Alogeninių keratinocitų persodinimo ant dirbtinai sukurtų baltųjų žiurkių randų eksperimentinis darbas

Norint pasinaudoti ląstelių potencialu ir poreikiu ieškoti naujų veiksmingų būdų estetinės randų išvaizdos gerinimui, buvo siekiama bandyti ištirti keratinocitų transplantacijos į randų paviršių galimybę.

Siekiant įrodyti, kad naudojant keratinocitų kultūrą, siekiant pagerinti randų eksperimentinis darbas buvo atlikti su baltosiomis laboratorinėmis žiurkėmis, kurios buvo sukurtos randų paviršių išvaizdą galimybę. Surandėjimų modelis žiurkės buvo paruošti dirbtinai žaizdoms gydyti, atsiradusius dėl nugaros, išilgai stuburo. Žiurkės buvo gabalais tos pačios odos, dydis 2x3 cm. Po 2,5 mėn po operacijos "modeliavimas randai" žiurkėmis buvo atliktas Dermabrasion operacija (šalinimo iš viršutinių sluoksnių per ignioperation prieskrandyje) ir transplantuotų alogeninės keratinocitų, išskirtos iš odos jaunų žiurkių 2-4 dienas po gimimo.

Žiurkių epidermocitų išskyrimas ir augimas buvo atliktas laboratorijų korinių technologijų instituto Citologija anksčiau.

Oda buvo plaunamas Hank s fiziologinio tirpalo, kuriame yra 200 U / ml gentamicino, supjaustyti į mažus gabaliukus, kurio 0,2-0,5 cm srityje ². Vienetų odos inkubuoja 0,5% dispazės tirpalo subalansuotą fiziologinio tirpalo fosfato buferiniu tirpalu esant 37 ° C temperatūroje vieną valandą. Gabalai yra perkeliamas į fosfatinio buferio druskų tirpalu iš Dulbecco ir atskirtas epidermį nuo dermos. Epidermis buvo inkubuojami 0,125% tripsinu tirpalo 10-15 minučių maišant 50 min aps /, po kurio fermentas buvo stabdoma pridedant 5% vaisiaus jaučio serumo greičiu. Trečdalis gautą ląstelių suspensijos buvo grynos formos vienas iš variantų persodinti randus, antra trečia auginami vidaus biologiškai kino danga "Polipor", trečioji - ant Petri lėkštelę be pagrindo. Operacija dermabrasion gauti randai žiurkėms su tolesniu perdavimu į jų epidermotsitov žiurkės pagal eterio anesteziją buvo atliekama, naudojant termokauteris.

Pirmoji grupė žiurkių po dermabrasion dėl poliruotas, plaunamas fiziologiniu tirpalu ir išdžiovintas paviršius sterilios prieskrandžiai nubrėžtas vienetų veją, kuri buvo deponuota plakta Alogeniniai žiurkės epidermotsitov suspensiją 1,5 milijono ląstelių 1 ml koncentracijos (pagal Citologija instituto). Batistovye gabaliukai tinka poliruoto rando, kad ląstelės būtų ant rando paviršiaus. Viršutėje, kuris buvo prisiūtas prie rando kraštų, buvo siūtas kelių marlių sluoksnių tvarstis.

Dalis iš gautos ląstelių suspensijos Petri lėkštelėse buvo padengta steriliais "Polypore" filmais, supjaustytais puodelių formos, o kita - "Petri" induose be plėvelės. Auginimas buvo atliktas vidutinio FAD, sudarytas iš DMEM mišinio ir F12 terpe santykiu 3: 1. Papildytas 10% vaisiaus jaučio serumo, 5 ug / ml insulino (Sigma), 0,5mkg / ml hidrokortizono hemisukcinato (Sigma). 10 μg / ml epidermio augimo faktorius EGF (Citologijos institutas anksčiau, Sankt Peterburgas). Antroji ir trečioji žiurkių grupės su 7 asmenimis buvo praėję 6 dienas po pirmosios. Iki to laiko daugiasluoksniai sluoksniai buvo suformuoti iš pasėtos keratinocitų suspensijos Petri lėkštelėse, kurios buvo persodintos žiurkėms. Antra grupė buvo transplantuotas epidermotsitov ant plėvelės, trečioji - daugiasluoksnio pagrindo, nesusidarant. Po 7 dienų, susidarę daugiasluoksnės sluoksniai allogichnyh keratinocitų (MPAlK), pasėtos transplantuotų kultūrą tiesiai ant žaizdos paviršiaus "Polipor" filmų. Į viršų folija tam, kad išvengtų savo nulupamos daugiasluoksnės marlės buvo nustatyta, ir susiūti į žiurkių odos.

