Nevirusinė genų terapija suteikia vilties gydyti lėtinį nugaros skausmą

Neseniai žurnale „Biomaterials“ paskelbtame tyrime tyrėjai sukūrė naują nevirusinę genų terapiją diskogeniniam nugaros skausmui (DAS) gydyti, in vivo į degeneracinius tarpslankstelinius diskus (DA) įvedant transkripcijos faktorių „Forkhead Box F1“ (FOXF1), naudojant sukonstruotas ekstraląstelines pūsleles (eEV).

Lėtinis juosmens skausmas (LBP) yra didėjanti pasaulinė problema dėl senėjančios populiacijos ir blogėjančių opioidų problemų. Dabartiniai gydymo būdai apima trumpalaikį palengvėjimą arba brangias operacijas, todėl reikia ne priklausomybę sukeliančių ir mažiau invazinių gydymo būdų.

Dabartiniai biologiniai metodai, įskaitant augimo faktorių skyrimą, ląstelių terapiją ir virusų genų terapiją, gali sumažinti degeneraciją gyvūnų ir žmonių modeliuose. Tačiau tokios problemos kaip trumpalaikis poveikis, prastas ilgalaikis veiksmingumas ir nereikalingas imunogeniškumas bei onkogeniškumas gali trukdyti tiesiogiai taikyti šiuos metodus.

Šiame tyrime tyrėjai sukūrė nevirusinę genų terapiją tarpslankstelinių diskų degeneracijai (IVD), naudodami FOXF1-eEV.

Tyrėjai transfekavos pirminius pelių embrioninius fibroblastus (PMEF) plazmidėmis, turinčiomis FOXF1 arba pCMV6, kaip kontrolę ir apibūdino eEV mėginius naudodami nanodalelių sekimo tyrimą (NTA).

Jie įvertino efektyvų molekulinio krovinio įkrovimą į eEV, naudodami kiekybinę atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją (qRT-PGR) ir įprastinę PGR. Western blot analizė nustatė FOXF1 ir EV specifinius baltymus eEV dariniuose. Komanda naudojo plazmides, kurios sustiprina viršutinį ir apatinį polilinkerio regionus, kad nustatytų FOXF1 plazmidės DNR buvimą donorinėse ląstelėse ir sugeneruotų eEV.

Jie ištyrė viso ilgio mRNR, gautą iš plazmidinės DNR eEV ir donorinėse ląstelėse.

Tyrėjai sukūrė ekstraląstelines pūsleles su transkripcijos faktoriais, kad atkurtų audinių funkciją ir pakeistų skausmo reakcijas DBP gyvūnų modelyje.

Jie nustatė EV, skirtus FOXF1 transportavimui ir paskirstymui į pažeistus tarpslankstelinius diskus diskogeninio nugaros skausmo pelių modelyje, siekdami nustatyti FOXF1 eEV slopinimą tarpslankstelinių diskų degeneracijai.

Komanda sujungė pelių tarpslankstelinių diskų biomechaninius tyrimus su vaizdiniais tyrimais, tarpląstelinės matricos (ECM) pokyčiais ir skausmo reakcijomis, įvertintomis po 12 savaičių, kad patvirtintų struktūros ir funkcijos pokyčius, taip pat skausmą, kuriuos sukėlė terapinė intervencija.

Priešoperaciniai ir pooperaciniai skausmo vertinimai apėmė mikrokompiuterinę tomografiją (mikro-KT), magnetinio rezonanso tomografiją (MRT), mechaninius tyrimus, Alcian mėlynojo (AB) ir picrosirius raudonojo (PSR) dažymą, dimetilmetileno mėlynojo testą ir imunohistochemiją (IHC).

Tyrime buvo naudojama chirurginė technika, kurios metu tyrėjai pelėms po oda skyrė buprenorfino ER, kad būtų galima kontroliuoti pooperacinį skausmą.

Komanda atliko elgesio vertinimus prieš operaciją ir kas dvi savaites nuo keturių iki dvylikos savaičių po operacijos, naudodama įvairius metodus, įskaitant atviro lauko testą, šaltos plokštės, uodegos pakabos ir vielos pakabos metodą.

