Geltonkūnio maišelio kraujodaros kamieninės ląstelės

Akivaizdu, kad įvairius kraujodaros kamieninių ląstelių proliferacinius ir diferenciacinius potencialus lemia jų ontogenetinio vystymosi ypatumai, nes net pagrindinių kraujodaros sričių lokalizacija žmonėms ontogenezės metu keičiasi. Vaisiaus trynio maišelio kraujodaros pirmtakinės ląstelės yra skirtos išskirtinai eritropoetinei ląstelių linijai formuoti. Po pirminių HSC migracijos į kepenis ir blužnį, šių organų mikroaplinkoje išsiplečia įsipareigojimo linijų spektras. Visų pirma, kraujodaros kamieninės ląstelės įgyja gebėjimą generuoti limfoidinės linijos ląsteles. Prenataliniu laikotarpiu kraujodaros pirmtakinės ląstelės pasiekia galutinės lokalizacijos zoną ir užpildo kaulų čiulpus. Intrauterininės raidos metu vaisiaus kraujyje yra daug kraujodaros kamieninių ląstelių. Pavyzdžiui, 13-ąją nėštumo savaitę HSC lygis pasiekia 18% viso mononuklearinių kraujo ląstelių skaičiaus. Vėliau stebimas laipsniškas jų kiekio mažėjimas, tačiau net prieš gimimą HSC kiekis virkštelės kraujyje mažai skiriasi nuo jų kiekio kaulų čiulpuose.

Remiantis klasikinėmis koncepcijomis, natūralus kraujodaros lokalizacijos pokytis žinduolių embriono vystymosi metu vyksta migruojant ir įvedant į naują pluripotentines kraujodaros kamienines ląsteles – nuo trynio maišelio iki kepenų, blužnies ir kaulų čiulpų. Kadangi ankstyvosiose embriono vystymosi stadijose kraujodaros audinyje yra daug kamieninių ląstelių, kurių mažėja vaisiui bręstant, perspektyviausiu kraujodaros kamieninėms ląstelėms gauti laikomas embriono kepenų kraujodaros audinys, išskirtas iš abortuotos medžiagos 5–8 nėštumo savaitę.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Klausimai apie kraujodaros kamieninių ląstelių kilmę

Neabejotina, kad embrioniniai eritrocitai formuojasi trynio maišelio kraujo salelėse. Tačiau trynio maišelio kraujodaros ląstelių diferenciacijos potencialas in vitro yra labai ribotas (jos daugiausia diferencijuojasi į eritrocitus). Reikėtų pažymėti, kad trynio maišelio kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacija ilgą laiką negali atkurti kraujodaros. Paaiškėjo, kad šios ląstelės nėra suaugusių HSC pirmtakai. Tikrosios HSC atsiranda anksčiau, 3–5 intrauterininės raidos savaitę, skrandžio audinio ir kraujagyslių endotelio formavimosi zonoje (paraaortinėje splanchnopleuroje, P-SP), taip pat aortos, lytinių liaukų ir pirminių inkstų vietoje – mezonefrozinėje arba vadinamojoje AGM srityje. Įrodyta, kad AGM srities ląstelės yra ne tik HSC, bet ir kraujagyslių endotelio ląstelių, taip pat osteoklastų, dalyvaujančių kaulinio audinio formavimosi procesuose, šaltinis. 6-ąją nėštumo savaitę ankstyvosios kraujodaros progenitorinės ląstelės iš AGM regiono persikelia į kepenis, kurios išlieka pagrindiniu vaisiaus kraujodaros organu iki gimimo.

Kadangi šis aspektas yra nepaprastai svarbus ląstelių transplantacijos požiūriu, HSC kilmės žmogaus embriogenezės procese problema nusipelno išsamesnio pristatymo. Klasikinės idėjos, kad žinduolių ir paukščių kraujodaros kamieninės ląstelės yra kilusios iš ekstraembrioninio šaltinio, yra pagrįstos Metcalfo ir Moore'o tyrimais, kurie pirmieji panaudojo HSC ir jų palikuonių, išskirtų iš trynio maišelio, klonavimo metodus. Jų darbo rezultatai buvo migracijos teorijos pagrindas, pagal kurią HSC, pirmą kartą pasirodžiusios trynio maišelyje, nuosekliai užpildo pereinamuosius ir galutinius kraujodaros organus, kai juose susidaro atitinkama mikroaplinka. Taip buvo nustatytas požiūris, kad HSC, iš pradžių lokalizuotų trynio maišelyje, generacija yra ląstelinis pagrindas galutinei kraujodarai.

