santykiu 3:1, pridedant 10 % vaisiaus galvijų serumo, 5 μg/ml insulino („Sigma“), 0,5 μg/ml hidrokortizono hemisukcinato („Sigma“). 10 μg/ml epidermio augimo faktoriaus EGF (RAS Citologijos institutas, Sankt Peterburgas). Antroji ir trečioji žiurkių grupės, po 7 individus, buvo operuotos praėjus 6 dienoms po pirmosios. Iki to laiko iš pasėtų keratinocitų suspensijos Petri lėkštelėse susidarė daugiasluoksniai sluoksniai, kurie buvo persodinti žiurkėms. Antrajai grupei buvo persodinti epidermocitai ant plėvelės, trečiajai – daugiasluoksnis sluoksnis be substrato. Po 7 dienų gauti daugiasluoksniai alogeninių keratinocitų (MPALK) sluoksniai, pasėti ant „Polypore“ plėvelių, buvo persodinti kaip kultūra tiesiai ant žaizdos paviršiaus. Ant viršaus plėvelė, kad nenuplyštų, buvo pritvirtinta daugiasluoksniu marlės tvarsčiu ir prisiūta prie žiurkių odos.

Prieš persodinant keratinocitus trečiai žiurkių grupei, auginamai be substrato, PAC buvo atskirtas nuo Petri lėkštelės dugno, apdorojant jį dispaze, kuri pasižymi savybe selektyviai sutrikdyti odos ir epidermio ryšius. Veikdama daugiasluoksnį sluoksnį, dispazė sutrikdo bazinio sluoksnio ląstelių ryšį su Petri lėkštelės dugnu ir daro daug mažesnį poveikį tarpląsteliniams ryšiams, todėl sluoksnį galima visiškai „pašalinti“. Daugiasluoksnio ląstelių sluoksnio atskyrimas dispaze buvo atliktas taip. Transportavimo terpė buvo nusausinta iš Petri lėkštelių, ląstelių sluoksniai tris kartus plaunami maitinamąja terpe, kurioje yra antibiotikų, ypač gentamicino (0,2 mg/ml). Daugiasluoksniai sluoksniai buvo užpildyti 0,125 % dispazės tirpalu („Sigma“) ir patalpinti į termostatą, kur jie buvo inkubuojami 37 °C temperatūroje 20–30 minučių. Balto apvado, besilupančio palei sluoksnio periferiją, atsiradimas rodo jo atsiskyrimo nuo Petri lėkštelės kraštų ir dugno proceso pradžią. Praėjus kelioms minutėms nuo atskyrimo proceso pradžios, dispazės tirpalas buvo nusausintas, epitelio sluoksniai 2–3 kartus plaunami terpe. Ant epidermio sluoksnio paviršiaus buvo uždėtas sterilaus žaizdų tvarsčio „Lita-color“ gabalėlis, supjaustytas pagal puodelio dydį, prie kurio buvo priklijuotas dispaze atskirtas sluoksnis, papildomai mentele nuluptas nuo puodelio dugno. Pincetu sluoksnis kartu su servetėlės „Lita-color“ (Rusija) danga buvo nuplėštas nuo Petri lėkštelės dugno ir atsargiai perkeltas ant paruošto rando paviršiaus. Servetėlėse „Lita-color“ yra gentamicino ir eksolino (kolageno ekstrakto), kurie, sudrėkinti augimo terpės likučiais, o vėliau fiziologiniu tirpalu, išbrinko ir tapo moderniu žaizdų tvarsčiu, užtikrinančiu gerą apsaugą nuo išorinės infekcijos ir greitą gijimą dėl drėgmę sugeriančios struktūros.

Ant „Polypore“ plėvelių ir „Lita-color“ servetėlių buvo uždėti daugiasluoksniai marlės tvarsčiai ir prisiūti prie žiurkių odos, kad būtų tvirtiau pritvirtinti. Kiekviena žiurkė buvo patalpinta į atskirą narvelį, kad būtų sudarytos optimalios sąlygos ją išlaikyti ir persodintų keratinocitų prigijimui. Žiurkių, į kurias buvo persodinta suspensija ir daugiasluoksnis dispazės būdu pašalintų epidermocitų sluoksnis, tvarsčiai kelis kartus per dieną buvo sudrėkinti steriliu fiziologiniu tirpalu, kad būtų sudarytos palankiausios sąlygos ląstelių prigijimui. Atsižvelgiant į tai, kad „Polypore“ plėvelė buvo nepralaidi vandeniui, antros grupės žiurkių tvarsčiai nebuvo sudrėkinti, o tai buvo vienas iš pranašumų, palyginti su transplantacijomis be plėvelių. Tvarsčiai buvo pašalinti po 10 dienų. Klinikinis randų po ląstelių transplantacijos vaizdas mažai skyrėsi nuo randų be transplantacijos, išskyrus jų rausvesnę spalvą (dėl dermabrazijos) ir didesnį lupimąsi. Šis faktas rodo, kad iš karto po to, kai žaizdų tvarsčiai nukrito su MPC, rande pokyčių neatsirado.

