Uodai su įmontuotu „genetiniu skydu“ sustabdo maliariją – užsikrėtimo rodiklis sumažėja 93 proc.

Atsparumo insekticidams įveikimas: kaip vieno geno modifikacija uoduose savaime dauginasi per kartas, praktiškai panaikindama maliarijos perdavimą nepakenkdama išgyvenimui.

Neseniai žurnale „Nature“ paskelbtame tyrime mokslininkų komanda ištyrė, ar fibrinogeno baltymo 1 (FREP1) glutamino 224 (Q224) alelis padaro Anopheles stephensi uodus atsparius Plasmodium infekcijai, įvertino su šiuo aleliu susijusias išgyvenimo išlaidas ir išbandė alelinio geno pavaros sistemą, skirtą šiai apsauginei mutacijai platinti populiacijose.

Būtinos sąlygos

2023 m. nuo maliarijos mirė apie 600 000 žmonių, daugiausia vaikų Užsachario Afrikoje ir Pietų Azijoje. Tradiciniai kontrolės metodai – tinkleliai nuo uodų, insekticidų gydymas, vaistai nuo maliarijos – praranda savo veiksmingumą dėl uodų ir parazitų atsparumo. Genų varymo technologijos, kurios skleidžia naudingus alelius uodų populiacijose, siūlo perspektyvų ir tvarų sprendimą.

FREP1 baltymas padeda parazitams prasiskverbti pro uodo vidurinę žarną, tačiau natūralus variantas Q224 gali užkirsti kelią infekcijai nepakenkiant uodo biologijai. Tikslas buvo ištirti, ar toks endogeninis alelis gali būti saugiai paskirstytas, siekiant sumažinti maliarijos perdavimą, kartu išsaugant uodo gyvybingumą.

Apie tyrimą

Naudojant CRISPR/Cas9, buvo sukurtos dvi Anopheles stephensi padermės, kurios skyrėsi tik 224-ąja FREP1 baltymo aminorūgštimi: laukinio tipo su leucinu (L224) ir potencialiai apsauginės padermės su glutaminu (Q224). Kreipianti RNR buvo nukreipta į introno sritį 126 bp prieš kodoną, leidžiančią homologišką rekombinaciją įterpiant fluorescencinę žymę (GFP arba RFP).

Tinkamumas buvo įvertintas pagal sparno ilgį, vaisingumą, kiaušinių išsiritimą, lėliukės išsiritimą, suaugėlių atsiradimą ir gyvenimo trukmę (Kaplano-Meierio išgyvenamumo analizė).

Vektorių kompetencija buvo nustatyta naudojant standartinį Plasmodium falciparum (žmogaus) ir Plasmodium berghei (graužikų) parazitų membraninį maitinimą, seilių liaukose nustatant oocistų ir sporozoitų skaičių.

Alelių pavaros sistemą sudarė kasetė su gRNR prieš L224 ir Cas9, kontroliuojama vasa promotoriaus. Alelių dažnis buvo stebimas naudojant fluorescencines žymes daugiacikliuose eksperimentuose (10 kartų). Genotipavimas atliktas naudojant PGR, Sangerio sekvenavimą ir NGS. Bajeso modeliavimas įvertino alelių konversiją, tinkamumo kaštus ir dinamiką laisvo poravimosi metu laboratorijoje.

Rezultatai

FREP1Q224 alelis nesukėlė reikšmingų išgyvenamumo nuostolių: sparnų ilgis, vaisingumas, išsiritimas, lėliukės virsmas ir suaugėlių išsiritimas buvo identiški FREP1L224 kontrolinei grupei. Nedideli patinų dydžio ir gyvenimo trukmės skirtumai neturėjo įtakos konkurencingumui. Neapdorotos FREP1Q224 patelės gyveno tiek pat ilgai, kiek ir kontrolinės grupės, o patelės po kraujo maitinimosi parodė tik nežymų gyvenimo trukmės sumažėjimą.

Iššūkio eksperimentai parodė ryškią apsaugą homozigotose.

• Esant mažoms P. falciparum gametocitų koncentracijoms (0,08 %):
  • FREP1Q224 tyrimo metu infekcijos dažnis sumažėjo nuo 80 % iki ~30 %;
  • Vidutinis oocistų skaičius: nuo 3 iki 0;
  • Sporozoitai seilių liaukose: nuo >4000 iki 0.
• Esant didesnei gametocitemijai (0,15 %):
  • Vidutinis oocistų skaičius: nuo ~32 iki
  • Sporozoitų taip pat smarkiai sumažėjo.
• P. berghei atveju:
  • Vidutinis oocistų skaičius: nuo 43 iki 25;
  • Sporozoitai: nuo ~19 000 iki 11 000.
• Heterozigotai (FREP1L224/Q224) nebuvo apsaugoti.

Genų pavaros efektyvumas

• Poriniuose kryžminimuose Cas9 + gRNR L224 50–86 % FREP1L224 alelių pavertė FREP1Q224;
• Su motinos Cas9 dažnis buvo didesnis;
• Antroje kartoje apsauginio alelio dažnis pasiekė 93%;
• NHEJ taisymo kelio klaidų dažnis buvo mažas (0–12 %) ir paprastai sukeldavo žalą.
• Ląstelių populiacijose, kurių donoro ir recipiento santykis yra 1:3, FREP1Q224 dažnis per 10 kartų padidėjo nuo 25 % iki > 90 %;
• NHEJ alelių dažnis sumažėjo nuo 5,4 % iki

Bajeso modeliavimas patvirtino didelės konversijos, mažo stabilių mutacijų dažnio ir letalaus sterilaus mozaicizmo efekto hipotezę, kai WT homozigotai su motinos Cas9 genotipu patyrė somatines mutacijas ir sumažino išgyvenamumą.

Vėlesnės kartos parodė beveik visišką P. falciparum oocistų slopinimą (mediana nuo 0 iki 5,5), o tai patvirtina, kad populiacija tapo iš esmės atspari parazitų perdavimui.

Apsauginis alelis neturėjo jokios paslėptos naudos ar šalutinio poveikio ir buvo platinamas per motyvaciją.

Išvados

Tyrimas parodė, kad pakeitus vieną aminorūgštį FREP1 baltyme ir pakeičiant jos paveldėjimą naudojant genų varomąją jėgą, Anopheles stephensi gali tapti praktiškai imunine nuo maliarijos – tiek žmonių, tiek graužikų – nepakenkiant uodų gyvybingumui.

Šis metodas papildo esamas priemones (tinklus, insekticidus, vaistus), kurių veiksmingumą mažina atsparumas. Tokia sistema taip pat gali būti naudojama jautrumui insekticidams atkurti arba kitiems apsauginiams aleliams įvesti.

Prieš įdiegiant technologiją, reikalingos griežtos aplinkosaugos, etikos ir valdymo sistemos, taip pat sklaidos kontrolės sistemos.