Prieš persodinti keratinocitų trečios grupės žiurkių, auginami be substrato, gaminti iš PAC atskyrimą iš Petri lėkštelės dispazės gydymo apačioje, turintys galimybę pasirinktinai pertrauka dermokosmetika-epidermio bendravimą. Pagal daugiasluoksnės rezervuaro dispazės veiksmų griauna bazinių ląstelių sluoksnio ryšį į Petri lėkštelę apačioje ir daug mažesniu mastu, kai ji daro įtaką tarpląstelinės komunikacijos, kuri leidžia "pašalinti" visą sluoksnį. Daugiasluoksnių ląstelių sluoksnio išsiskyrimas išdėstymu buvo atliktas taip. Iš Petri lėkštelės sumaišytas transportavimo terpėje, kad ląstelių lakštai tris kartus buvo plaunamos su terpe, turinčia antibiotikų, visų pirma - gentamicino (0,2 mg / ml). Daugiasluoksnės sluoksniai pilamas 0,125% dispazės tirpalo ( «Sigma») ir įdedamas į inkubatoriuje, kur jie buvo inkubuoti t = 37 ° C 20-30 minučių. Baltojo vainikėlis išvaizdą, lupimo aplink rezervuarą periferijoje - apie į atskyrimo jį nuo kraštų ir iš Petri lėkštelės apačioje proceso pradžioje rodiklis. Po kelių minučių po atskyrimo proceso pradžioje, dispazės tirpalas buvo ištuštinti 2-3 kartus epitelio sluoksniai plaunami terpėje. Dėl buvo taikomas iš epidermio sluoksnio paviršiaus, supjaustyti nustatyto dydžio puodelis gabalas sterilus Žaizdų tvarstomoji medžiaga "Leith-spalva, kuri yra suskaldoma atskirti dispazės išsidėstymą, toliau išsisluoksniavimui iš puodelio apačioje su mentele. Naudojant akių ligų pincetai sluoksnis kartu su servetėlę danga" Leith-spalvos "(Russian ) atskilo nuo Petri indo dugno ir atsargiai perkelti į paruošto paviršiaus randų. Servetėlės "Lita-spalva" yra savo sudėtimi ir gentamicino eksolin (kolageno ekstrakto), kuri, kai drėgna aplinka išlieka atauga ateityje Semas druskos tirpalas išpūstų ir tapo modernios žaizdų danga, kuri užtikrina gerą apsaugą nuo išorinio infekcijos ir greito gijimo dėl prasidedančio drėgnumą struktūrą.

Polyprop plėvelės ir Lita spalvos servetėlės buvo sluoksniuotos marlės tvarsčiais, kurie buvo susiuvami ant žiurkių odos, kad būtų ilgesnė fiksacija. Kiekviena žiurkė buvo pasodinta atskirame narvelyje, kad būtų sukurtos optimalios sąlygos jo priežiūrai ir transplantuotų keratinocitų įsisavinimui. Tvarsčiai žiurkės, kad persodinti sustabdymą ir daugiasluoksnė rezervuaras epidermotsitov shot dispazės, kiekvieną dieną kelis kartus per dieną, sudrėkintu steriliu fiziologiniu tirpalu sukurti palankiausias sąlygas ląsteles ir prigijimą. Atsižvelgiant į tai, kad filmas "Polypor" buvo nepralaidus vandeniui, antros grupės žiurkės nejaudino padažų, o tai buvo viena iš privalumų prieš transplantaciją be filmų. Po 10 dienų tvarsčiai buvo pašalinti. Klinikinis randų vaizdas po ląstelių transplantacijos labai skiriasi nuo randų be transplantacijos, išskyrus rožinę spalvą (dėl dermabrazijos) ir didesnį lupimą. Tai rodo tai. Kad iškart po žaizdų dangų išnykimo su IPC, burbulas nepakito.

Biopsijos medžiagos paėmimas žiurkėms.

Po to, kai 1, 2, 5 ir 9 mėnesių po transplantacijos keratinocitų dėl žiurkių allogichnyh žemės randai baltos žiurkės, atsižvelgiant pagamintą medžiagą histologinei, cytomorphological ir elektronų mikroskopu tyrimo. Kaip normalių žiurkės odos ir rando kontroliniai mėginiai buvo paimti be ląstelių transplantacijos. Žiurkių anestezija atliekama naudojant eterio anesteziją.

Po anestezijos, iš pažymėtų sričių, į kurią buvo transplantuoti keratinocitai, buvo 2 mm skersmens biopsija. Raugo audinio gabaliukai buvo paimti ir dedami 2,5% glutaraldehido tirpale, kad preparatas būtų paruoštas elektroninei mikroskopijai. Audinio gabalėliai, kurių buvo imtasi dėl histologinio tyrimo buvo dedamas 10% neutralus formalino tirpalu, po to per laidų alkoholių ir alsuoja parafinu, po pjovimo ir plono skyriuose ir peržiūrėti juos šviesos optinio mikroskopo.

Kontrolė I. Normali žiurkė.

Tam, kad pamatytumėte skirtumą tarp įprastos žiurkių odos su randomis ir randų, kurie tam tikru laiku buvo pasibaigę IPC transplantacijai, mikroskopinių vaizdų, visuose šio tyrimo etapuose buvo parodytos nuotraukos ir aprašymai.