Biopsijos medžiagos paėmimas iš žiurkių.

Praėjus 1, 2, 5 ir 9 mėnesiams po žiurkių alogeninių keratinocitų transplantacijos ant nupoliruotų baltų žiurkių randų, buvo paimta medžiaga histologiniam, citomorfologiniam ir elektronmikroskopiniam tyrimui. Kontroliniam mėginiui buvo paimti normalios žiurkių odos ir rando be ląstelių transplantacijos mėginiai. Žiurkių anestezija atlikta naudojant eterio anesteziją.

Po anestezijos iš pažymėtų vietų, į kurias 2 mm skersmens biopsijos punšu buvo persodinti keratinocitai, buvo paimti randinio audinio gabalėliai ir įdėti į 2,5 % glutaraldehido tirpalą, kad medžiaga būtų paruošta elektronmikroskopiniam tyrimui. Histologiniam tyrimui paimti audinio gabalėliai buvo įdėti į 10 % neutralų formalino tirpalą, po to perleisti per alkoholius ir įterpti į parafiną, po to išpjauti itin ploni pjūviai ir apžiūrėti šviesooptiniu mikroskopu.

Kontrolinė grupė I. Normali žiurkės oda.

Siekiant pamatyti skirtumą tarp normalios randų paveiktos žiurkės odos mikroskopinio vaizdo ir randų, susidariusių tam tikru metu po MPC transplantacijos, visuose šio tyrimo etapuose pateikiamos jų nuotraukos ir aprašymai.

Normalios odos epidermį sudaro 7–9 ląstelių sluoksniai. Raginis sluoksnis yra vidutinio storio. Kai kuriose vietose jį sudaro 6–8 raginių žvynų sluoksniai. Bazinį sluoksnį sudaro cilindrinės ląstelės su dideliais, lengvais, taisyklingos formos branduoliais ir keliais branduolėliais. Aiškiai išreikšti desmosominiai ryšiai tarp ląstelių ir su bazine membrana. Po aiškiai apibrėžta bazine membrana, kurios poepiderminiame sluoksnyje yra mažų ataugų, lygiagrečiai jai yra gležni kolageno ir elastino skaidulų pluoštai, tarp kurių yra pailgi fibroblastai – maži indai. Gilesniuose sluoksniuose skirtingomis kryptimis išsidėstę kolageno ir elastino skaidulų pluoštai. Tarp jų yra daug kraujagyslių su plonomis to paties kalibro sienelėmis, ląsteliniai elementai (fibroblastai, putliosios ląstelės, leukocitai). Daug plaukų folikulų, riebalinių liaukų.

2 kontrolė. Žiurkės randas, 2 mėnesių amžiaus.

Klinikinis vaizdas. Randai šviesiai rausvi, su lupimuosis, vietomis liko šašelių. Jų plotas sumažėjo dėl kolageno skaidulų susitraukimo ir tapo maždaug 3,0–3,5 cm ^. Odos ataugų nėra.

Mikroskopinis vaizdas. Epidermį sudaro 3–5 sulankstyti ląstelių sluoksniai, pavaizduoti apvaliomis bazinėmis ląstelėmis, viena subulatinių ląstelių eilė, 1–2 granuliuotų ląstelių eilės su keratohialino grūdeliais viršutiniame sluoksnyje, yra tarpląstelinės edemos sričių. Raginis sluoksnis netolygiai keičiasi nuo labai plono iki sustorėjusio. Rando raukšlės pastebimos dėl randinio audinio (susitraukimo). Raukšlės prasiskverbia į spenelių sluoksnį ir sukuria spenelių įspūdį. Epidermio ir dermos riba yra tiesi. Pamatinė membrana ne visur atsekama. Apatinėje poepiderminio sluoksnio dalyje ir gilesniuose sluoksniuose yra kraujagyslės su stora, atsilaisvinusia sienele, daugelis jų yra apleistos, su staze. Aplink kraujagysles kaupiasi makrofagai, fibroblastai. Makrofagai supa iš kapiliarų išsiskyrusius eritrocitus ir juos fagocituoja. Paviršiškesniuose sluoksniuose yra mažų kapiliarų. Po epidermiu kolageno skaidulos išsidėsčiusios laisvai. Gilesniame rando sluoksnyje yra šiurkštūs kolageno skaidulų pluoštai, tarp kurių yra daug fibroblastų.

Žiurkės randas praėjus mėnesiui po žiurkių keratinocitų transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randai yra rausvos spalvos, jų plotas sumažėjęs, ypač skersmuo, ir yra vidutiniškai 2,5–3 cm ². Nėra plaukų ir riebalinių liaukų.

