Kristalinių nuosėdų vaidmuo osteoartrito patogenezėje

Bazinio kalcio fosfato (BCP) kristalai randami 30–60 % pacientų, sergančių osteoartritu, sinoviniame skystyje. Pasak A. Swan ir kt. (1994), kalcio turinčių kristalų sinoviniame skystyje randama daug didesniam skaičiui pacientų, sergančių osteoartritu; tačiau dėl itin mažo kristalų dydžio arba jų mažo skaičiaus jie nėra identifikuojami naudojant įprastus metodus. BCP kristalų buvimas sinoviniame skystyje koreliuoja su sąnarinės kremzlės degeneracijos radiologiniais požymiais ir yra susijęs su didesniu išsiliejimo tūriu, palyginti su išsiliejimu kelio sąnariuose be kristalų. Rentgenografinę gonartrozės progresavimą įtakojančių veiksnių tyrimas parodė, kad kalcio pirofosfato dihidrato (CPPD) kristalų nusėdimas yra nepalankaus klinikinio ir radiologinio rezultato prognozavimo veiksnys. Tyrime su vyresnio amžiaus pacientais nustatyta, kad osteoartritas yra susijęs su chondrokalcinoze, ypač kelio sąnario šoninėje blauzdikaulio-šlaunikaulio dalyje ir pirmuosiuose trijuose delnakalanginiuose sąnariuose. Neretai pacientams, sergantiems osteoartritu, randami abiejų tipų kristalai – OFC ir PFC.

Kliniškai sąnarinės kremzlės degeneracija, kurią sukelia kalcio kristalų nusėdimas, skiriasi nuo pirminės osteoartrozės. Jei kristalai būtų paprastas kremzlės degeneracijos epifenomenas, jie būtų randami sąnariuose, kuriuos dažniausiai pažeidžia pirminė osteoartrozė, t. y. kelių, klubų ir mažų rankų sąnariuose. Priešingai, kristalų nusėdimo ligos dažniausiai pažeidžia sąnarius, kurie nėra būdingi pirminei osteoartritui, tokius kaip petys, riešas ir alkūnė. Kristalų buvimas sąnario (efuziniame) skystyje yra susijęs su sunkesne sąnarinės kremzlės degeneracija. Diskutuojama apie tai, kas yra priežastis, o kas – pasekmė – kristalų nusėdimas ar kremzlės degeneracija. Tarpinę poziciją užima ši prielaida: pirminė kremzlės metabolizmo anomalija lemia jos degeneraciją, o antrinis kristalų nusėdimas pagreitina jos degradaciją (vadinamoji amplifikacijos kilpos teorija).

Tikslus mechanizmas, kuriuo kalcio kristalai pažeidžia sąnarinę kremzlę, nežinomas ir pateikiamas toliau. Teoriškai kalcio kristalai gali tiesiogiai pažeisti chondrocitus. Tačiau histologinio tyrimo metu retai aptinkami kristalai šalia chondrocitų, o dar rečiau jie juos praryja. Labiausiai tikėtinas mechanizmas yra kristalų fagocitozė, kurią atlieka sinovijos gleivinės ląstelės, po kurios išsiskiria proteolitiniai fermentai arba citokinai, stimuliuojantys chondrocitų fermentų išsiskyrimą. Šią koncepciją patvirtina tyrimas apie PFKD sukelto sinovito vaidmenį sparčiai progresuojančio osteoartrito vystymesi sergant pirofosfato artropatija. Šiame tyrime kalcio pirofosfato dihidrato kristalai (1 arba 10 mg) buvo suleidžiami kas savaitę į dešinįjį kelį triušiams, kuriems osteoartritas buvo sukeltas dalinės šoninės meniskektomijos. Paaiškėjo, kad po 8 injekcijų dešiniajame kelio sąnaryje buvo pastebėti žymiai rimtesni pokyčiai, palyginti su kairiuoju. Sinovijos uždegimo intensyvumas koreliavo su kalcio pirofosfato dihidrato kristalų intrasąnarinėmis injekcijomis ir jų doze. Nepaisant to, kad šiame tyrime naudotos CPPD kristalų dozės viršija in vivo dozes, rezultatai rodo CPPD sukelto uždegimo vaidmenį osteoartrito progresavime pirofosfatinės artropatijos atveju.