Paprastos odos epidermis susideda iš 7-9 ląstelių sluoksnių. Raguotas sluoksnis vidutinio storio. Vietose jis susideda iš 6-8 raguotų skalių sluoksnių. Bazalinį sluoksnį sudaro cilindrinės formos ląstelės su dideliu šviesa, reguliariais branduoliais ir keletu branduolių. Aiškiai išreiškiamos desmosominės jungtys tarp ląstelių ir bazinės membranos. Pagal gerai apibrėžto pamatinės membranos, kuri turi smulkias išgaubų į subepidermal sluoksnio melo lygiagrečiai su švelnių ryšulius kolageno ir elastino pluoštų, įskaitant pailgos fibroblastų, mažų laivų. Gilesniuose sluoksniuose kolageno ir elastino skaidulų ryšuliai kyla skirtingomis kryptimis. Tarp jų yra daug laivų su plonomis sienelėmis tokio paties kalibro, ląstelinių elementų (fibroblastai, stiebo ląstelės, leukocitai). Daugelyje plaukų folikulų, riebalinių liaukų.

Kontrolė 2. Žiurkė 2 mėnesio senumo randas.

Klinikinis vaizdas. Randai yra šviesiai rausvos spalvos, su peiliu, vietose, kur liko kirmėlės. Jų plotas sumažėjo dėl kolageno skaidulų susitraukimo ir tapti maždaug 3,0-3,5 cm ^:. Odos priedai nėra.

Mikroskopinis vaizdas. Epidermis yra sudarytas iš 3-5 ląstelių sluoksnių, Plisuotos, atstovaujamą užapvalintais bazinių ląstelių, vienoje eilėje Subulate, 1-2 eilučių keratohyalin granulių su grūdelių viršutinio sluoksnio, yra porcijos ląstelėje edema. Ragenos sluoksnis yra nevienodai pakeistas nuo labai plona iki susiliejęs. Dėl skrandžio audinio (susitraukimo) yra skrandžio lupimasis. Sulaužos įsiskverbia į papiliarį sluoksnį ir suteikia papilių įspūdį. Riba tarp epidermio ir dermos yra tiesa. Bazinės membranos neįmanoma atsekti visur. Apatinėje epizodo ir gilesnių sluoksnių dalyje - indai su stora, atpalaiduota siena, daugybė apleistų, su staziniais reiškiniais. Aplink indus - makrofagų grupę, fibroblastus. Makrofagai supa eritrocitus, atsirandančius iš kapiliarų, ir fagocytize juos. Daugiau paviršiaus sluoksniuose - mažos kapiliarijos. Po epidermiu kolageno pluoštai yra laisvi. Giluminio burbuliuko sluoksnyje - šiurkščiavilnių kolageno skaidulų paketai, tarp kurių yra daug fibroblastų.

Žiurkės randai praeina per mėnesį po MPAl žiurkės žiurkės keratinocitų transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randus rožinės, jų plotas sumažėjo, ypač skersmens ir vidutinis 2,5-3 cm ². Plaukų ir riebalinių liaukų nėra.

Šie mikroskopinis tyrimas iš medžiaga, gauta iš žiurkių su perdavimo MPAlK MPAlK dėl filmo ir substrato be iš esmės tapačios. Tačiau techniškai, darbas su MPAlK nepalaikomo daug sunkiau ir sunkus, nei kai jie auginami MPAlK ant pagrindo, todėl tolesnis tyrimas Klausimą dėl persodinimo kertainotsitov randus mes naudojamas kaip auginimo ( "padėklo") sluoksniuotos vejos pagrindu.

Mikroskopinis vaizdas. Epidermio sustorėjimas yra 15-20 sluoksnių, beveik iki vidurio keratinocitai turi siaurą, pailgą, vertikalią ir kompaktišką struktūrą. Bazinės ląstelės yra išdėstytos netolygioje eilutėje. Jų branduoliai yra lengvi, dideli, apvalios su viena ar dviem nukleolėmis, o tai rodo jų didelį sintetinį ir proliferacinį aktyvumą. Riba tarp epidermio ir dermos yra tiesa. Tamsus sluoksnis yra gerai išvystytas, susideda iš 3-5 apvalios formos ląstelių sluoksnių, yra 2 nukleozės ląstelės.

Iškart po bazine membrana - tankiai išdėstyti ploni kolageno pluošto ryšiai, lygiagrečiai su jais daug tuščių indų, giliau kolageno skaidulos yra grubesnės, surenkamos tankiuose ryšuliuose. Daugelis didelių fibroblastų, stiebo ląstelių (2-3 regėjimo srityje), makrofagai, leukocitai ir tušti indai, kurių sienos yra atsilaisvinusios, aplink juos yra laisvai esančios kolageno skaidulos. Kai kuriuose laivuose - stazė, vienodų elementų diapedėzė. Aplink indus - fibroblastus, atskirus limfocitus. Odos priedai nėra.

Kai keratinocitų suspensija persodinama į poliruotą randą, mikroskopinis vaizdas skiriasi nuo ankstesnio. Daugumoje gyvūnų - epiderma yra plona, susideda iš 5-6 ląstelių sluoksnių. Apatinis sluoksnis susideda iš netaisyklingos, daugiakampės formos ląstelių, turinčių suapvalintą nereguliarios formos branduolį. Subepiderinio sluoksnio būklė yra tokia pat, kaip ir gyvūnų, kuriems nėra transplantacijos, grupės būklė.

