Nevirusinė genų terapija suteikia vilties dėl lėtinio nugaros skausmo

Neseniai atliktame tyrime, paskelbtame urnal Biomaterials, mokslininkai sukūrė naują nevirusinę genų terapiją, skirtą diskogeniniam nugaros skausmui (DBP) gydyti, naudojant transkripcijos faktorių Forkhead. Box F1 (FOXF1), naudojant in vivo sukurtas ekstraląstelines pūsleles (eEV) į degeneracinius tarpslankstelinius diskus (IVD).

Lėtinis nugaros skausmas (LBP) yra auganti pasaulinė problema, atsirandanti dėl visuomenės senėjimo ir didėjančių opioidų problemų. Dabartinis gydymas apima trumpalaikį palengvėjimą arba brangias operacijas, pabrėžiant priklausomybės nesukeliančio ir mažiau invazinio gydymo poreikį.

Dabartinės biologinės terapijos, įskaitant augimo faktoriaus skyrimą, ląstelių terapiją ir virusų genų terapiją, gali sumažinti gyvūnų ir žmonių modelių degeneraciją. Tačiau tokie rūpesčiai kaip trumpalaikis poveikis, prastas ilgalaikis veiksmingumas ir nereikalingas imunogeniškumas bei navikogeniškumas gali trukdyti tiesiogiai taikyti šiuos metodus.

Šiame tyrime mokslininkai sukūrė nevirusinę tarpslankstelinio disko degeneracijos (IVD) genų terapiją, naudodami FOXF1-eEV.

Tyrėjai transfekavo pirminius pelių embrioninius fibroblastus (PMEF) naudodami plazmidę, kurioje buvo FOXF1 arba pCMV6 kaip kontrolinę funkciją, ir apibūdino eEV mėginius naudodami nanodalelių sekimo tyrimą (NTA).

Jie įvertino efektyvų molekulinių krovinių pakrovimą į eEV naudojant kiekybinę atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją (qRT-PGR) ir įprastą PGR. Western blot analizė nustatė FOXF1 ir specifinius EV baltymus eEV formacijose. Komanda naudojo plazmides, kurios sustiprina prieš srovę ir pasroviui esančias polilinkerio sritis, kad nustatytų FOXF1 plazmidės DNR buvimą donoro ląstelėse ir sukurtų eEV.

Jie ištyrė viso ilgio mRNR, pagamintą iš plazmidės DNR eEV ir donoro ląstelėse.

Tyrėjai sukūrė tarpląstelines pūsleles su transkripcijos faktoriais, kad atkurtų audinių funkciją ir pakeistų skausmo reakcijas DBP gyvūnų modelyje.

Jie nustatė EV, skirtus FOXF1 transportuoti ir paskirstyti pažeistiems tarpslanksteliniams diskams, naudojant diskogeninio nugaros skausmo pelės modelį, kad nustatytų FOXF1 eEV tarpslankstelinio disko degeneracijos slopinimą.

Komanda derino pelių tarpslankstelinių diskų biomechaninius tyrimus su vaizdavimu, ekstraląstelinės matricos (ECM) pokyčiais ir skausmo atsaku, įvertintu po 12 savaičių, kad patvirtintų struktūros ir funkcijos pokyčius, taip pat terapinės intervencijos sukeltą skausmą.

Skausmo vertinimas prieš operaciją ir po gydymo apėmė mikrokompiuterinę tomografiją (mikro-KT), magnetinio rezonanso tomografiją (MRT), mechaninius tyrimus, Alciano mėlynojo (AB) ir pikrozirijaus raudonojo (PSR) dažymą, dimetilmetileno mėlynojo bandymą ir imunohistochemiją (IHC). )).

Tyrimas apėmė chirurginį metodą, kai tyrėjai suleido Buprenorphine ER po oda pelėms, kad sumažintų pooperacinį skausmą.

Komanda atliko elgesio vertinimus prieš operaciją ir kas dvi savaites nuo keturių iki dvylikos savaičių po operacijos, naudodama įvairius metodus, pvz., atviro lauko bandymą, šaltą plokštę, uodegos pakabą ir vielinę pakabą.