Galimi sąnarinės kremzlės pažeidimo, kurį sukelia kalcio turintys kristalai, mechanizmai yra susiję su jų mitogeninėmis savybėmis, gebėjimu indukuoti MMP ir stimuliuoti prostaglandinų sintezę.

Kalcio turinčių kristalų mitogeninis poveikis. Esant su kristalais susijusioms artropatijoms, dažnai stebima sinovinio dangalo ląstelių proliferacija, o patys kristalai yra tik iš dalies atsakingi už šį procesą. Sinovinio dangalo ląstelių skaičiaus padidėjimą lydi padidėjusi citokinų sekrecija, kurie skatina chondrolizę ir indukuoja proteolitinių fermentų sekreciją. OFC kristalai, kurių koncentracijos randamos žmogaus sąnarių patologijoje, nuo dozės priklausomai stimuliuoja ramybės būsenos odos fibroblastų kultūrų ir šunų bei pelių sinovinio dangalo fibroblastų mitogenezę. Kalcio pirofosfato dihidrato, urato, sulfato, karbonato ir kalcio fosfato kristalai stimuliuoja ląstelių augimą. Šių kristalų sukelto ( ^3H )-timidino įsisavinimo pradžia ir pikas yra 3 valandomis vėliau, palyginti su ląstelių stimuliacija kraujo serumu. Šis laikotarpis gali būti būtinas fagocitozei ir kristalų ištirpimui. Kontrolinių to paties dydžio kristalų (pvz., deimantų dulkių arba latekso dalelių) pridėjimas mitogenezės nestimuliavo. Natrio urato monohidrato kristalai turėjo silpnas mitogenines savybes ir buvo žymiai prastesnės nei kalcio urato, o tai rodo kristalų kalcio kiekio svarbą mitogenezėje. Sintetiniai OFC kristalai pasižymėjo tomis pačiomis mitogeninėmis savybėmis kaip ir kristalai, gauti iš pacientų, sergančių chondrokalcinoze. Kalcio turinčių kristalų mitogeninis poveikis nebuvo susijęs su padidėjusiu kalcio kiekiu juos supančioje maitinamojoje terpėje in vitro, nes bazinių kalcio fosfato kristalų ištirpimas maitinamojoje terpėje neskatino ( ^3H )-timidino įsitraukimo fibroblastų pagalba.

Vienas iš siūlomų OFC sukeltos mitogenezės mechanizmų yra tas, kad nenormali sinovinė ląstelių proliferacija gali būti bent iš dalies susijusi su endocitoze ir kristalų tirpimu ląstelėse, kuris padidina citoplazminę Ca2 ⁺ koncentraciją ir aktyvuoja kalcio priklausomą kelią, vedantį į mitogenezę. Šią koncepciją patvirtina tiesioginio ląstelių ir kristalų kontakto poreikis mitogenezei stimuliuoti, nes ląstelių kultūrų veikimas kristalais skatino ląstelių augimą, o ląstelių, kurioms toks kontaktas nebuvo paveiktas, veikimas to nepadarė. Norint ištirti kristalų fagocitozės poreikį po ląstelių ir kristalų sąveikos, ląstelės buvo kultivuojamos su ^45Ca -OPC ir ( ^3H )-timidinu. Nustatyta, kad ląstelės, turinčios ^45Ca -OPC, įtraukė žymiai daugiau ( ^3H )-timidino nei ląstelės be bazinio kalcio fosfato žymėjimo. Makrofagų kultūrose kristalų endocitozės slopinimas citochalazinu lėmė kristalų tirpimo slopinimą, dar labiau pabrėžiant fagocitozės būtinybę.