Tokiu atveju galima kalbėti apie ląstelių transplantacijos metu vykstančių procesų delsimą arba didelį ląstelių, transplantuotų suspensijos, praradimą. Taigi padaryta išvada, kad keratinocitų transplantacijos randus korekcija suspensijos forma yra netinkama.

Žiurkės randai praėjus 2 mėnesiams po MPAl žiurkės žiurkės keratinocitų transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randas atrodo plonas, švelnus. Vietose yra ekzis, svarstyklės.

Mikroskopinės nuotraukos. Storis ragenos stora, vietose - hiperkeratozė. Epidermio sustingimas, jis susideda iš 12-20 eilučių ląstelių. Riba tarp epidermio ir dermos yra tiesa. Subtilaus kolageno skaidulos po epidermiu guli gana tvirtai. Gilesniuose skilvelių sluoksniuose jie renkami stambiuose dideliuose ryšuliuose. Subepideriniame sluoksnyje atsiranda nauja laivų formacija. Apatiniuose rando audinio sluoksniuose - daug tuščių indų, esančių lygiagrečiai epidermio paviršiui. Dideli fibroblastai yra tolygiai pasiskirstę burbulo storyje, yra milžiniški, daugiapakopiai, daug makrofagų.

Žiurkės randai praėjus 5 mėnesiams po žiurkių spermocitų transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Randų atrodo lygus, lygus, be odos šveitimas, yra vienas plaukas jų didesnio tankio dėl rando, kuris rodo krašto išaugę plaukų folikulus prieskrandyje ir naviku plaukų folikulus periferijoje. Randų plotai toliau mažėja.

Mikroskopinis vaizdas. Epidermis vis dar storas (15-20 sluoksnių, kartais iki 30) viršutiniuose sluoksniuose yra užpildytas keratogialin grūdais. Bazinė membrana yra aiškiai matoma. Po jos kolageno skaidulos lieka laisvos. Apatiniuose sluoksniuose kolagenas yra galingesnis ir storas. Tarp kolageno sijų yra daug kapiliarų .. Viršutiniuose sluoksniuose sumažėjo tuščių laivų skaičius. Epidermis ir dermis yra šiek tiek banguotos. Riebaliniame audinyje yra gilių epidermio išsiplėtimas. Tarp kolageno skaidulų matomi naujai suformuoti indai. Atsiranda atskiros plaukų folikulai ir riebalinių liaukų.

Žiurkės randai praėjus 9 mėnesiams po IPA žiurkių žiurkių žiurkių epidermocitų transplantacijos.

Klinikinis vaizdas. Riešutai tapo daug mažesni, palyginti su ankstesniais terminais, jų plotas vidutiniškai siekia 1,5-2,0 cm ². Randai yra nevienodai padengti ploni plaukai, ypač aplink periferiją. Mažoji smulkių plokščių mastelis yra išsaugotas.

Mikroskopinis vaizdas.

Epidermis tapo plonesnis, atstovaujamas iš 6-8 eilių ląstelių, primenančių įprastos žiurkės odos epidermio struktūrą, tik 1 mm ląstelių tankis. Didesni ir jie yra mažesni. Bazalo sluoksnis susideda iš nedidelių apvalios-cilindrinės formos ląstelių. Bazinė membrana yra gerai apibrėžta, hemidesmosomos yra aiškiai matomos. Pastebimas epidermio išsiplėtimas subepideriniame sluoksnyje. Papiliarinis sluoksnis išreiškiamas visą rando ilgį. Šie faktai rodo, kad per šį laikotarpį transplantuotų keratinocitų sukibimas su pagrindiniais burbuškės audiniais tapo žymiai stipresnis. Todėl tradicinis gali būti 9 mėnesių po IPK transplantacijos žmonių, sergančių MALC transplantacija, randus. Po epidermiu yra labiau subtilus kolageno skaidulas nei giliuose sluoksniuose. Buvo daug laivų, ypač paviršutiniškai. Didesniuose laivuose sienos susiteria. Plaukų folikulai ir riebalinės liaukos dideliais kiekiais. Mikroskopinis modelis primena odos audinį.

Eksperimentinio darbo rezultatai ir jų aptarimas.

Metu šiame darbe dirbtinių odos randų žiurkių po operacijos dermabrasion, persodintų keratinocitų įvairiose formah- dėl suvyniotų paviršių, kaip į Batystowy ir sluoksniuotos formavimo sustabdymo be substrato. Darbas buvo atliktas norint gauti morfologinius duomenis apie transplantacinių alogeninių keratinocitų poveikį randams, taip pat nustatyti optimalius transplantacijos variantus.

Nustatyta, kad visi trys transplantacijos metodai yra tikri, tačiau IPAA persodinimas be substrato yra labai sudėtinga procedūra, per kurią IPAC gali būti sužeista, o tai turi įtakos transplantacijos rezultatams. Be to, šis transplantacijos metodas neleidžia dirbti dideliuose paviršiuose.