Trynio maišelio kraujodaros kamieninės ląstelės priklauso ankstyviausių kraujodaros kamieninių ląstelių kategorijai. Jų fenotipą apibūdina formulė AA4.1+CD34+c-kit+. Skirtingai nuo subrendusių kaulų čiulpų HSC, jos neekspresuoja Sca-1 antigenų ir MHC molekulių. Atrodytų, kad žymenų antigenų atsiradimas ant trynio maišelio HSC paviršiaus membranų kultivavimo metu atitinka jų diferenciaciją embriono vystymosi metu, formuojantis įsipareigojusioms kraujodaros linijoms: sumažėja CD34 ir Thy-1 antigenų ekspresijos lygis, padidėja CD38 ir CD45RA ekspresija ir atsiranda HLA-DR molekulės. Vėliau specializuojantis in vitro, kurį sukelia citokinai ir augimo faktoriai, prasideda tam tikros ląstelių linijos kraujodaros kamieninėms ląstelėms specifinių antigenų ekspresija. Tačiau trijų stuburinių klasių (varliagyvių, paukščių ir žinduolių) atstovų embrioninės kraujodaros tyrimų rezultatai ir ypač HSC, atsakingų už galutinę kraujodarą postnatalinėje ontogenezėje, kilmės analizė prieštarauja klasikinėms koncepcijoms. Nustatyta, kad visų nagrinėjamų klasių atstovų organizme embriogenezės metu susidaro du nepriklausomi regionai, kuriuose atsiranda HSC. Ekstraembrioninį „klasikinį“ regioną reprezentuoja trynio maišelis arba jo analogai, o neseniai nustatyta intraembrioninė HSC lokalizacijos zona apima paraaortinę mezenchimą ir AGM regioną. Šiandien galima teigti, kad varliagyvių ir paukščių atveju galutinės HSC atsiranda iš intraembrioninių šaltinių, o žinduolių ir žmonių atveju trynio maišelio HSC dalyvavimo galutinėje kraujodaroje dar negalima visiškai atmesti.

Embrioninė kraujodaros reakcija trynio maišelyje iš tiesų yra pirminė eritropoezė, kuriai būdingas branduolio išsaugojimas visuose eritrocitų brendimo ir vaisiaus tipo hemoglobino sintezės etapuose. Remiantis naujausiais duomenimis, pirminės eritropoezės banga trynio maišelyje baigiasi 8-ąją embriono vystymosi dieną. Po jos seka galutinių eritroidinių pirmtakinių ląstelių – BFU-E – kaupimosi laikotarpis, kurios susidaro išskirtinai trynio maišelyje ir pirmą kartą pasirodo 9-ąją nėštumo dieną. Kitame embriogenezės etape jau yra susiformavusios galutinės eritroidinės pirmtakinės ląstelės – CFU-E, taip pat (!) putliosios ląstelės ir CFU-GM. Tai yra požiūrio, kad galutinės pirmtakinės ląstelės atsiranda trynio maišelyje, migruoja su kraujotaka, nusėda kepenyse ir greitai pradeda pirmąją intraembrioninės kraujodaros fazę, pagrindas. Remiantis šiomis koncepcijomis, trynio maišelis gali būti laikomas, viena vertus, pirminės eritropoezės vieta, kita vertus, pirmuoju galutinių kraujodaros progenitorinių ląstelių šaltiniu embriono vystymesi.

Įrodyta, kad kolonijas formuojančias ląsteles, turinčias didelį proliferacinį potencialą, iš trynio maišelio galima išskirti jau 8-ąją nėštumo dieną, t. y. gerokai prieš embriono ir trynio maišelio kraujagyslių sistemos užsidarymą. Be to, iš trynio maišelio in vitro gautos ląstelės, turinčios didelį proliferacinį potencialą, sudaro kolonijas, kurių dydis ir ląstelių sudėtis nesiskiria nuo atitinkamų kaulų čiulpų kamieninių ląstelių kultūrinio augimo parametrų. Tuo pačiu metu, retransplantuojant trynio maišelio kolonijas formuojančias ląsteles, turinčias didelį proliferacinį potencialą, susidaro žymiai daugiau dukterinių kolonijas formuojančių ląstelių ir multipotentinių pirmtakų ląstelių nei naudojant kraujodaros kaulų čiulpų pirmtakas.

Galutinę išvadą apie trynio maišelio kraujodaros kamieninių ląstelių vaidmenį galutinėje kraujodaroje galima padaryti remiantis darbo, kuriame autoriai gavo trynio maišelio endotelio ląstelių liniją (G166), kuri efektyviai palaikė savo ląstelių, turinčių HSC fenotipines ir funkcines savybes (AA4.1+WGA+, mažas tankis ir silpnos adhezinės savybės), proliferaciją. Pastarųjų kiekis padidėjo daugiau nei 100 kartų, kai jos buvo auginamos ant C166 ląstelių maitinamojo sluoksnio 8 dienas. Mišriose kolonijose, auginamose ant C166 ląstelių posluoksnio, buvo identifikuoti makrofagai, granulocitai, megakariocitai, blastinės ląstelės ir monocitai, taip pat B ir T limfocitų pirmtakinės ląstelės. Autorių eksperimentuose trynio maišelio ląstelės, augančios ant endotelio ląstelių posluoksnio, turėjo gebėjimą pačios daugintis ir atlaikė iki trijų pasažų. Jų pagalba atkurtas kraujodaros procesas subrendusioms pelėms, sergančioms sunkiu kombinuotu imunodeficitu (SCID), buvo lydimas visų tipų leukocitų, taip pat T ir B limfocitų susidarymo. Tačiau autoriai savo tyrimuose naudojo 10 dienų amžiaus embriono trynio maišelio ląsteles, kuriose jau uždarytos ekstraembrioninės ir intraembrioninės kraujagyslių sistemos, todėl negalima atmesti intraembrioninių HSC buvimo tarp trynio maišelio ląstelių.