Žiurkių, kurioms buvo persodintas MPaLK ant plėvelės ir MPaLK be substrato, medžiagos mikroskopinio tyrimo duomenys yra praktiškai identiški. Tačiau grynai techniškai dirbti su MPaLK be substrato yra daug sudėtingiau ir kruopščiau nei auginant MPaLK ant substrato, todėl toliau tyrinėdami keratinocitų transplantacijos į randus klausimą, kaip auginimo pagrindą („substratai“) naudojome daugiasluoksnę kambriką.

Mikroskopinis vaizdas. Pastebimas epidermio sustorėjimas iki 15–20 sluoksnių, beveik iki vidurio keratinocitai yra siauros, pailgos, vertikalios formos ir kompaktiškai išsidėstę. Bazalinės ląstelės išsidėsčiusios nelygia linija. Jų branduoliai šviesūs, dideli, apvalūs su vienu ar dviem branduolėliais, o tai rodo didelį sintetinį ir proliferacinį aktyvumą. Epidermio ir dermos riba yra tiesi. Dygliuotasis sluoksnis gerai išsivystęs, susideda iš 3–5 apvalių ląstelių sluoksnių, yra 2 branduolėlių ląstelės.

Iškart po pamatine membrana yra tankiai išsidėstę ploni kolageno skaidulų pluoštai, lygiagrečiai jiems yra daug apleistų kraujagyslių, gilesnės kolageno skaidulos yra šiurkštesnės, susirinkusios tankiuose pluoštuose. Daug didelių fibroblastų, putliųjų ląstelių (2-3 regėjimo lauke), makrofagų, leukocitų ir apleistų kraujagyslių, kurių sienelės atsilaisvinusios, aplink jas yra laisvai išsidėsčiusios kolageno skaidulos. Kai kuriuose induose yra stazė, susiformavusių elementų diapedezė. Aplink kraujagysles yra fibroblastų, pavienių limfocitų. Odos ataugų nėra.

Persodinus keratinocitų suspensiją ant nupoliruoto rando, mikroskopinis vaizdas skiriasi nuo ankstesnio. Daugumai gyvūnų epidermis yra plonas ir susideda iš 5–6 ląstelių sluoksnių. Apatinis sluoksnis susideda iš netaisyklingos, daugiakampės formos ląstelių su apvaliai netaisyklingos formos branduoliais. Poepiderminio sluoksnio būklė yra panaši į jo būklę gyvūnų grupėje be MPALK transplantacijos.

Šiuo atveju galime kalbėti arba apie ląstelių transplantaciją lydinčių procesų vėlavimą, arba apie didelį ląstelių, persodintų suspensijos pavidalu, netekimą. Todėl buvo padaryta išvada apie randų korekcijos persodinant keratinocitus suspensijos pavidalu netikslingumą.

Žiurkės randas praėjus 2 mėnesiams po žiurkių keratinocitų transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randas atrodo plonas ir gležnas. Vietomis stebimos lupimosi ir pleiskanojančios dėmės.

Mikroskopinis vaizdas. Raginis sluoksnis sustorėjęs, vietomis – hiperkeratozė. Epidermis sustorėjusi, susideda iš 12–20 ląstelių eilių. Epidermio ir dermos riba yra tiesi linija. Po epidermiu esančios plonos kolageno skaidulos išsidėsčiusios gana tankiai. Gilesniuose rando sluoksniuose jos susitelkusios dideliais šiurkščiais pluoštais. Poepiderminiame sluoksnyje atsiranda naujų kraujagyslių darinių. Apatiniuose randinio audinio sluoksniuose yra daug apleistų kraujagyslių, išsidėsčiusių lygiagrečiai epidermio paviršiui. Dideli fibroblastai tolygiai pasiskirstę rando storyje, yra milžiniškų, daugiašakių, daug makrofagų.

Žiurkės randas praėjus 5 mėnesiams po žiurkės epidermio ląstelių transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randas atrodo lygus, lygus, be lupimosi, yra pavienių plaukų, jų tankumas didesnis randų pakraštyje, o tai rodo nežymų plaukų folikulų įaugimą į randą ir naujų folikulų formavimąsi. Randų plotas toliau mažėja.

Mikroskopinis vaizdas. Epidermis vis dar storas (15–20 sluoksnių, kai kur iki 30), viršutiniuose sluoksniuose jis užpildytas keratohialino grūdeliais. Aiškiai matoma pamatinė membrana. Po ja laisvai guli kolageno skaidulos. Apatiniuose sluoksniuose kolagenas yra galingesnis ir tankesnis. Tarp kolageno pluoštų daug kapiliarų. Viršutiniuose sluoksniuose sumažėjo apleistų kraujagyslių skaičius. Epidermio ir dermos jungtis yra šiek tiek banguota. Kai kuriose vietose randiniame audinyje yra gilių epidermio išaugų. Tarp kolageno skaidulų matomos naujai susiformavusios kraujagyslės. Atsiranda pavieniai plaukų folikulai ir riebalinės liaukos.