Transplantacija keratinocitų pakaba - yra žymiai ekonomiškesnis metodas nereikalauja ilgą kultivavimą ląstelių ir paprasta šioje įgyvendinimo variante kontaktą naudojant sterilias Batystowy ruošinių, kurios matmenys yra atitikti randai vertės. Terapinio poveikio pertrauka ląstelių suspensijos persodinimo metu maždaug mėnesį, palyginti su MIC, esančia ant žaizdos dangos, nėra reikšmingas momentas, kai gydymo trukmė skaičiuojama daug mėnesių. Yra žinoma, kad IPC transplantacijos metu pacientams sudeginti, odos struktūros būklės transformacija pasireiškė palaipsniui ir kelerius metus. Keratinocitų kultūros transplantacija į žaizdų dangas yra pats patogiausias ir perspektyviausias būdas, tačiau taip pat yra daug brangesnis. Be to, šiandien reikalaujama, kad būtų ieškoma sudėtingesnių dangų, kurios turi būti plastikinės, higroskopinės, turi bakteriostatines arba baktericidines savybes ir būti biologiškai neutralios ląstelėms. Filmas "Polipor" - tarpinis variantas vidaus filmas žaizdos aprėptį, nepaisant kai kurių trūkumų, leido mums mokytis eksperimentiškai keratinocitų transplantacijos žiurkes ant randų ir daryti išvadas apie šios krypties traukos randai efektyvumą.

Autoriai, atliko persodinimo į TPK žaizdų sudegė, pažymėjo, kad per pirmąją savaitę po transplantacijos iš daugiasluoksnių rezervuaro keratinocitų prie žaizdos dezinfekuotas, epidermis sutirštės ir sluoksninės. Visi epidermio sluoksniai buvo gerai apibrėžti. Įdomu tai, kad transplantacijų ląstelių sluoksnių skaičius yra 10-30% didesnis nei odos biopsijos egzemplioriuose. Autoriai pastebėjo keratogialino granulių pasirodymą 5 dieną po MPA, bazinės membranos ir hemidesmosomų persodinimo jau trečią dieną.

J.Rives ir kt. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznecov ir kt., (1998) nustatė, kad per anksti laikotarpiams po transplantacijos KMT pacientai, sergantys polnosloynymi odos defektų po nudegimų, ryšių tarp dermos ir epidermio yra labai silpnas ir yra tiesi linija, spenelių sluoksnis nėra. Iki 2-ojo mėnesio pabaigoje prasideda negilių gumbuota ir odos priedų, bendravimo dermos ir epidermio formavimas tampa stipresnis. Literatūra duomenys govoryato persodinimo alogenines keratinocitų žaizdoms sudegė pacientus kaip perspektyvus metodas. Nepaisant to, kad alogeninių keratinocitų atmetimas įvyksta pateiktą įvairių autorių laikotarpiu nuo 10 dienų iki 3 mėnesių, tačiau jie turi vaidmenį žaizdos paviršiaus gijimą, atleidžiantis augimo faktorius ir mechaniškai uždarymo defektą. Manoma, kad MPAlK sumažino antigeno veiklą, nes kai kultūringas in vitro prarasti Langerhanso ląsteles, kurios leidžia jiems egzistuoti ilgą laiką gavėjo kūno. Be to, alogeninių kultūra kilęs iš sveikų jaunų žmonių odą turi daug didesnį biologinį potencialą negu autologinio kultūros pacientams po traumų.

Pagrindinis mūsų tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti, ar alogeninės keratinocitai išgyvens randus ir kokie bus rando audinio pokyčiai, veikiant tokios biologiškai aktyvios "žaizdos dangos". Esant teigiamam rezultatui, šioje reabilitacijos medicinos srityje išsiaiškinkite efektyviausias ir mažiausiai darbo reikalaujančias technologijas.

Daugelis mūsų gautų duomenų pasirodė esąs panašūs į literatūros duomenis apie morfologinius pokyčius žmogaus epidermyje po alogeninių keratinocitų perkėlimo deginant žaizdas. Tačiau yra didelių skirtumų, tiek morfologinio substrato, kuris yra persodintas, tiek technologijos požiūriu. Taip. Bazinės membranos ir odos ir epidermio jungčių (hemidesmosomos, papiliarės) formavimo procesas vyksta vėlesniu metu nei keratinocitų transplantacija į žaizdų paviršių, be randų pokyčių. Tai, atrodo, yra dėl blogos raugintų audinių maistingumo, palyginti su dermos arba raumenų faszija. Randas, ypač senas, yra tankus jungiamasis audinys su labai nedideliu kiekiu kraujagyslių, deginimo žaizdos dugnas yra granuliacinis audinys, turtingas kraujagyslėmis. Taigi akivaizdu, kad sąlygos, kuriomis keratinocitų transplantacija ir įsisavinimas vyksta, visiškai skiriasi. Kuo didesnis kraujagyslių ląstelių transplantacijos plotas, tuo lengviau juos apdoroti. Iš šio postulato yra išvada, kad pirmenybė teikiama darbui su jaunais randus, kurių jungiamasis audinys vis tiek yra laisvas ir turtingas kraujagysles.