Atviro lauko bandymas įvertino spontanišką pelių aktyvumą; šaltosios plokštelės bandymai, išmatuota šiluminė hiperalgezija; Uodegos pakabos testai matavo ašinį skausmą; ir vielos pakabos bandymais išmatuotas stiprumas.

Praėjus dvylikai savaičių po operacijos, komanda išpjaustė gyvūnų juosmenines stuburas, naudodama šlaunikaulio nervo ir arterijų pėdsaką, kad nustatytų tarpslankstelinius diskus tarp L4 ir L5, L5 ir L6 bei L6 ir S1 IVD. Jie naudojo L5 / L6 IVD histologijai įvertinti ir glikozaminoglikano (GAG) kiekiui nustatyti.

FOXF1 eEV žymiai sumažino skausmo reakciją, atkurdami IVD struktūrą ir funkciją, įskaitant disko aukščio, audinių hidratacijos, proteoglikanų kiekio ir mechaninių savybių pagerinimą.

Tyrimas buvo skirtas FOXF1 pakrautų eEV išsiskyrimui iš pirminių fibroblastų, transfekuotų FOXF1 transkripcijos faktoriumi. Kiekybinė RT PGR parodė reikšmingą FOXF1 mRNR transkripto ir viso ilgio transkribuotos FOXF1 mRNR lygio padidėjimą, palyginti su ląstelėmis, transfekuotomis pCMV6.

FOXF1 eEV terapija gali sumažinti skausmo atsaką naudojant juosmens disko punkcijų pelės modelį iki 12 savaičių. Pelių patelių gavimo laikas FOXF1 gydytoje grupėje buvo ilgesnis nei pažeistoje grupėje, kuris truko mažiausiai 12 savaičių po gydymo.

FOXF1 eEV terapija pagerino sužeistų ir degeneracinių gyvūnų hidrataciją ir IVD audinių aukštį in vivo, išlaikant hidratacijos lygį ir pagal T2 svertinį IVD vaizdo intensyvumą.

Tačiau komanda pastebėjo disko aukščio sumažėjimą sužeistiems gyvūnams ir gyvūnams, gydytiems pCMV6 eEV. Pelėms, gydomoms FOXF1 eEV, disko aukštis nesumažėjo praėjus 12 savaičių po gydymo. Lytis neturėjo įtakos funkciniams rezultatams.

FOXF1 eEV atkūrė pažeistų ir išsigimusių IVD mechaninę funkciją in vivo. Esant ašiniam įtempimui, FOXF1 eEV apdorotų IVD buvo didesnis normalizuotas NZ standumas, palyginti su pažeistais IVD.

Valkšnumo sąlygomis pažeisti IVD padidino normalizuotą valkšnumo poslinkį, o tai rodo, kad normalizuotas valkšnumo elastinis standumas sumažėjo.

Rezultatai rodo, kad sumažinus GAG kiekį pažeistose IVD, padidėja mechaninis lankstumas, tačiau eEV terapija apsaugo nuo glikozaminoglikano praradimo ir vėlesnių mechaninių funkcijų pokyčių.

FOXF1 eEV sukėlė struktūrinius ir funkcinius IVD pokyčius, padidindami proteoglikanų ir GAG kiekį.

Tyrimo rezultatai parodė, kad eEV, pakrautas su vystymosi transkripcijos faktoriais, gali gydyti skausmingas sąnarių ligas, pvz., DBP, tiekdamas šiuos transkripcijos veiksnius į degeneracinius ir skausmingus IVD sąnarius.

Ši strategija gali padėti sumažinti ligos sukeltus struktūrinius ir funkcinius sutrikimus, taip pat reguliuoti su lytimi susijusias skausmo reakcijas.

Tyrėjai taip pat rekomendavo naudoti vystymosi transkripcijos faktorius, tokius kaip FOXF1, kad degeneracines NP ląsteles paverstų proanaboline būsena in vivo. Norint nustatyti jo terapinį efektyvumą, reikia atlikti tolesnius tyrimus.