Žiurkės randas praėjus 9 mėnesiams po žiurkės epidermio MPA ląstelių transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randai tapo žymiai mažesni, palyginti su ankstesniais laikotarpiais, jų plotas vidutiniškai yra apie 1,5–2,0 cm2 ^. Randai netolygiai padengti smulkiais plaukeliais, ypač periferijoje. Liko nedidelis smulkių plokštelių lupimasis.

Mikroskopinis paveikslėlis.

Epidermis tapo plonesnis, jį sudaro 6–8 ląstelių eilės, jo struktūra panaši į normalios žiurkės odos epidermį, tik ląstelių tankis yra 1 mm didesnis, o jos mažesnės. Bazinį sluoksnį sudaro mažos apvalios cilindrinės ląstelės. Bazinė membrana yra gerai išreikšta, aiškiai matomos hemidesmosomos. Pastebimas epidermio išaugų buvimas poepiderminiame sluoksnyje. Papiliarinis sluoksnis yra išreikštas per visą rando ilgį. Šie faktai rodo, kad iki to laiko persodintų keratinocitų sukibimas su pagrindiniu randiniu audiniu tapo daug stipresnis. Todėl randų priežiūra žmonėms po MPALK transplantacijos praėjus 9 mėnesiams po MPC transplantacijos gali būti tradicinė. Po epidermiu kolageno skaidulos yra plonesnės nei giliuose sluoksniuose. Atsirado daug kraujagyslių, ypač paviršinių. Didesnių kraujagyslių sienelės sustorėjo. Yra daug plaukų folikulų ir riebalinių liaukų. Mikroskopinis vaizdas primena odos audinį.

Eksperimentinio darbo rezultatai ir jų aptarimas.

Šio darbo metu ant dirbtinai sukurtų žiurkių odos randų po dermabrazijos operacijos buvo persodinti įvairių formų keratinocitai – ant žaizdų apdangalų, kaip suspensija ant batisto ir kaip daugiasluoksnis sluoksnis be substrato. Darbas buvo atliktas siekiant gauti morfologinių duomenų apie persodintų alogeninių keratinocitų poveikį randams, taip pat nustatyti optimalius transplantacijos variantus.

Nustatyta, kad visi trys transplantacijos metodai yra įmanomi, tačiau MPAK transplantacija be substrato yra labai daug darbo reikalaujanti procedūra, kurios metu MPAK gali būti pažeistas, o tai turi įtakos transplantacijos rezultatams. Be to, šis transplantacijos metodas neleidžia dirbti su dideliais paviršiais.

Keratinocitų suspensijos transplantacija yra daug ekonomiškesnis metodas, nereikalaujantis ilgalaikio ląstelių kultivavimo ir yra paprastas mūsų siūlomame variante, naudojant sterilius kambrinius ruošinius, kurių dydžiai atitinka randų dydį. Terapinio poveikio vėlavimas persodinant ląstelių suspensiją maždaug mėnesiu, palyginti su MPC ant žaizdos dangos, nėra reikšmingas dalykas, kai gydymo trukmė yra daug mėnesių. Yra žinoma, kad persodinus MPC nudegimų pacientams, odos struktūros transformacija vyksta palaipsniui ir per kelerius metus. Keratinocitų kultūros transplantacija ant žaizdų dangų yra patogiausias ir perspektyviausias metodas, bet taip pat ir žymiai brangesnis. Be to, šiuo metu reikia ieškoti pažangesnių dangų variantų, kurie turėtų būti lankstūs, higroskopiški, turėti bakteriostatinių arba baktericidinių savybių ir būti biologiškai neutralūs ląstelėms. Plėvelė „Polypor“ – tarpinė buitinės plėvelinės žaizdų dangos versija, nepaisant kai kurių trūkumų, leido mums eksperimentiškai ištirti žiurkių keratinocitų transplantaciją ant randų ir padaryti išvadas apie šios randų gydymo krypties veiksmingumą.

Autoriai, persodinę MPC ant nudegimų žaizdų, pastebėjo, kad per pirmąją savaitę po daugiasluoksnio keratinocitų sluoksnio persodinimo ant dezinfekuotų žaizdų epidermis sustorėjo ir susisluoksniavo. Visi epidermio sluoksniai buvo aiškiai matomi. Įdomu tai, kad ląstelių sluoksnių skaičius transplantatuose buvo 10–30 % didesnis nei odos biopsijose. Autoriai atkreipė dėmesį į keratohialino granulių atsiradimą 5-ą dieną po MPC transplantacijos, o pamatinės membranos ir hemidesmosomų – jau 3-ią dieną.