Remiantis šiuo eksperimentiniu darbu įrodyta, kad:

1. Galimas MALK persodinimas randams. 
2. Optimalus transplantacijos metodas - keratinocitų transplantacija į žaizdos dangą.
3. Rando paviršius turi būti įžemintas, naudojant operatyvinę dermabraziją, naudojant Schumann'o lazerį arba pjoviklį.
4. Pagal MPALK įtaką, atsiranda greito epilepsija pilvo puvinio paviršiaus.
5. Geriau kraujagyslių randų audinys, tai yra, jaunesnis randas, tuo geriau keratinocitų transplantacijos rezultatai.
6. Razinis audinys, paveiktas transplantacinių keratinocitų, pamažu transformuojasi ir tampa odos pavidalu (labiau purus rando audinys su odos priedais).
7. Rudos audinio palaipsniui atpalaidavimas prasideda subepideriniu sluoksniu. Pagerina jo vaskuliarizaciją, kolageno skaidulų pluoštai viršutinėje ir apatinėje skilvelių dalyse yra švelnesni nei rando audinyje be ląstelių transplantacijos. Yra plaukų folikulai ir riebalinių liaukų. Epidermio struktūra, pasibaigus hipertrofijos fazei, artėja prie normalios odos epidermio.
8. Stebėti pokyčius yra susiję su keratinocitų išskiriami augimo faktoriai, citokinų, kad gerinančių Srauto rando audinio prisidėti prie jos transformacijos iš standaus fibrozinio audinio nepresuoti, kuri veda į randų gerinimo.

Taigi remiantis šiuo tyrimu galima daryti išvadą, kad transplantacinių keratinocitų teigiamas poveikis randų audiniui, kuris gali būti praktinės reikšmės pacientų, sergančių įvairiais randais, reabilitacijai.

Šis darbas su žiurkėmis leido suformuluoti reikalavimus. Prie žaizdų dangų, ant kurių auga keratinocitai.

Priekinės dangos turi būti:

• biologiškai suderinama su ląstelėmis,
• kvėpuojantis
• turėti elastingą formos formavimo bazę,
• būti hidrofiliniu
• kaip medicinos priedai yra antibakteriniai vaistai ir antioksidantai nėra toksiški kultivuojamoms ląstelėms.

Riebalų biotechnologinio gydymo klinikiniai rezultatai.

Anksčiau N. Carver ir kt. (1993) nustatė, kad okliuziniai tvarsčiai geriausiai tinka prikabinti prie žaizdų ir išgyventi keratinocitus, tačiau neleidžia formuoti stratifikuoto (subrendinto) epidermio. Norėdami formuoti stratifikuotą epidermį, būtina oro aplinka. Todėl, pritvirtinus daugiasluoksnį sluoksnį, po 7-10 metų buvo pasiūlyta okliuzinė žaizdų danga, skirta pašalinti ir atlikti žaizdas sausais tvarsčiais arba vandenyje tirpiais tepalais. Galima sakyti, kad "substrato", kuria auga ląstelės, kokybė ir savybės yra labai svarbios ląstelinės medžiagos transplantacijos veiksmingumui ir, atitinkamai, gydytojų darbo rezultatams. Tačiau šiandien nėra idealių žaizdų, nepaisant siūlomų galimybių gausos (dirbtinės odos, neaustinės karboksimetilceliuliozės, fibrino dangų, pusiau laidžios poliuretano plėvelės). Svarbus momentas šiuo klausimu yra "substratų" (specialių žaizdų dangų) kaina, nes jų didelė kaina padidina bendras biotechnologinio gydymo išlaidas.

Ląstelių technologijų iki šiol veiksmingumas įrodytas, bet, deja, šios technologijos yra labai brangios, ypač tose šalyse, kur nėra pramonės gamyba korinio kompozicijų. Vis dėlto tokios šalys kaip Jungtinės Valstijos jau seniai sukūrė ląstelinės medžiagos, skirtos nudegus transplantacijai, gamybą. Visų pirma, bendrovė BioSurface Technologijos Inc ", nuo 1989 m, iškėlė 37,000 laminuotas sluoksnius keratinocitų, kurie buvo naudojami 240 pacientų gydymui 79 šalių visame pasaulyje (R.Odessey, 1992) su 1 cm ² ląstelių kultūros kainuoja apie 7-8 JAV doleriai.

Skirtingų ligų ir odos problemų gydymo technologija turi keletą skirtumų, bet bet kurio gydymo su ląstelėmis pagrindas yra kokybiškos ląstelės medžiagos gamyba ir jo transplantacija.

Šis procesas susideda iš šių veiksmų:

• odos atranka nuo paveikto (ar donoro),
• odos dangtelių transportavimas į biotechnologijų centrą,
• pagrindinio sluoksnio ląstelių izoliavimas ir jų dauginimasis
• daugiasluoksnių keratinocitų sluoksnių (IPC) kaupimasis.
• ląstelių kultūrų transplantacija.