Tuo pačiu metu, ankstyvųjų vystymosi stadijų hematopoetinių ląstelių, išskirtų prieš trynio maišelio ir embriono kraujagyslių sistemų suvienijimą (8–8,5 nėštumo dienos), diferenciacijos potencialo analizė atskleidė T ir B ląstelių pirmtakų buvimą trynio maišelyje, bet ne embriono kūne. In vitro sistemoje, dviejų pakopų kultivavimo metodu ant užkrūčio liaukos epitelio ir poepitelinių ląstelių monosluoksnio, trynio maišelio mononuklearinės ląstelės diferencijuojasi į pre-T ir subrendusius T limfocitus. Tokiomis pačiomis kultivavimo sąlygomis, bet ant kepenų ir kaulų čiulpų stromos ląstelių monosluoksnio, trynio maišelio mononuklearinės ląstelės diferencijuojasi į pre-B ląsteles ir subrendusius IglVT-B limfocitus.

Šių tyrimų rezultatai rodo, kad imuninės sistemos ląstelės gali išsivystyti iš ekstraembrioninio trynio maišelio audinio, o pirminių T ir B ląstelių linijų formavimasis priklauso nuo embrioninių kraujodaros organų stromos mikroaplinkos veiksnių.

Kiti autoriai taip pat parodė, kad trynio maišelyje yra ląstelių, turinčių limfoidinės diferenciacijos potencialą, o gauti limfocitai antigeninėmis savybėmis nesiskiria nuo lytiškai subrendusių gyvūnų limfocitų. Nustatyta, kad 8–9 dienų amžiaus embriono trynio maišelio ląstelės geba atkurti limfopoezę atimocitų užkrūčio liaukoje, atsirandant subrendusiems CD3+CD4+- ir CD3+CD8+-limfocitams, turintiems susiformavusį T ląstelių receptorių repertuarą. Taigi, užkrūčio liauką gali užpildyti ekstraembrioninės kilmės ląstelės, tačiau neįmanoma atmesti galimos ankstyvųjų T limfocitų pirmtakų ląstelių migracijos iš intraembrioninių limfopoezės šaltinių į užkrūčio liauką.

Tuo pačiu metu, trynio maišelio kraujodaros ląstelių transplantacija suaugusiems apšvitintiems recipientams ne visada lemia ilgalaikį išeikvotų kraujodaros audinių lokalizacijos zonų atkūrimą, o in vitro trynio maišelio ląstelės sudaro žymiai mažiau blužnies kolonijų nei AGM regiono ląstelės. Kai kuriais atvejais, naudojant 9 dienų amžiaus embriono trynio maišelio ląsteles, vis dar įmanoma pasiekti ilgalaikį (iki 6 mėnesių) kraujodaros audinių atkūrimą apšvitintuose recipientuose. Autoriai mano, kad trynio maišelio ląstelės, turinčios CD34+c-kit+ fenotipą, ne tik nesiskiria nuo ląstelių iš AGM regiono savo gebėjimu atkurti išeikvotus kraujodaros organus, bet ir efektyviau atkurti kraujodarą, nes trynio maišelyje jų yra beveik 37 kartus daugiau.

Reikėtų pažymėti, kad eksperimentuose buvo naudojamos trynio maišelio kraujodaros ląstelės su kraujodaros kamieninių ląstelių žymenų antigenais (c-kit+ ir/arba CD34+ ir CD38+), kurios buvo suleistos tiesiai į pelių patelių, kurioms 18-ąją nėštumo dieną buvo suleista busulfano, palikuonių kepenis arba pilvo veną. Tokiems naujagimiams gyvūnams jų pačių mielopoezė buvo smarkiai slopinama dėl busulfano sukeltos kraujodaros kamieninių ląstelių eliminacijos. Po trynio maišelio kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijos recipientų periferiniame kraujyje 11 mėnesių buvo aptikti susiformavę elementai, turintys donoro žymeklį – glicerofosfato dehidrogenazę. Nustatyta, kad trynio maišelio HSC atkuria limfoidinių, mieloidinių ir eritroidinių linijų ląstelių kiekį kraujyje, užkrūčio liaukoje, blužnyje ir kaulų čiulpuose, o chimerizmo lygis buvo didesnis, kai trynio maišelio ląstelės buvo suleistos intrahepatiškai, o ne intraveniškai. Autoriai mano, kad ankstyvos stadijos embrionų (iki 10 dienų) trynio maišelio HSC reikalinga išankstinė sąveika su kepenų kraujodaros mikroaplinka, kad sėkmingai užpildytų suaugusių recipientų kraujodaros organus. Gali būti, kad embriogenezėje yra unikalus vystymosi etapas, kai trynio maišelio ląstelės, iš pradžių migruodamos į kepenis, vėliau įgyja gebėjimą užpildyti subrendusių recipientų kraujodaros organų stromą.