J.Rives ir kt. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM ir kt. (1998) nustatė, kad ankstyvosiose stadijose po MPC transplantacijos pacientams, turintiems pilno storio odos defektus po nudegimų, ryšys tarp dermos ir epidermio yra labai silpnas ir tiesus, spenelių sluoksnio nėra. Antrojo mėnesio pabaigoje pradeda formuotis negilūs speneliai ir odos ataugėliai, ryšys tarp dermos ir epidermio sustiprėja. Literatūros duomenys rodo, kad alogeninių keratinocitų transplantacija ant žaizdų nudegimų pacientams yra perspektyvus metodas. Nepaisant to, kad alogeninių keratinocitų atmetimas, anot skirtingų autorių, įvyksta per 10 dienų–3 mėnesius, jie vis dėlto atlieka savo vaidmenį gyjant žaizdos paviršiui, išskirdami augimo faktorius ir mechaniškai uždarydami defektą. Manoma, kad MPALC pasižymi sumažėjusiu antigeniniu aktyvumu, nes kultivuojant in vitro jie praranda Langerhanso ląsteles, todėl jie ilgą laiką gali egzistuoti recipiento organizme. Be to, alogeninė kultūra, gauta iš jaunų sveikų žmonių odos, turi nepalyginamai didesnį biologinį potencialą nei autologinė pacientų kultūra po traumos.

Pagrindinis mūsų tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti, ar alogeniniai keratinocitai įsitvirtins randuose ir kokie pokyčiai įvyks randiniame audinyje veikiant tokiam biologiškai aktyviam „žaizdos dangalui“. Teigiamo rezultato atveju sukurti efektyviausią ir mažiausiai darbo reikalaujančią technologiją šiai reabilitacijos medicinos sričiai.

Gauti duomenys daugeliu atžvilgių buvo panašūs į literatūros duomenis apie morfologinius pokyčius, atsirandančius žmogaus epidermyje po alogeninių keratinocitų transplantacijos į nudegimų žaizdas. Tačiau yra ir reikšmingų skirtumų, tiek morfologinio substrato, ant kurio atliekama transplantacija, tiek technologijos požiūriu. Taigi, pamatinės membranos ir odos bei epidermio jungčių (hemidesmosomų, spenelių) formavimosi procesas vyksta vėlesniame etape, palyginti su keratinocitų transplantacija į žaizdų paviršius be randinių pokyčių. Matyt, tai vyksta dėl prastesnės randinio audinio mitybos, palyginti su derma arba raumenų fascija. Randas, ypač senas, yra tankus jungiamasis audinys su labai mažu kraujagyslių skaičiumi, o nudegimo žaizdos dugnas yra granuliacinis audinys, gausus kraujagyslių. Taigi akivaizdu, kad sąlygos, kuriomis vyksta keratinocitų transplantacija ir prigijimas, yra visiškai skirtingos. Kuo labiau vaskuliarizuota ląstelių transplantacijos sritis, tuo lengvesnis jų prigijimo procesas. Iš šios postulato išplaukia išvada apie tai, kad pirmenybė teikiama darbui su jaunais randais, kuriuose jungiamasis audinys dar gana purus ir gausus kraujagyslių.

Atlikus šį eksperimentinį darbą, buvo įrodyta, kad:

1. MPALK transplantacija ant randų yra įmanoma.
2. Optimalus transplantacijos metodas yra keratinocitų transplantacija ant žaizdos dangos.
3. Rando paviršius turėtų būti poliruojamas chirurginiu lazeriniu dermabrazijos metodu arba Schumanno šlifuokliu.
4. Veikiant MPALK, rando poliruotas paviršius greitai epitelizuojasi.
5. Kuo geriau vaskuliarizuotas randinis audinys, tai yra, kuo jaunesnis randas, tuo geresni keratinocitų transplantacijos rezultatai.
6. Veikiant persodintiems keratinocitams, randinis audinys palaipsniui transformuojasi ir virsta į odą panašiu (laisvesniu randiniu audiniu su odos ataugomis).
7. Laipsniškas randinio audinio atsipalaidavimas, pradedant nuo poepiderminio sluoksnio. Pagerėja jo vaskuliarizacija, kolageno skaidulų pluoštai viršutinėje ir apatinėje rando dalyse išsidėstę laisviau nei randiniame audinyje be ląstelių transplantacijos. Atsiranda plaukų folikulai ir riebalinės liaukos. Epidermis, savo struktūra, praėjusi hipertrofijos fazę, artėja prie normalios odos epidermio.
8. Stebimi pokyčiai susiję su keratinocitų išskiriamais augimo faktoriais ir citokinais, kurie, gerindami randinio audinio trofizmą, skatina jo transformaciją iš šiurkščiojo skaidulinio audinio į puresnį audinį, o tai pagerina rando išvaizdą.