Pagrindinė problema, susijusi su daugiasluoksnių keratinocitų sluoksnių transplantacija, yra gyvybingų ląstelių poreikis visuose ląstelių transplantacijos etapuose. Odos gabalėliai, skirti izoliuoti autologines ar alogenines ląsteles, turėtų būti kuo plonesni, nes šiuo atveju juos lengviau atskirti mechaniniais ir fermentiniais metodais ir gauti gyvų ląstelių suspensiją augimui. Jų galima gauti nugarindami dermatomą arba naudodami akių vokų odą, apatinę dalį, vidinį peties kraštą. Atsižvelgiant į tai, kad ląstelės jautriai reaguoja į halogenus (chlorą, jodą), vandenilio peroksidą, jie negali būti naudojami odos gydymui medžiagos paėmimo metu.

Kiekybinis ir kokybinis ląstelių išaugimas iš odos transplantacijų ir jų auginimo veiksmingumas taip pat priklauso nuo donoro sveikatos būklės ir amžiaus. Be to, odos biopsijos bandiniai kuo greičiau ir tinkamomis sąlygomis (aplinka, temperatūra) pristatomi į sertifikuotą ir akredituotą laboratoriją.

Erelio terpė arba vidutinė 199, į kurią dedama 10% galvijų serumo, DMEM terpė, papildyta 5% vaisiaus gausu serumu ir antibiotikais, gali būti naudojama odos sluoksnių laikymui ir transportavimui.

Citologinėje laboratorijoje odos biopsija pirmiausia mechaniškai padalijama į mažus gabalėlius, o odos fragmentų apdorojimas atliekamas naudojant fermentus: tripsiną, kolagenazę, dispazę ir kt.

Pagal fermentų veikimą vyksta desmomozių sunaikinimas, o keratinocitai į terpę išleidžiami atskiromis ląstelėmis ar agregatais, susidedančiais iš skirtingo ląstelių skaičiaus. Kultūrai naudojami tik baziniai keratinocitai, kurie auginami specialioje terpėje inkubatoriuose, kuriuose yra 5% CO, Petri lėkštelėse arba buteliukuose esant t = 37 ° C. Per 48 valandas pastebimas keratinocitų kolonijų susidarymas, kuris palaipsniui susilygina į monosluoksnį. Gavus pakankamą ląstelių skaičių, susidariusios suspensijos išplaukia ant šiam tikslui paruoštų žaizdų dangų ir dedama į Petri indus. Iš suspensijos susidaro iš pradžių monosluoksnis, tada daugiasluoksnis keratinocitų sluoksnis. Schematiškai keratinocitų auginimo proceso etapai parodyti fig. 12 (33.43.54.65).

Daugiaplokščių keratinocitų susidarymas, tinkamas transplantacijai, susidaro paprastai 7-10 dienų. Kartais šis laikotarpis yra ilgesnis, priklausomai nuo šaltinio medžiagos kokybės (amžius, donorų sveikata, medžiagos teisingumas, naudojamos medijos kokybė ir kt.). Jei daugiasluoksnis sluoksnis perauga, ant jo paviršiaus gali būti ląstelės su apoptozės reiškiniais, netinkamais transplantacijai. "Petri" patiekalai, išauginti juose ant žaizdų dangų daugiasluoksniuose keratinocituose sluoksniuose (IPC), pristatomi į kliniką specialiose talpyklose ne žemesnėje nei + 15 ° C temperatūroje.

Modifikuotas "Green" metodas IPK auginimui

Mūsų darbe, kaip žaizdos dangoje, mes panaudojome daugiasluoksnę kamerą, palikdami poliprofilines plėveles, su kuriomis pradėjome dirbti eksperimente su žiurkėmis. Taigi, daugiasluoksniai keratinocitų sluoksniai buvo išauginti iš anksto riebalų ir sterilaus batisto, nors tai ir nėra optimali žaizdų danga.

Klinikiniai tyrimai atlikti su savanoriais, laikantis būtinų etikos normų: sutarties pasirašymas ir informuotas sutikimas.

1. Buvo panaudota savoji (autologinė) kultūra ir paimta iš banko ląstelių (alogeninių) keratinocitų.
2. Savos keratinocitos buvo gautos iš odos gabalo, išpjautos iš paciento peties.
3. Randų dermabrazijos operacija buvo atlikta termoizoliacine, rotacinio disko ir erbio lazerio pagalba.
4. Pacientų grupėje buvo normotrofiniai, hipotrofiniai ir hipertrofiniai randai.