Šiuo atžvilgiu reikėtų pažymėti, kad imuninės sistemos ląstelių chimerizmas gana dažnai stebimas po kaulų čiulpų ląstelių transplantacijos apšvitintiems subrendusiems recipientams – pastarųjų kraujyje donoro fenotipo ląstelės randamos gana dideliais kiekiais tarp recipiento B, T limfocitų ir granulocitų, kurie tęsiasi mažiausiai 6 mėnesius.

Žinduolių kraujodaros ląstelės morfologiniais metodais pirmą kartą aptinkamos 7-ąją embriono vystymosi dieną ir yra pavaizduotos kraujodaros salelėmis trynio maišelio induose. Tačiau natūrali kraujodaros diferenciacija trynio maišelyje apsiriboja pirminiais eritrocitais, kurie išlaiko branduolius ir sintetina vaisiaus hemoglobiną. Nepaisant to, tradiciškai buvo manoma, kad trynio maišelis yra vienintelis HSC šaltinis, migruojantis į besivystančio embriono kraujodaros organus ir užtikrinantis galutinę kraujodarą suaugusiems gyvūnams, nes HSC atsiradimas embriono kūne sutampa su trynio maišelio ir embriono kraujagyslių sistemų uždarymu. Šį požiūrį patvirtina duomenys, kad trynio maišelio ląstelės, klonuotos in vitro, duoda granulocitų ir makrofagų, o in vivo - blužnies kolonijų. Tuomet, atliekant transplantacijos eksperimentus, buvo nustatyta, kad trynio maišelio kraujodaros ląstelės, kurios pačiame trynio maišelyje geba diferencijuotis tik į pirminius eritrocitus, naujagimių ir suaugusių SCID pelių kepenų mikroaplinkoje, išeikvotame užkrūčio liaukoje arba stromos maitinamojoje dalyje, įgyja gebėjimą atkurti kraujodaros organus, atkuriant visas kraujodaros linijas net ir suaugusiems recipientams. Iš principo tai leidžia jas priskirti tikroms HSC – ląstelėms, kurios funkcionuoja postnataliniu laikotarpiu. Daroma prielaida, kad trynio maišelis kartu su AGM sritimi yra HSC šaltinis galutinei kraujodarai žinduoliams, tačiau jų indėlis į kraujodaros sistemos vystymąsi vis dar neaiškus. Taip pat neaiški dviejų kraujodaros organų, turinčių panašias funkcijas, egzistavimo ankstyvojoje žinduolių embriogenezėje biologinė reikšmė.

Atsakymų į šiuos klausimus paieškos tęsiasi. In vivo pavyko įrodyti, kad 8–8,5 dienų amžiaus embrionų trynio maišelyje yra ląstelių, kurios atkuria limfopoezę subletaliai apšvitintose SCID pelėse, kurioms nustatytas ryškus T ir B limfocitų trūkumas. Trynio maišelio kraujodaros ląstelės buvo suleistos tiek į pilvaplėvės ertmę, tiek tiesiai į blužnies ir kepenų audinį. Po 16 savaičių recipientų organizme buvo aptikti TCR/CD34 CD4+ ir CD8+ T limfocitai bei B-220+IgM+ B limfocitai, pažymėti donoro MHC antrx genais. Tuo pačiu metu autoriai nerado kamieninių ląstelių, galinčių atkurti imuninę sistemą 8–8,5 dienų amžiaus embrionų organizme.

Trynio maišelio kraujodaros ląstelės pasižymi dideliu proliferaciniu potencialu ir geba ilgai daugintis in vitro. Kai kurie autoriai šias ląsteles identifikuoja kaip HSC, remdamiesi ilga (beveik 7 mėnesius) trunkančia eritroidinių pirmtakų ląstelių generacija, kurios nuo eritroidinės linijos kaulų čiulpų pirmtakų skiriasi ilgesniu pasažo laikotarpiu, didesniais kolonijų dydžiais, padidėjusiu jautrumu augimo faktoriams ir ilgesne proliferacija. Be to, tinkamomis trynio maišelio ląstelių kultivavimo in vitro sąlygomis susidaro ir limfoidinės pirmtakos ląstelės.

Pateikti duomenys leidžia manyti, kad trynio maišelis yra mažiau įsipareigojęs ir todėl turintis didesnį proliferacinį potencialą nei kaulų čiulpų kamieninės ląstelės. Tačiau, nepaisant to, kad trynio maišelyje yra pluripotentinių kraujodaros pirmtakų ląstelių, kurios in vitro ilgą laiką palaiko įvairias kraujodaros diferenciacijos linijas, vienintelis HSC išsamumo kriterijus yra jų gebėjimas ilgai atkurti recipiento kraujodaros organus, kurių kraujodaros ląstelės yra sunaikintos arba genetiškai defektingos. Taigi pagrindinis klausimas yra, ar pluripotentinės trynio maišelio kraujodaros ląstelės gali migruoti ir užpildyti kraujodaros organus, ir ar patartina peržiūrėti žinomus darbus, kurie įrodo jų gebėjimą atkurti subrendusių gyvūnų kraujodaros organus, susidarant pagrindinėms kraujodaros linijoms. Intraembrioniniai galutinių GSC šaltiniai buvo nustatyti paukščių embrionuose dar aštuntajame dešimtmetyje, o tai jau tada kėlė abejonių dėl nusistovėjusių idėjų apie ekstraembrioninę GSC kilmę, įskaitant ir kitų stuburinių klasių atstovus. Per pastaruosius kelerius metus pasirodė publikacijų apie panašių intraembrioninių sričių, kuriose yra GSC, buvimą žinduoliams ir žmonėms.