Kalcio turintys kristalai tirpsta rūgštyje. Po fagocitozės kristalai ištirpsta rūgštinėje makrofagų fagolizosomų aplinkoje. Chlorokvinas, amonio chloridas, bafilomicinas A1 ir visi lizosomotrofiniai agentai, kurie didina lizosomų pH, priklausomai nuo dozės, slopina tarpląstelinį kristalų tirpimą ir (3H)-timidino įsisavinimą ^{fibroblastuose}, kultivuojamuose su baziniais kalcio fosfato kristalais.

OFC kristalų pridėjimas į monosluoksninę fibroblastų kultūrą sukėlė staigų dešimteriopą tarpląstelinio kalcio kiekio padidėjimą, kuris po 8 min. grįžo į pradinį lygį. Kalcio šaltinis daugiausia buvo tarpląsteliniai jonai, nes baziniai kalcio fosfato kristalai buvo dedami į kalcio neturinčią terpę. Kitas tarpląstelinio kalcio koncentracijos padidėjimas buvo pastebėtas po 60 min. ir truko mažiausiai 3 val. Čia kalcio šaltinis buvo fagocituoti kristalai, ištirpinti fagolizosomose.

Nustatyta, kad OFC kristalų mitogeninis poveikis yra panašus į PDGF, kaip augimo faktoriaus, poveikį; kaip ir pastarasis, OFC kristalai pasižymi sinergizmu su IGF-1 ir kraujo plazma. IGF-1 blokada sumažina ląstelių mitogenezę, reaguojant į OFC. PG Mitchell ir kt. (1989) parodė, kad mitogenezės indukcijai Balb/c- ₃ T3 fibroblastuose OFC _kristalais reikalingas serino/treonino baltymų kinazės C (PKC) buvimas – vienas iš pagrindinių signalų, generuojamų išorinės ląstelių stimuliacijos hormonais, neurotransmiteriais ir augimo faktoriais metu, tarpininkų. PKC aktyvumo sumažėjimas Balb/c-3 T3 ląstelėse _slopinaOFC tarpininkaujamą protoonkogenų c-fos ir c-myc indukciją, tačiau neturi įtakos šių onkogenų stimuliacijai, kurią tarpininkauja PDGF.

Ląstelės viduje esančio kalcio padidėjimas ištirpus fagocituotiems kristalams nėra vienintelis mitogenezės signalizacijos kelias. Kai augimo faktoriai, tokie kaip PDGF, prisijungia prie savo membranos receptoriaus, stimuliuojama fosfolipazė C (fosfodiesterazė), kuri hidrolizuoja fosfatidilinozitolio 4,5-bisfosfatą ir sudaro ląstelės viduje esančius pasiuntinius inozitolio-3-fosfatą ir diacilglicerolį. Pirmasis išskiria kalcį iš endoplazminio tinklo, moduliuodamas nuo kalcio priklausomų ir nuo kalcio/kalmodulino priklausomų fermentų, tokių kaip baltymų kinazės ir proteazės, aktyvumą.

R. Rothenberg ir H. Cheung (1988) pranešė apie padidėjusį fosfatidilinozitolio 4,5-bisfosfato skaidymą fosfolipazės C pagalba triušių sinovijos ląstelėse, reaguojant į stimuliaciją OFC kristalais. Pastarieji reikšmingai padidino inozitolio-1-fosfato kiekį ląstelėse su žymėtu ( ^3H )-inozitoliu; pikas buvo pasiektas per 1 min. ir išliko apie 1 val.