Technologinis procesas, skirtas ląstelių technologijai pagerinti odos randų rūšį, buvo šie etapai:

1. Pacientų atranka.
2. Paaiškinti gydymo esmę, laukiamų rezultatų gavimo laiką, sutarties pasirašymą ir informuotą sutikimą.
3. Paskyrimas pacientams 2-3 savaites prieš operaciją selmevit iki 1t. 3 kartus per dieną, zinkteralas 1 t. 3 kartus per dieną.
4. Odos gabalo paėmimas 2,0 cm ilgio ir 0,7-1,0 cm pločio nuo vidinio peties krašto, aukštas, beveik paakių srities apačioje, siekiant gauti autologinių keratinocitų.
5. Jei pacientai atsisako izoliuoti savo keratinocitus dėl galimybės gauti tiesinį randą ant vidinio peties vidinio paviršiaus, ląstelinė medžiaga paimta iš ląstelių banko (alogeninės keratinocitos).
6. Keratinocitai buvo izoliuoti ir išauginti laboratorijos, patvirtintos tokio tipo darbui, sąlygomis.
7. Gavęs IPC, pakankamą transplantacijai, klinikoje randus buvo priskiriama operacijos diena, kai medžiaga buvo tiekiama specialiose talpyklose Petri lėkštelėse.
8. Dermabrasion operacija atliekama didžiojo prieskrandžio turinio hemostazės žemės paviršius buvo išplauti su steriliu fiziologiniu tirpalu, džiovinamas, po to ji transplantuotas steriliuose TPK Batystowy "ląstelių žemyn." Tai reiškia, kad ląstelės, kurios viršijo MIC, buvo mažesnės, greta poliruoto paviršiaus.
9. Ant viršaus buvo priklijuotas sterilus plėvelė, kuri buvo pritvirtinta prie odos elastine tvarsčiu arba Omnifix elastine juosta. Vietoje filmo gali būti naudojamos indiferencinės žaizdos dangos su silikonu, pavyzdžiui Mepitel, Mepiform, silikono gelio plokštės.

Po 5-7 dienų filmas arba silikono danga pašalinama. Iki to laiko visi keratinocitai turi nusileisti ant poliruoto rando ir pritvirtinti prie jo paviršiaus.

10. Šiai aplinkai aktyviai prisideda drėgmė, sukurta pagal plėvelę ir silikono dangą. Krikštytojas, likęs ant rando nuo šio taško, gali būti impregnuotas cirozės ar chitozano geliu. Dėl to 2-oji diena sukuria tankią plutą, kuri paciento patogumui geriau sureguliuoti elastingomis, oro pralaidomis tinku, pavyzdžiui Omnifix. Kvėpuojanti pluta leidžia naujai suformuotam epidermiui išsiskirti ir paversti brandą.

Priklausomai nuo rando tipo ir šlifavimo gylio, padažas atmetamas po 8-10 dienų. Šiuo metu epidermyje yra 30-40% daugiau ląstelių, nei įprastoje odoje. Bazinė membrana nesudaro. Tuščios epidermio keratinocitai išleidžia biologiškai aktyvių molekulių masę į randų audinį.

Riebalų biotechnologinio gydymo sėkmė daugiausia priklauso nuo to, kaip jie gydomi pooperaciniu laikotarpiu. Ląstelių kultūros yra "lengvas" rūšies žaizdų dangalas, o ankstyvuoju laikotarpiu po transplantacijos KMT gali būti lengvai atskirtas nuo pagrindinių audinių. Todėl pacientams patariama rūpintis randu po operacijos. 8-9 mėnesius neskubėkite ir lengvai dirbkite su šaltuoju virintu vandeniu, kad išvengtumėte plonos, naujai sukurtos epidermio, kuri nėra glaudžiai sujungta su pagrindiniais audiniais.

Pastaba:

Prieš operaciją ir Dermabrasion naudoti halogenintų oksidantų ir konservantų (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlorheksidino, vandenilio peroksidas) metu yra leistina iki persodinti kletok- visiškai negalima dėl jų citotoksinių poveikių. Toksiškos ląstelės taip pat yra metileno mėlynos spalvos. žalia žalia.

Norint išvengti infekcijos, ypač dirbant su hipertrofiniais randais, galima gydyti neomicino sulfatą, polimiksinus ar gentamiciną. Jie neturi citotoksinio poveikio keratinocitams.

Dėl šio gydymo pasiekiamas trigubas efektas.

1. Spalvos paviršiaus išlygiavimas.
2. Sukurkite virš jo sluoksnį naują epidermį, normalų storį.
3. Konversijos rando audinio dermopodobnuyu pagal citokinų, augimo faktorių ir kitų biologiškai aktyvių molekulių išskiriami transplantuotų ląstelių ir keratinocitų, stimuliuotų jų, fibroblastų ir makrofagų veiksmų.

Randas tampa mažiau pastebimas, daugiau elastingos, poros pasirodo, plaukai plaukai, pigmentacija gali būti atkurta dėl melanocitų buvimo MPC.

Tačiau visi šie teigiami momentai ryklėje nedings. Šiuo atžvilgiu būtina įspėti pacientus. Kad rando audinio transformacija į dermą yra lėta ir optimalius tokio gydymo rezultatus galima tikėtis ne anksčiau kaip 10-14 mėnesių. Iškart po to, kai padaisa atmetama, poliruoti paviršiai turi ryškų polichromą, tuo šviesesnis yra šlifavimo procesas. Mažiausiai žalos odai atsiranda, kai šlifuojasi normotrofiniai randai su erbio lazeriu. Razų ir aplinkinių odos spalva buvo atstatyta nuo 3 iki 8 savaičių. Nepaisant tokių atsargumo priemonių, kartais yra pooperacinė hiperpigmentacija, kuri gali trukti kelis mėnesius savarankiškai.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]