Dar kartą reikėtų pažymėti, kad fundamentinės žinios šioje srityje yra nepaprastai svarbios praktinei ląstelių transplantacijai, nes jos padės ne tik nustatyti pageidaujamą HSC šaltinį, bet ir nustatyti pirminių kraujodaros ląstelių sąveikos su genetiškai svetimu organizmu ypatybes. Yra žinoma, kad žmogaus vaisiaus kepenų kraujodaros kamieninių ląstelių įvedimas į avies embrioną organogenezės stadijoje lemia chimerų gyvūnų, kurių kraujyje ir kaulų čiulpuose stabiliai nustatomi 3–5 % žmogaus kraujodaros ląstelių, gimimą. Tuo pačiu metu žmogaus HSC nekeičia savo kariotipo, išlaikydamos aukštą proliferacijos greitį ir gebėjimą diferenciuotis. Be to, persodinti ksenogeniniai HSC neprieštarauja šeimininko organizmo imuninei sistemai ir fagocitams ir netransformuojasi į navikines ląsteles, o tai sudarė pagrindą intensyviam paveldimos genetinės patologijos intrauterininės korekcijos metodų, naudojant HSC arba ESC, transfekuotas su trūkstamais genais, kūrimui.

Tačiau kuriame embriogenezės etape tikslingiau atlikti tokią korekciją? Pirmą kartą kraujodarai nustatytos ląstelės žinduoliams atsiranda iškart po implantacijos (6-ąją nėštumo dieną), kai dar nėra morfologinių kraujodaros diferenciacijos ir tariamų kraujodaros organų požymių. Šiame etape išsklaidytos pelės embriono ląstelės geba atkurti apšvitintų recipientų kraujodaros organų populiaciją, sudarydamos eritrocitus ir limfocitus, kurie nuo šeimininko ląstelių skiriasi atitinkamai hemoglobino arba glicerofosfato izomerazės tipu, taip pat papildomu donorinių ląstelių chromosomų žymeniu (Tb). Žinduoliams, kaip ir paukščiams, kartu su trynio maišeliu, prieš užsidarant bendrai kraujagyslių lovai, kraujodaros ląstelės atsiranda tiesiai embriono kūne, paraaortinėje splanchnopleuroje. Iš AGM srities buvo išskirtos AA4.1+ fenotipo kraujodaros ląstelės ir apibūdintos kaip multipotentinės kraujodaros ląstelės, sudarančios T ir B limfocitus, granulocitus, megakariocitus ir makrofagus. Fenotipiškai šios multipotentinės progenitorinės ląstelės yra labai artimos suaugusių gyvūnų kaulų čiulpų HSC (CD34+c-kit+). Multipotentinių AA4.1+ ląstelių skaičius tarp visų AGM regiono ląstelių yra mažas – jos sudaro ne daugiau kaip 1/12 jo dalies.

Žmogaus embrione taip pat buvo identifikuotas intraembrioninis regionas, kuriame yra HSC, homologiškų gyvūnų AGM regionui. Be to, žmonių embriono kūne yra daugiau nei 80 % daugiapotentinių ląstelių, turinčių didelį proliferacinį potencialą, nors tokių ląstelių yra ir trynio maišelyje. Išsami jų lokalizacijos analizė parodė, kad šimtai tokių ląstelių yra surinktos kompaktiškomis grupėmis, esančiomis arti nugarinės aortos ventralinės sienelės endotelio. Fenotipiškai tai yra CD34CD45+Lin ląstelės. Priešingai, trynio maišelyje, kaip ir kituose embriono kraujodaros organuose (kepenyse, kaulų čiulpuose), tokios ląstelės yra pavienės.

Todėl žmogaus embrione AGM regione yra hematopoetinių ląstelių sankaupos, glaudžiai susijusios su nugarinės aortos ventraliniu endoteliu. Šis ryšys taip pat atsekamas imunocheminiu lygmeniu – tiek hematopoetinių sankaupų ląstelės, tiek endotelio ląstelės ekspresuoja kraujagyslių endotelio augimo faktorių, Flt-3 ligandą, jų receptorius FLK-1 ir STK-1, taip pat leukemijos kamieninių ląstelių transkripcijos faktorių. AGM regione mezenchiminius darinius reprezentuoja tanki apvalių ląstelių grandinė, išsidėsčiusi palei visą nugarinę aortą ir ekspresuojanti tenasciną C – pagrindinės medžiagos glikoproteiną, aktyviai dalyvaujantį tarpląstelinės sąveikos ir migracijos procesuose.