Diacilglicerolis yra potencialus kalcio pirofosfato dihidrato aktyvatorius. Kadangi OFC kristalai padidina fosfolipazės C aktyvumą, o tai veda prie diacilglicerolio kaupimosi, galima tikėtis PKC aktyvacijos padidėjimo. PG Mitchell ir kt. (1989) palygino OFC kristalų ir PDGF poveikį Balb/c- _{3T3fibroblastų} DNR sintezei. Ląstelių kultūroje PKC buvo inaktyvuotas inkubuojant ląsteles su naviką palaikančiu forbolo diesteriu (TPD), diacilglicerolio analogu. Ilgalaikė stimuliacija mažomis TPD dozėmis sumažino PKC aktyvumą, o vienkartinė stimuliacija didelėmis dozėmis jį aktyvavo. DNR sintezės stimuliacija OFC kristalais buvo slopinama po PKC inaktyvacijos, o tai rodo šio fermento svarbą OFC sukeltoje mitogenezėje. Anksčiau GM McCarthy ir kt. (1987) parodė ryšį tarp žmogaus fibroblastų mitogeninio atsako į OFC kristalus ir PKC aktyvacijos. Tačiau OFC kristalai neaktyvuoja fosfatidilinozitolio 3-kinazės ar tirozino kinazių, patvirtindami, kad ląstelių aktyvavimo OFC kristalais mechanizmas yra selektyvus.

Ląstelių proliferaciją kontroliuoja genų grupė, vadinama protoonkogenais. Baltymai foe ir mye, protoonkogenų c-fos ir c-myc produktai, yra lokalizuoti ląstelės branduolyje ir prisijungia prie specifinių DNR sekų. 3T3 fibroblastų stimuliavimas OFC kristalais sukelia c-fos ekspresiją per kelias minutes, kuri pasiekia maksimumą praėjus 30 min. po stimuliacijos. c-myc transkripcijos indukcija OFC kristalais arba PDGF įvyksta per 1 val. ir pasiekia maksimumą praėjus 3 val. po stimuliacijos. Ląstelės išlaiko padidėjusį c-fos ir c-myc transkripcijos lygį mažiausiai 5 val. Ląstelėse su inaktyvuotu PCD c-fos ir c-myc stimuliacija OFC arba TFD kristalais yra reikšmingai slopinama, o šių genų indukcija PDGF nesikeičia.

Mitogenų aktyvuotos baltymų kinazės (MAP K) šeimos nariai yra pagrindiniai įvairių tarpląstelinių signalizacijos kaskadų reguliatoriai. Vienas šios šeimos poklasis, p42/p44, reguliuoja ląstelių proliferaciją per mechanizmą, kuris apima protoonkogenų c-fos ir c-jun aktyvaciją. OFC ir PFKD kristalai aktyvuoja baltymų kinazės signalizacijos kelią, kuriame dalyvauja ir p42, ir p44, o tai rodo šio kelio vaidmenį kalcio turinčių kristalų sukeltoje mitogenezėje.

Galiausiai, OFC sukeltoje mitogenezėje dalyvauja transkripcijos faktorius branduolinis faktorius κB (NF-κB), kuris pirmą kartą buvo aprašytas kaip imunoglobulino κ lengvosios grandinės (IgK) genas. Tai indukuojamas transkripcijos faktorius, svarbus daugelyje signalizacijos kelių, nes jis reguliuoja įvairių genų ekspresiją. NF-κB indukcija paprastai yra susijusi su slopinamųjų baltymų, vadinamų IκB, išsiskyrimu iš citoplazmos. Po NF-κB indukcijos aktyvus transkripcijos faktorius perkeliamas į branduolį. OFC kristalai indukuoja NF-κB Balb/c- _3T3 fibroblastuose ir žmogaus odos fibroblastuose.

