Dirbtiniai širdies vožtuvai

Šiuolaikiniai biologiniai dirbtiniai širdies vožtuvai, skirti klinikiniam naudojimui, išskyrus plaučių autotransplantatą, yra negyvybingos struktūros, neturinčios augimo ir audinių atsistatymo potencialo. Tai kelia didelių apribojimų jų naudojimui vožtuvų patologijos korekcijai, ypač vaikams. Audinių inžinerija vystėsi per pastaruosius 15 metų. Šios mokslinės krypties tikslas – dirbtinėmis sąlygomis sukurti tokias struktūras kaip dirbtiniai širdies vožtuvai su trombams atspariu paviršiumi ir gyvybingu intersticiniu audiniu.

[ 1 ], [ 2 ]

Kaip kuriami dirbtiniai širdies vožtuvai?

Mokslinė audinių inžinerijos koncepcija pagrįsta gyvų ląstelių (fibroblastų, kamieninių ląstelių ir kt.) apgyvendinimo ir auginimo sintetiniame arba natūraliame absorbuojamame karkase (matricoje), kuris yra trimatė vožtuvo struktūra, idėja, taip pat signalų, reguliuojančių genų raišką, organizaciją ir persodintų ląstelių produktyvumą tarpląstelinės matricos formavimosi laikotarpiu, panaudojimu.

Tokie dirbtiniai širdies vožtuvai integruojami su paciento audiniais, kad būtų galutinai atkurta ir toliau palaikoma jų struktūra bei funkcija. Šiuo atveju, veikiant ląstelėms (fibroblastams, miofibroblastams ir kt.), ant pradinės matricos susidaro naujas kolageno-elastino karkasas arba, tiksliau sakant, tarpląstelinė matrica. Dėl to optimalūs audinių inžinerijos būdu sukurti dirbtiniai širdies vožtuvai savo anatomine struktūra ir funkcija turėtų būti artimi natūraliems, taip pat pasižymėti biomechaniniu prisitaikymu, gebėjimu atsistatyti ir augti.

Audinių inžinerija kuria dirbtinius širdies vožtuvus, naudodama įvairius ląstelių surinkimo šaltinius. Taigi, gali būti naudojamos ksenogeninės arba alogeninės ląstelės, nors pirmosios yra susijusios su zoonozių perdavimo žmonėms rizika. Genetiškai modifikuojant alogenines ląsteles, galima sumažinti antigeniškumą ir užkirsti kelią organizmo atmetimo reakcijoms. Audinių inžinerijai reikalingas patikimas ląstelių šaltinis. Toks šaltinis yra autogeninės ląstelės, paimtos tiesiai iš paciento ir reimplantacijos metu nesukeliančios imuninių reakcijų. Efektyvūs dirbtiniai širdies vožtuvai gaminami remiantis autologinėmis ląstelėmis, gautomis iš kraujagyslių (arterijų ir venų). Grynoms ląstelių kultūroms gauti sukurtas metodas, pagrįstas fluorescencijos aktyvuoto ląstelių rūšiavimo (FACS) naudojimu. Iš kraujagyslės gauta mišri ląstelių populiacija žymima acetilintu mažo tankio lipoproteinų žymekliu, kuris selektyviai absorbuojamas endotelio ląstelių paviršiuje. Tada endotelio ląsteles galima lengvai atskirti nuo iš kraujagyslių gautų ląstelių masės, kuri bus lygiųjų raumenų ląstelių, miofibroblastų ir fibroblastų mišinys. Ląstelių šaltinis – arterija ar vena – turės įtakos galutinės konstrukcijos savybėms. Taigi, dirbtiniai širdies vožtuvai su matrica, pasėta veninėmis ląstelėmis, yra pranašesni kolageno formavimosi ir mechaninio stabilumo požiūriu, palyginti su konstrukcijomis, pasėtomis arterinėmis ląstelėmis. Atrodo, kad periferinių venų pasirinkimas yra patogesnis ląstelių surinkimo šaltinis.

Miofibroblastus taip pat galima gauti iš miego arterijų. Tačiau iš kraujagyslių gautos ląstelės turi žymiai kitokių savybių nei natūralios intersticinės ląstelės. Kaip alternatyvus ląstelių šaltinis gali būti naudojamos autologinės virkštelės ląstelės.

Dirbtiniai širdies vožtuvai, paremti kamieninėmis ląstelėmis

Pastaraisiais metais kamieninių ląstelių tyrimai paskatino audinių inžinerijos pažangą. Raudonųjų kaulų čiulpų kamieninių ląstelių naudojimas turi savo privalumų. Visų pirma, biomedžiagų surinkimo ir kultivavimo in vitro paprastumas bei vėlesnė diferenciacija į įvairių tipų mezenchimines ląsteles leidžia išvengti nepažeistų kraujagyslių naudojimo. Kamieninės ląstelės yra pluripotentiniai ląstelių linijų šaltiniai ir pasižymi unikaliomis imunologinėmis savybėmis, kurios prisideda prie jų stabilumo alogeninėmis sąlygomis.