Taigi, remiantis šiuo tyrimu, galima daryti išvadą, kad persodinti keratinocitai teigiamai veikia randinį audinį, o tai gali turėti praktinės reikšmės pacientų, turinčių įvairių tipų randus, reabilitacijai.

Šis darbas su žiurkėmis taip pat leido mums suformuluoti reikalavimus žaizdų apdangalams, ant kurių auginami keratinocitai.

Žaizdų tvarsčiai turėtų būti:

• biologiškai suderinamas su ląstelėmis,
• kvėpuojantis,
• turi elastingą, formą formuojantį pagrindą,
• būti hidrofilinis,
• kaip vaistiniai priedai, sudėtyje yra antibakterinių vaistų ir antioksidantų, kurie nėra toksiški kultivuojamoms ląstelėms.

Biotechnologinio randų gydymo klinikiniai rezultatai.

Anksčiau N. Carver ir kt. (1993) nustatė, kad sandarūs tvarsčiai geriausiai skatina prisitvirtinimą prie žaizdos ir keratinocitų išgyvenimą, tačiau neleidžia susidaryti stratifikuotai (subrendusiai) epidermiui. Stratifikuotos epidermio formavimuisi būtina oro aplinka. Todėl, prisitvirtinus daugiasluoksniam sluoksniui, buvo siūloma po 7–10 dienų nuimti sandarų žaizdos tvarstį ir gydyti žaizdas sausais tvarsčiais arba vandenyje tirpiais tepalais. Galima teigti, kad „substrato“, ant kurio auginamos ląstelės, kokybė ir savybės yra labai svarbus ląstelinės medžiagos transplantacijos efektyvumo, taigi ir gydytojų darbo rezultatų, aspektas. Tačiau šiandien nėra idealaus žaizdų tvarsčio, nepaisant siūlomų variantų gausos (dirbtinė oda, neaustinis audinys iš karboksimetilceliuliozės, fibrino dangos, pusiau pralaidžios poliuretano plėvelės). Svarbus aspektas šiuo klausimu yra „substratų“ (specialių žaizdų dangų) kaina, nes jų didelė kaina padidina bendras biotechnologinio gydymo išlaidas.

Ląstelių technologijų efektyvumas iki šiol įrodytas, tačiau, deja, šios technologijos yra labai brangios, ypač šalyse, kuriose dar nėra įsitvirtinusi pramoninė ląstelių kompozicijų gamyba. Tačiau tokios šalys kaip Jungtinės Valstijos jau seniai sukūrė ląstelių medžiagos nudegimų transplantacijai gamybos pramonę. Visų pirma, bendrovė „BioSurface Technology Inc.“ nuo 1989 m. užaugino 37 000 daugiasluoksnių keratinocitų sluoksnių, kurie buvo panaudoti 240 pacientų gydymui 79 pasaulio šalyse (R. Odessey, 1992), o 1 cm2 ląstelių ^kultūros kainuoja apie 7–8 JAV dolerius.

Įvairių odos ligų ir problemų gydymo technologija turi nemažai skirtumų, tačiau bet koks ląstelių gydymas pagrįstas aukštos kokybės ląstelių medžiagos gavimu ir jos transplantacija.

Šis procesas susideda iš šių žingsnių:

• odos paėmimas iš aukų (arba iš donorų),
• odos atvartų transportavimas į biotechnologijų centrą,
• bazinio sluoksnio ląstelių izoliacija ir jų proliferacija,
• daugiasluoksnių keratinocitų sluoksnių (MLK) augimas.
• ląstelių kultūros transplantacija.

Pagrindinė daugiasluoksnių keratinocitų lakštų transplantacijos gydymo problema yra gyvybingų ląstelių poreikis visuose ląstelių transplantacijos etapuose. Odos gabalėliai autologinėms arba alogeninėms ląstelėms išskirti turėtų būti kuo plonesni, nes tokiu atveju juos lengviau atskirti mechaniniais ir fermentiniais metodais ir gauti gyvų ląstelių suspensiją kultivavimui. Juos galima gauti pjaustant dermatomu arba naudojant vokų, apyvarpės ir vidinio peties paviršiaus odą. Atsižvelgiant į tai, kad ląstelės yra jautrios halogenams (chlorui, jodui), vandenilio peroksidui, jų negalima naudoti apdorojant odą medžiagos surinkimo metu.

Kiekybinis ir kokybinis ląstelių išeiga iš odos transplantatų ir jų kultivavimo efektyvumas taip pat priklauso nuo donoro sveikatos būklės ir amžiaus. Be to, odos biopsijos turi būti kuo greičiau ir tinkamomis sąlygomis (aplinka, temperatūra) pristatytos į šiems tikslams sertifikuotą ir akredituotą laboratoriją.