Po NF-κB aktyvacijos signalo perdavime gali dalyvauti keli keliai, tačiau visi jie apima baltymų kinazes, kurios fosforilina (ir taip skaido) IκB. Remiantis in vitro tyrimais, anksčiau manyta, kad IκB yra kinazių (pvz., PKC ir baltymų kinazės A) substratas. Tačiau neseniai buvo identifikuotas didelės molekulinės masės IκB kinazės kompleksas. Šios kinazės specifiškai fosforilina IκB serino likučius. NF-κB aktyvacijai TNF-α ir IL-1 reikalingas efektyvus NF-κB indukuojančios kinazės (NIK) ir IκB kinazės veikimas. NIK aktyvacijos molekulinis mechanizmas šiuo metu nežinomas. Nors OFC kristalai aktyvuoja ir PKC, ir NF-κB, nežinoma, kiek šie du procesai gali būti susiję. Kadangi GκB kinazės modifikacija vyksta fosforilinant, negalima atmesti PKC vaidmens NF-κB indukcijoje OFC kristalais fosforilinant ir aktyvuojant GκB kinazę. Šią koncepciją patvirtina PKC inhibitoriaus staurosporino sukeliamas OFC kristalų sukeltos mitogenezės ir NF-κB ekspresijos slopinimas. Panašiai staurosporinas gali slopinti GκB kinazę ir tokiu būdu slopina baltymų kinazę A ir kitas baltymų kinazes.

Taigi, OFC kristalų sukeltos mitogenezės mechanizmas fibroblastuose apima bent du skirtingus procesus:

• greitas membranos prisijungimo įvykis, dėl kurio aktyvuojami PKC ir MAP K, indukuojami NF-κB ir protoonkogenai,
• lėtesnis kristalų tirpimas ląstelėse, dėl kurio padidėja tarpląstelinis Ca2 ⁺ kiekis, o vėliau suaktyvinami keli nuo kalcio priklausomi procesai, stimuliuojantys mitogenezę.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukcija MMP-kalcio turinčiais kristalais

Kalcio turinčių kristalų sukelto audinių pažeidimo tarpininkai yra MMP – kolagenazė-1, stromelizinas, 92 kD želatinazė ir kolagenazė-3.

Atsižvelgiant į ryšį tarp OFC kristalų kiekio ir sąnario audinių irimo, buvo iškelta hipotezė, kad OFC kristalai ir galbūt kai kurie kolagenai yra fagocituojami sinovijos ląstelių. Stimuliuoti sinovocitai proliferuoja ir išskiria proteazes. Ši hipotezė buvo patikrinta in vitro, į kultivuotas žmogaus arba šuns sinovocitus įdedant natūralių arba sintetinių OFC, PFCD ir kitų kristalų. Neutralių proteazių ir kolagenazių aktyvumas didėjo priklausomai nuo dozės ir buvo maždaug 5–8 kartus didesnis nei kontrolinės ląstelių kultūros, auginamos be kristalų.

Kristalų turinčioje terpėje kultivuojamose ląstelėse buvo aptikta kolagenazės-1, stromelizino ir želatinazės-92 kDa mRNR bendra indukcija, po kurios sekė fermentų sekrecija į terpę.

OFC kristalai taip pat sukėlė kolagenazės-1 ir kolagenazės-2 mRNR kaupimąsi subrendusiuose kiaulių chondrocituose, po to fermentų sekreciją į terpę.

GM McCarty ir kt. (1998) tyrė tarpląstelinio kristalų tirpimo vaidmenį kristalų sukeltoje MMP gamyboje. Lizosomų pH padidinimas bafilomicinu A slopino tarpląstelinį kristalų tirpimą ir taip pat silpnino žmogaus fibroblastų proliferacinį atsaką į OFC kristalus, tačiau neslopino MMP sintezės ir sekrecijos.

Nei bazinis kalcio fosfatas, nei PFCD kristalai in vitro nesukėlė IL-1 gamybos, tačiau natrio urato kristalai tai padarė.

Dabartiniai duomenys aiškiai rodo, kad fibroblastai ir chondrocitai tiesiogiai stimuliuoja MMP gamybą, kontaktuodami su kalcio turinčiais kristalais.

Osteoartrito simptomai rodo reikšmingą MMP vaidmenį ligos progresavime. Kalcio turinčių kristalų buvimas padidina pažeistų sąnarių audinių degeneraciją.