Atviro lauko bandymu buvo vertinamas pelių spontaniškas aktyvumas; šaltų plokščių bandymais buvo matuojama terminė hiperalgezija; uodegos pakabos bandymais buvo matuojamas ašinis skausmas; o vielos pakabos bandymais buvo matuojamas stiprumas.

Praėjus dvylikai savaičių po operacijos, komanda išpreparavo gyvūnų juosmens slankstelius, naudodama šlaunikaulio nervų ir arterijų atsekamąjį tyrimą, kad nustatytų tarpslankstelinius diskus tarp L4 ir L5, L5 ir L6 bei L6 ir S1 tarpslankstelinio disko. Jie naudojo L5/L6 tarpslankstelinį disko tyrimą histologijai įvertinti ir glikozaminoglikanų (GAG) kiekiui nustatyti.

FOXF1 eEV žymiai sumažino skausmo reakcijas, tuo pačiu atkurdami IVD struktūrą ir funkciją, įskaitant pagerėjusį disko aukštį, audinių hidrataciją, proteoglikanų kiekį ir mechanines savybes.

Tyrime daugiausia dėmesio skirta FOXF1 pakrautų eEV išsiskyrimui iš pirminių fibroblastų, transfekuotų transkripcijos faktoriumi FOXF1. Kiekybinė RT PGR parodė reikšmingą FOXF1 mRNR transkripto lygio ir viso ilgio transkribuotos FOXF1 mRNR lygio padidėjimą, palyginti su pCMV6 transfekuotomis ląstelėmis.

FOXF1 eEV terapija gali sumažinti skausmo reakcijas juosmens disko punkcijos modelyje pelėms iki 12 savaičių. Pelių patelėms FOXF1 gydytoje grupėje traukulių trukmė buvo ilgesnė nei sužeistoje grupėje, ir ji truko mažiausiai 12 savaičių po gydymo.

FOXF1 eEV terapija in vivo pagerino IVD audinių hidrataciją ir ūgį sužeistiems ir degeneraciniams gyvūnams, išlaikant hidratacijos lygį ir IVD disko T2 svertinį vaizdo intensyvumą.

Vis dėlto komanda pastebėjo sumažėjusį disko aukštį sužeistiems gyvūnams ir gyvūnams, gydytiems pCMV6 eEV. Pelėms, gydytoms FOXF1 eEV, disko aukštis nesumažėjo praėjus 12 savaičių po gydymo. Lytis funkciniams rezultatams įtakos neturėjo.

FOXF1 eEV in vivo atkūrė pažeistų ir degeneravusių IVD mechaninę funkciją. Esant ašiniam įtempimui, FOXF1 eEV paveikti IVD parodė didesnį normalizuotą NZ standumą, palyginti su pažeistais IVD.

Valkšnumo sąlygomis pažeisti IVD parodė padidėjusius normalizuotus valkšnumo poslinkius, o tai rodo normalizuoto valkšnumo elastingumo standumo sumažėjimą.

Rezultatai rodo, kad GAG kiekio sumažinimas pažeistuose IVD padidina mechaninį lankstumą, tačiau eEV terapija apsaugo nuo glikozaminoglikanų praradimo ir vėlesnių mechaninės funkcijos pokyčių.

FOXF1 eEV sukėlė struktūrinius ir funkcinius IVD pokyčius, padidindami proteoglikanų ir GAG kiekį.

Tyrimo rezultatai parodė, kad vystymosi transkripcijos faktoriais prisotintos eEV gali gydyti skausmingas sąnarių ligas, tokias kaip DBP, šiuos transkripcijos faktorius į degeneracinius ir skausmingus sąnarius tiekdamos IVD būdu.

Ši strategija gali padėti sumažinti ligos sukeltus struktūrinius ir funkcinius sutrikimus ir reguliuoti skausmo reakcijas atsižvelgiant į lytį.

Tyrėjai taip pat rekomendavo naudoti vystymosi transkripcijos faktorius, tokius kaip FOXF1, siekiant in vivo pakeisti degeneracines NP ląsteles į proanabolinę būseną. Norint nustatyti jų terapinį veiksmingumą, reikia atlikti tolesnius tyrimus.