Po transplantacijos daugiapotentės AGM regiono kamieninės ląstelės greitai atkuria kraujodarą subrendusiose apšvitintose pelėse ir užtikrina efektyvią kraujodarą ilgą laiką (iki 8 mėnesių). Autoriai nerado ląstelių su tokiomis savybėmis trynio maišelyje. Šio tyrimo rezultatus patvirtina kito darbo duomenys, kurie parodė, kad ankstyvosios vystymosi stadijos (10,5 dienos) embrionuose AGM regionas yra vienintelis ląstelių, atitinkančių HSC apibrėžimą, šaltinis, atkuriantis mieloidinę ir limfoidinę kraujodarą subrendusiuose apšvitintuose recipientuose.

Iš AGM regiono buvo išskirta stromos linija AGM-S3, kurios ląstelės palaiko atsidavusių pirmtakinių ląstelių CFU-GM, BFU-E, CFU-E ir mišraus tipo kolonijas formuojančių vienetų generavimą kultūroje. Pastarųjų kiekis kultivuojant ant AGM-S3 linijos ląstelių maitinamojo sluoksnio padidėja nuo 10 iki 80 kartų. Taigi, AGM regiono mikroaplinkoje yra stromos bazinių ląstelių, kurios efektyviai palaiko kraujodarą, todėl pats AGM regionas gali veikti kaip embrioninis kraujodaros organas – galutinių HSC, t. y. HSC, kurios sudaro suaugusio gyvūno kraujodaros audinį, šaltinis.

Išplėstinis AGM regiono ląstelinės sudėties imunofenotipavimas parodė, kad jame yra ne tik multipotentinės hematopoetinės ląstelės, bet ir ląstelės, skirtos mieloidinių ir limfoidinių (T ir B limfocitų) diferenciacijai. Tačiau atskirų CD34+c-kit+ ląstelių iš AGM regiono molekulinė analizė naudojant polimerazės grandininę reakciją atskleidė tik beta-globino ir mieloperoksidazės genų aktyvaciją, bet ne limfoidinių genų, koduojančių CD34, Thy-1 ir 15 sintezę, aktyvaciją. Dalinis linijai būdingų genų aktyvavimas būdingas ankstyvosioms HSC ir progenitorinių ląstelių generacijos ontogenezės stadijoms. Atsižvelgiant į tai, kad 10 dienų embriono AGM regione atsidavusių progenitorinių ląstelių skaičius yra 2–3 dydžio eilėmis mažesnis nei kepenyse, galima teigti, kad 10-ąją embriogenezės dieną hematopoezė AGM regione tik prasideda, o pagrindiniame vaisiaus kraujodaros organe per šį laikotarpį hematopoetinės linijos jau būna išsivysčiusios.

Iš tiesų, skirtingai nei ankstesnės (9–11 dienų) trynio maišelio ir AGM srities hematopoetinės kamieninės ląstelės, kurios atkuria naujagimio, bet ne suaugusio organizmo hematopoetinę mikroaplinką, 12–17 dienų embriono kepenų hematopoetinėms progenitorinėms ląstelėms nebereikia ankstyvos postnatalinės mikroaplinkos ir jos užpildo suaugusio gyvūno kraujodaros organus ne blogiau nei naujagimio. Po embrioninių kepenų HSC transplantacijos, apšvitintų suaugusių recipientų pelių hematopoezė buvo polikloninio pobūdžio. Be to, naudojant paženklintas kolonijas, buvo įrodyta, kad prigijusių klonų funkcionavimas visiškai priklauso nuo kloninės sekos, kuri aptinkama suaugusiųjų kaulų čiulpuose. Todėl embrioninės kepenų HSC, paženklintos pačiomis švelniausiomis sąlygomis, be išankstinės stimuliacijos egzogeniniais citokinais, jau turi pagrindinius suaugusių HSC požymius: joms nereikia ankstyvos poembrioninės mikroaplinkos, po transplantacijos jos pereina į gilios ramybės būseną ir yra mobilizuojamos į klonų formavimąsi nuosekliai pagal kloninės sekos modelį.

Akivaizdu, kad kloninės sukcesijos fenomeną reikia aptarti išsamiau. Eritropoezę atlieka kraujodaros kamieninės ląstelės, turinčios didelį proliferacinį potencialą ir gebėjimą diferenciuotis į visas paskirtas kraujo ląstelių pirmtakų linijas. Esant normaliam kraujodaros intensyvumui, dauguma kraujodaros kamieninių ląstelių yra ramybės būsenoje ir yra mobilizuojamos proliferacijai bei diferenciacijai, nuosekliai formuodamos klonus, kurie pakeičia vienas kitą. Šis procesas vadinamas klonine sukcesija. Eksperimentiniai kloninės sukcesijos hematopoetinėje sistemoje įrodymai buvo gauti atliekant tyrimus su HSC, pažymėtomis retrovirusiniu genų perdavimu. Suaugusiems gyvūnams kraujodarą palaiko daugelis vienu metu veikiančių kraujodaros klonų, HSC darinių. Remiantis kloninės sukcesijos fenomenu, buvo sukurtas repopuliacijos metodas HSC identifikavimui. Pagal šį principą skiriamos ilgalaikės kraujodaros kamieninės ląstelės (LT-HSC), kurios gali atkurti kraujodaros sistemą visą gyvenimą, ir trumpalaikės HSC, kurios šią funkciją atlieka ribotą laiką.