Odos atvartų laikymui ir transportavimui galima naudoti Eagle terpę arba terpę 199 su 10 % galvijų serumo, DMEM terpę su 5 % vaisiaus galvijų serumo ir antibiotikus.

Citologijos laboratorijoje odos biopsija pirmiausia mechaniškai padalijama į mažus gabalėlius, o tada odos gabalėliai apdorojami naudojant fermentus: tripsiną, kolagenazę, dispazę ir kt.

Veikiant fermentams, desmosomos yra sunaikinamos, o keratinocitai išsiskiria į terpę atskirų ląstelių arba agregatų, sudarytų iš skirtingo ląstelių skaičiaus, pavidalu. Kultivavimui naudojami tik baziniai keratinocitai, kurie auginami specialiose terpėse termostatuose, kuriuose yra 5 % CO₂, Petri lėkštelėse arba kolbose, esant t = 37 °C temperatūrai. Jau po 48 valandų stebimas keratinocitų kolonijų susidarymas, kurios palaipsniui susilieja ir virsta monosluoksniu. Gavus pakankamą ląstelių skaičių, gauta suspensija pasėjama ant šiam tikslui paruoštų žaizdų tvarsčių ir dedama į Petri lėkšteles. Pirmiausia iš suspensijos suformuojamas monosluoksnis, o po to daugiasluoksnis keratinocitų sluoksnis. Keratinocitų kultivavimo proceso etapai schematiškai parodyti 12 paveiksle (33, 43, 54, 65).

Tinkamo transplantacijai daugiasluoksnio keratinocitų sluoksnio susidarymas paprastai trunka 7–10 dienų. Kartais šis laikotarpis būna ilgesnis, priklausomai nuo pirminės medžiagos kokybės (donoro amžiaus, sveikatos būklės, medžiagos surinkimo teisingumo, naudojamos terpės kokybės ir kt.). Jei daugiasluoksnis sluoksnis perauga, jo paviršiuje gali atsirasti ląstelių, kurioms būdingi transplantacijai netinkami apoptozės reiškiniai. Petri lėkštelės su jose ant žaizdų tvarsčių užaugintais daugiasluoksniais keratinocitų sluoksniais (MLK) į kliniką pristatomos specialiuose konteineriuose ne žemesnėje kaip +15 °C temperatūroje.

Modifikuotas Greeno metodas MPC auginimui

Savo darbe žaizdų dangai naudojome daugiasluoksnę kambriką, atsisakydami „Polypor“ plėvelių, su kuriomis pradėjome dirbti eksperimente su žiurkėmis. Taigi, ant iš anksto nuriebalintos ir sterilios kambrikos užauginome daugiasluoksnius keratinocitų sluoksnius, nors tai taip pat nėra optimalus žaizdų dangalas.

Klinikiniai tyrimai buvo atlikti su savanoriais laikantis būtinų etikos standartų: sutarties pasirašymas ir informuotas sutikimas.

1. Buvo naudojama paciento (autologinių) ir kaupiamų (alogeninių) keratinocitų kultūra.
2. Pacientų keratinocitai buvo gauti iš odos gabalėlio, nupjauto iš viršutinės rankų pusės.
3. Randų dermabrazijos operacija atlikta naudojant termokauterį, rotacinius diskus ir erbio lazerį.
4. Buvo sudarytos pacientų, turinčių normotrofinius, hipotrofinius ir hipertrofinius randus, grupės.

Technologinis procesas, skirtas ląstelių technologijai pritaikyti odos randų išvaizdai pagerinti, susidėjo iš šių etapų:

1. Pacientų atranka.
2. Gydymo esmės paaiškinimas, numatomų rezultatų gavimo laikas, sutarties pasirašymas ir informuotas sutikimas.
3. Pacientams 2-3 savaites prieš operaciją išrašykite selmevit po 1 tabletę 3 kartus per dieną, zinctheral po 1 tabletę 3 kartus per dieną.
4. Paimant 2,0 cm ilgio ir 0,7–1,0 cm pločio odos gabalėlį nuo vidinio peties paviršiaus, aukštai, beveik apatinėje pažasties srities dalyje, norint gauti autologinius keratinocitus.
5. Tais atvejais, kai pacientai atsisakė išskirti savo keratinocitus dėl galimo linijinio rando peties vidiniame paviršiuje, ląstelinė medžiaga buvo paimta iš ląstelių banko (alogeninių keratinocitų).
6. Keratinocitai buvo išskirti ir auginami laboratorijoje, sertifikuotoje tokio tipo darbams.
7. Gavus pakankamą MPC kiekį transplantacijai ant randų, klinikoje buvo paskirta operacijos diena, į kurią medžiaga buvo atvežta specialiuose induose Petri lėkštelėse.
8. Buvo atlikta rando dermabrazijos operacija, hemostazė, nupoliruotas paviršius nuplautas steriliu druskos tirpalu, išdžiovintas, po to MPC buvo persodintos ant jo ant sterilių kambrinių „ląstelių žemyn“. Tai yra, ląstelės, kurios buvo viršutinėje MPC dalyje, pasirodė esančios apatinėje, greta poliruoto paviršiaus.
9. Ant viršaus buvo uždėta sterili plėvelė, kuri prie odos pritvirtinta elastiniu tvarsčiu arba elastiniu „Omnifix“ pleistru. Vietoj plėvelės galima naudoti abejingus žaizdų tvarsčius, kurių sudėtyje yra silikono, pavyzdžiui, „Mepitel“, „Mepiform“, silikoninius gelio lakštus.