Prostaglandinų sintezės stimuliavimas

Kartu su ląstelių augimo ir fermentų sekrecijos stimuliavimu, kalcio turintys kristalai sukelia prostaglandinų, ypač PGE2, išsiskyrimą iš žinduolių ląstelių kultūrų _.Visais atvejais PGE2 išsiskyrimas įvyksta per pirmąją valandą po ląstelių sąlyčio su kristalais. R. Rothenbergas (1987) nustatė, kad pagrindiniai arachidono rūgšties šaltiniai PGE2 sintezei _yra fosfatidilcholinas ir fosfatidiletanolaminas, taip pat patvirtino, kad fosfolipazė A2 _{ir NOX yra dominuojantys PGE2gamybos} keliai.

PGE1 taip pat gali būti išsiskiriantis reaguojant į OFA kristalus. GM McCarty ir kt. (1993, 1994) tyrė PGE2 _, PGE ir jo analogo misoprostolio poveikį žmogaus fibroblastų mitogeniniam atsakui į OFA kristalus. Visi trys agentai slopino mitogeninį atsaką priklausomai nuo dozės, o PGE ir misoprostolis pasižymėjo ryškesniu slopinamuoju aktyvumu. PGE2 ir misoprostolis, bet ne PGE2 _, slopino kolagenazės mRNR kaupimąsi reaguojant į OFA kristalus.

MG McCarty ir H. Cheung (1994) tyrė OFC sukeltos ląstelių aktyvacijos mechanizmą PGE. Autoriai parodė, kad PGE, galingesnis tarpląstelinio cAMP induktorius nei PGE2 _, ir PGE, slopina OFC sukeltą mitogenezę ir MMP gamybą per cAMP priklausomą signalo perdavimo kelią. Gali būti, kad OFC kristalų sukeltas PGE gamybos padidėjimas silpnina kitą jų biologinį poveikį (mitogenezę ir MMP gamybą) per grįžtamojo ryšio mechanizmą.

Kristalų sukeltas uždegimas

Kalcio turintys kristalai dažnai randami pacientų, sergančių osteoartroze, sinoviniame skystyje, tačiau ūminio uždegimo su leukocitoze epizodai yra reti tiek sergant osteoartritu, tiek su kristalais susijusiomis artropatijomis (pavyzdžiui, Milvokio peties sindromu). Kristalų flogistinį potencialą gali pakeisti daugybė slopinamųjų veiksnių. R. Terkeltaub ir kt. (1988) parodė kraujo serumo ir plazmos gebėjimą reikšmingai slopinti neutrofilinių granulocitų atsaką į bazinius kalcio fosfato kristalus. Tokį slopinimą sukeliantys veiksniai yra kristalus surišantys baltymai. Vieno iš šių baltymų, ₂ -HS glikoproteino (AHSr), tyrimas parodė, kad AHSr yra stipriausias ir specifiškiausias neutrofilinių granulocitų atsako į OFC kristalus inhibitorius. AHSr yra kepenų kilmės serumo baltymas; Yra žinoma, kad, palyginti su kitais serumo baltymais, jo koncentracija kauluose ir mineralizuojančiuose audiniuose yra santykinai didelė. Be to, AHSr yra „neuždegtame“ sinoviniame skystyje ir taip pat buvo aptiktas ant bazinių kalcio fosfato kristalų natūraliame sinoviniame skystyje. Taigi, negalima atmesti galimybės, kad AHSr moduliuoja bazinių kalcio fosfato kristalų flogogeninį potencialą in vivo.

Apibendrinant visa tai, kas išdėstyta pirmiau, pateikiame dvi osteoartrito patogenezės schemas, kurias pasiūlė WB van den Berg ir kt. (1999) ir M. Carrabba ir kt. (1996), kurie sujungia mechaninius, genetinius ir biocheminius veiksnius.