Jei vertintume hematopoetines kamienines ląsteles repopuliacijos požiūriu, tai embrioninių kepenų hematopoetinių ląstelių ypatumas yra jų gebėjimas sukurti kolonijas, kurios yra žymiai didesnio dydžio nei virkštelės kraujo ar kaulų čiulpų HSC augimo metu, ir tai taikoma visų tipų kolonijoms. Vien šis faktas rodo didesnį embrioninių kepenų hematopoetinių ląstelių proliferacinį potencialą. Unikali embrioninių kepenų hematopoetinių progenitorinių ląstelių savybė yra trumpesnis ląstelių ciklas, palyginti su kitais šaltiniais, o tai yra labai svarbu hematopoetinių organų repopuliacijos efektyvumo transplantacijos metu požiūriu. Hematopoetinės suspensijos, gautos iš subrendusio organizmo šaltinių, ląstelinės sudėties analizė rodo, kad visuose ontogenezės etapuose branduolines ląsteles daugiausia reprezentuoja galutinai diferencijuotos ląstelės, kurių skaičius ir fenotipas priklauso nuo hematopoetinio audinio donoro ontogenetinio amžiaus. Visų pirma, kaulų čiulpų ir virkštelės kraujo mononuklearinių ląstelių suspensijos sudaro daugiau nei 50 % subrendusių limfoidinės serijos ląstelių, o embrioninių kepenų hematopoetiniame audinyje yra mažiau nei 10 % limfocitų. Be to, embriono ir vaisiaus kepenyse mieloidinės linijos ląsteles daugiausia reprezentuoja eritroidinės serijos, o virkštelės kraujyje ir kaulų čiulpuose vyrauja granulocitų-makrofagų elementai.

Taip pat svarbu, kad embriono kepenyse būtų visas ankstyviausių hematopoetinių pirmtakų rinkinys. Tarp pastarųjų reikėtų atkreipti dėmesį į eritroidines, granuliocitines, megakariopoetines ir daugialinijines kolonijas formuojančias ląsteles. Jų primityvesni pirmtakai – LTC-IC – geba proliferuoti ir diferencijuotis in vitro 5 savaites ar ilgiau, taip pat išlaiko funkcinį aktyvumą po įsitvirtinimo recipiento organizme alogeninės ir net ksenogeninės transplantacijos imunodeficituotiems gyvūnams metu.

Eritroidinių ląstelių dominavimo embriono kepenyse biologinis tikslingumas (iki 90% viso kraujodaros elementų skaičiaus) atsiranda dėl poreikio aprūpinti sparčiai didėjantį besivystančio vaisiaus kraujo tūrį eritrocitų mase. Embriono kepenyse eritropoezę reprezentuoja įvairaus brandos laipsnio branduoliniai eritroidiniai pirmtakai, kuriuose yra vaisiaus hemoglobino (a2u7), kuris dėl didesnio afiniteto deguoniui užtikrina efektyvią pastarojo absorbciją iš motinos kraujo. Eritropoezės intensyvėjimas embriono kepenyse yra susijęs su vietiniu eritropoetino (EPO) sintezės padidėjimu. Pažymėtina, kad vien eritropoetino buvimas yra pakankamas hematopoetinių ląstelių hematopoetiniam potencialui embriono kepenyse realizuoti, o kaulų čiulpų ir virkštelės kraujo HSC eritropoezei reikalingas citokinų ir augimo faktorių, kuriuos sudaro EPO, SCF, GM-CSF ir IL-3, derinys. Tuo pačiu metu ankstyvosios hematopoetinės progenitorinės ląstelės, išskirtos iš embrioninių kepenų ir neturinčios EPO receptorių, nereaguoja į egzogeninį eritropoetiną. Eritropoezės indukcijai embrioninių kepenų mononuklearinių ląstelių suspensijoje būtinos labiau išsivysčiusios eritropoetinui jautrios ląstelės, turinčios CD34+CD38+ fenotipą ir ekspresuojančios EPO receptorių.

Literatūroje vis dar nėra sutarimo dėl hematopoezės vystymosi embrioniniu laikotarpiu. Nėra nustatyta funkcinė reikšmė, susijusi su ekstra- ir intraembrioninių hematopoetinių progenitorinių ląstelių šaltinių egzistavimu. Tačiau neabejotina, kad žmogaus embriogenezės metu kepenys yra centrinis hematopoezės organas ir 6–12 nėštumo savaitę tarnauja kaip pagrindinis hematopoetinių kamieninių ląstelių, kurios užpildo blužnį, užkrūčio liauką ir kaulų čiulpus, šaltinis. GDR užtikrina atitinkamų funkcijų atlikimą prenataliniu ir postnataliniu vystymosi laikotarpiais.