Po 5–7 dienų plėvelė arba silikoninė danga pašalinama. Iki to laiko visi keratinocitai turėtų būti nuskaitę ant poliruoto rando ir prisitvirtinę prie jo paviršiaus.

10. Drėgna aplinka, susidaranti po plėvele ir silikono danga, aktyviai prie to prisideda. Nuo šio taško ant rando likusią kambriką galima sudrėkinti kuriozinu arba chitozano geliu. Dėl to antrą dieną susidaro tanki plutelė, kurią paciento patogumui geriausia pritvirtinti elastingu, kvėpuojančiu pleistru, pavyzdžiui, „Omnifix“. Kvėpuojanti plutelė leidžia susiformavusiai epidermiui diferencijuotis ir virsti subrendusia.

Priklausomai nuo rando tipo ir šlifavimo gylio, tvarstis atmetamas po 8–10 dienų. Šiuo metu epidermyje yra 30–40 % daugiau ląstelių sluoksnių nei normalioje odoje. Pamatinė membrana nesusiformavusi. Sustorėjusios epidermio keratinocitai į randinį audinį išskiria daug biologiškai aktyvių molekulių.

Biotechnologinio randų gydymo sėkmė labai priklauso nuo priežiūros metodo pooperaciniu laikotarpiu. Ląstelių kultūros yra „švelnus“ žaizdų uždengimo būdas, ir ankstyvosiose stadijose po transplantacijos IPC galima lengvai nulupti nuo po jais esančių audinių. Todėl pacientams patariama atsargiai elgtis su randu po operacijos. 8–9 mėnesius netrinkite ir švelniai gydykite šaltu virintu vandeniu, kad nenuplėštumėte plonos, naujai susiformavusios epidermio, kuri neturi tvirto ryšio su po jais esančiais audiniais.

Pastaba.

Prieš operaciją ir dermabrazijos metu leidžiama naudoti halogenintus antiseptikus ir oksidatorius (jodopironą, suliodopironą, jodinolį, jodinatą, chlorheksidiną, vandenilio peroksidą), prieš ląstelių transplantaciją – griežtai draudžiama dėl jų citotoksinio poveikio. Metileno mėlynasis ir briliantinis žaliasis taip pat yra toksiški ląstelėms.

Siekiant išvengti infekcijos, ypač dirbant su hipertrofiniais randais, chirurginį lauką galima apdoroti neomicino sulfatu, polimiksinu arba gentamicinu. Jie neturi citotoksinio poveikio keratinocitams.

Dėl tokio gydymo pasiekiamas trigubas poveikis.

1. Rando paviršiaus išlyginimas.
2. Virš jo susidaro naujas, normalaus storio epidermio sluoksnis.
3. Randinio audinio transformacija į odą primenantį audinį dėl citokinų, augimo faktorių ir kitų biologiškai aktyvių molekulių, kurias išskiria persodintos ląstelės ir kurias stimuliuoja keratinocitai, fibroblastai ir makrofagai, veikimo.

Randas tampa mažiau pastebimas, elastingesnis, jame atsiranda porų ir vellusinių plaukų, o pigmentacija gali būti atkurta dėl melanocitų buvimo IPC.

Tačiau visi šie teigiami rando aspektai neatsiranda iš karto. Šiuo atžvilgiu būtina įspėti pacientus, kad randinio audinio transformacijos į odos audinį procesas vyksta lėtai, o optimalaus tokio gydymo rezultato galima tikėtis ne anksčiau kaip po 10–14 mėnesių. Iškart po tvarsčių atmetimo nupoliruoti paviršiai pasižymi ryškia polichromija, kuo ryškesnė, tuo gilesnis poliravimas. Mažiausia odos žala pastebima poliruojant normotrofinius randus erbio lazeriu. Randų ir aplinkinės odos spalva atsistato per 3–8 savaites. Nepaisant tokių atsargumo priemonių, kartais pasireiškia pooperacinė hiperpigmentacija, kuri gali išnykti savaime per kelis mėnesius.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]