Dar kartą reikėtų pažymėti, kad embriono kepenys, palyginti su kitais šaltiniais, pasižymi didžiausiu HSC kiekiu. Maždaug 30 % embriono kepenų CD344 ląstelių turi CD38 fenotipą. Tuo pačiu metu limfoidinių pirmtakų ląstelių (CD45+) skaičius ankstyvosiose kraujodaros stadijose kepenyse yra ne didesnis kaip 4 %. Nustatyta, kad vaisiui vystantis, nuo 7 iki 17 nėštumo savaitės, B limfocitų skaičius laipsniškai didėja 1,1 % mėnesiniu „žingsniu“, o HSC lygis nuolat mažėja.

Hematopoetinių kamieninių ląstelių funkcinis aktyvumas taip pat priklauso nuo jų šaltinio embriono vystymosi laikotarpio. Žmogaus embrionų kepenų ląstelių kolonijas formuojančio aktyvumo tyrimas 6-8 ir 9-12 nėštumo savaitę kultivuojant pusiau skystoje terpėje, esant SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 ir EPO, parodė, kad bendras kolonijų skaičius yra 1,5 karto didesnis, kai ankstyvosiose vystymosi stadijose pasėjamos embrioninių kepenų HSC. Tuo pačiu metu mielopoezės progenitorinių ląstelių, tokių kaip CFU-GEMM, skaičius kepenyse 6-8 embriogenezės savaitę yra daugiau nei tris kartus didesnis nei jų skaičius 9-12 nėštumo savaitę. Apskritai embrionų hematopoetinių kepenų ląstelių kolonijas formuojantis aktyvumas pirmąjį nėštumo trimestrą buvo žymiai didesnis nei vaisiaus kepenų ląstelių antrąjį nėštumo trimestrą.

Šie duomenys rodo, kad embriono kepenys embriogenezės pradžioje pasižymi ne tik padidėjusiu ankstyvųjų kraujodaros kamieninių ląstelių kiekiu, bet ir platesniu diferenciacijos į įvairias ląstelių linijas spektru. Šie embriono kepenų kraujodaros kamieninių ląstelių funkcinio aktyvumo požymiai gali turėti tam tikrą klinikinę reikšmę, nes jų kokybinės savybės leidžia tikėtis ryškaus terapinio poveikio persodinant net nedidelį skaičių ląstelių, gautų ankstyvosiose nėštumo stadijose.

Nepaisant to, efektyviai transplantacijai reikalingų kraujodaros kamieninių ląstelių kiekio problema išlieka atvira ir aktuali. Ją bandoma spręsti panaudojant didelį embrioninių kepenų kraujodaros ląstelių savaiminio dauginimosi in vitro potencialą, stimuliuojant jas citokinais ir augimo faktoriais. Nuolat perfuzuojant ankstyvąsias embrioninių kepenų HSC bioreaktoriuje, po 2–3 dienų galima gauti 15 kartų didesnį kraujodaros kamieninių ląstelių kiekį nei pradinis. Palyginimui, reikėtų atkreipti dėmesį, kad norint pasiekti 20 kartų didesnį žmogaus virkštelės kraujo HSC kiekį tomis pačiomis sąlygomis, reikia mažiausiai dviejų savaičių.

Taigi, embriono kepenys skiriasi nuo kitų kraujodaros kamieninių ląstelių šaltinių didesniu tiek įsipareigojusių, tiek ankstyvųjų kraujodaros kamieninių ląstelių kiekiu. Kultūroje su augimo faktoriais embriono kepenų ląstelės, turinčios CD34+CD45Ra1 CD71l0W fenotipą, sudaro 30 kartų daugiau kolonijų nei panašios virkštelės kraujo ląstelės ir 90 kartų daugiau nei kaulų čiulpų HSC. Ryškiausi nurodytų šaltinių skirtumai yra ankstyvųjų kraujodaros kamieninių ląstelių, kurios sudaro mišrias kolonijas, kiekyje – CFU-GEMM kiekis embriono kepenyse atitinkamai 60 ir 250 kartų viršija virkštelės kraujyje ir kaulų čiulpuose esančių ląstelių kiekį.

Taip pat svarbu, kad iki 18-osios embriono vystymosi savaitės (kraujodaros pradžios kaulų čiulpuose laikotarpis) daugiau nei 60% kepenų ląstelių dalyvauja kraujodaros funkcijos įgyvendinime. Kadangi žmogaus vaisius iki 13-osios vystymosi savaitės neturi užkrūčio liaukos ir atitinkamai timocitų, kraujodaros ląstelių transplantacija iš 6–12 nėštumo savaitės embrioninių kepenų žymiai sumažina „transplantato prieš šeimininką“ reakcijos riziką ir nereikalauja histologiškai suderinamo donoro parinkimo, nes tai leidžia gana lengvai pasiekti kraujodaros chimerizmą.