Žmogaus raudonųjų kaulų čiulpų kamieninės ląstelės gaunamos atliekant krūtinkaulio arba klubakaulio keteros punkcijos procedūrą. Jos išskiriamos iš 10–15 ml krūtinkaulio aspirato, atskiriamos nuo kitų ląstelių ir kultivuojamos. Surinkus reikiamą ląstelių skaičių (paprastai per 21–28 dienas), jos pasėjamos (kolonizuojamos) ant matricų ir kultivuojamos maitinamojoje terpėje statinėje padėtyje (7 dienas drėkinamoje inkubatoriuje 37 °C temperatūroje, esant 5 % CO2). Vėliau ląstelių augimas stimuliuojamas per maistinę terpę (biologiniai dirgikliai) arba sudarant fiziologines sąlygas audinių augimui izometrinės deformacijos metu reprodukcijos aparate su pulsuojančiu srautu – bioreaktoriuje (mechaniniai dirgikliai). Fibroblastai yra jautrūs mechaniniams dirgikliams, kurie skatina jų augimą ir funkcinį aktyvumą. Pulsuojantis srautas sukelia tiek radialinių, tiek apskritiminių deformacijų padidėjimą, dėl ko apgyvendintos ląstelės orientuojasi (pailgėja) tokių įtempių kryptimi. Tai savo ruožtu lemia orientuotų vožtuvų skaidulinių struktūrų susidarymą. Pastovus srautas sukelia tik tangentinius įtempius sienelėse. Pulsuojantis srautas teigiamai veikia ląstelių morfologiją, proliferaciją ir tarpląstelinės matricos sudėtį. Maistinės terpės srauto pobūdis, fizikocheminės sąlygos (pH, pO2 ir pCO2) bioreaktoriuje taip pat reikšmingai veikia kolageno gamybą. Taigi, laminarinis srautas, ciklinės sūkurinės srovės padidina kolageno gamybą, o tai pagerina mechanines savybes.

Kitas audinių struktūrų auginimo būdas – sukurti embrionines sąlygas bioreaktoriuje, o ne imituoti žmogaus kūno fiziologines sąlygas. Kamieninių ląstelių pagrindu išauginti audinių biovožtuvai turi mobilius ir lanksčius atvartus, funkciškai gebančius veikti esant aukštam slėgiui ir srautui, viršijančiam fiziologinį lygį. Šių struktūrų atvartų histologiniai ir histocheminiai tyrimai parodė aktyvius matricos biodestrukcijos ir jos pakeitimo gyvybingu audiniu procesus. Audinys yra sluoksniuotas, o tarpląstelinės matricos baltymų savybės panašios į natyvaus audinio, yra I ir III tipo kolageno bei glikozaminoglikanų. Tačiau tipinė trijų sluoksnių atvartų struktūra – skilvelių, kempinės ir skaidulinis sluoksniai – nebuvo gauta. Visuose fragmentuose rastos ASMA teigiamos ląstelės, ekspresuojančios vimentiną, turėjo panašias savybes kaip ir miofibroblastai. Elektroninė mikroskopija atskleidė ląstelinius elementus, turinčius gyvybingiems, sekretuojančiai aktyviems miofibroblastams būdingų požymių (aktino/miozino filamentai, kolageno siūlai, elastinas), ir endotelio ląsteles audinio paviršiuje.

Ant lapelių buvo aptikti I ir III tipo kolageno, ASMA ir vimentino. Audinių ir natūralių struktūrų lapelių mechaninės savybės buvo panašios. Dirbtiniai audinių širdies vožtuvai per 20 savaičių veikė puikiai ir savo mikrostruktūra, biocheminiu profiliu ir baltymų matricos formavimusi priminė natūralias anatomines struktūras.

Visi audinių inžinerijos būdu gauti dirbtiniai širdies vožtuvai gyvūnams buvo implantuoti plaučių padėtyje, nes jų mechaninės savybės neatitinka apkrovų aortos padėtyje. Iš gyvūnų ištraukti audinių vožtuvai savo struktūra yra artimi natūraliems, o tai rodo jų tolesnį vystymąsi ir restruktūrizavimąsi in vivo. Ar audinių restruktūrizacijos ir brendimo procesas tęsis fiziologinėmis sąlygomis po dirbtinių širdies vožtuvų implantavimo, kaip buvo pastebėta atliekant eksperimentus su gyvūnais, parodys tolesni tyrimai.

Idealūs dirbtiniai širdies vožtuvai turėtų turėti bent 90 % poringumą, nes tai būtina ląstelių augimui, maistinių medžiagų tiekimui ir ląstelių medžiagų apykaitos produktų pašalinimui. Be biologinio suderinamumo ir biologinio skaidumo, dirbtiniai širdies vožtuvai turėtų turėti chemiškai palankų paviršių ląstelių sėjimui ir atitikti natūralaus audinio mechanines savybes. Matricos biologinio skaidymo lygis turėtų būti kontroliuojamas ir proporcingas naujų audinių formavimosi lygiui, kad būtų užtikrintas mechaninis stabilumas laikui bėgant.

Šiuo metu kuriamos sintetinės ir biologinės matricos. Dažniausios biologinės medžiagos matricoms kurti yra donorinės anatominės struktūros, kolagenas ir fibrinas. Polimeriniai dirbtiniai širdies vožtuvai kuriami taip, kad po implantacijos biologiškai suirtų, kai implantuotos ląstelės pradeda gaminti ir organizuoti savo tarpląstelinį matricos tinklą. Naujo matricos audinio formavimąsi gali reguliuoti arba skatinti augimo faktoriai, citokinai arba hormonai.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Donoro dirbtiniai širdies vožtuvai

Kaip matricos gali būti naudojami donoriniai dirbtiniai širdies vožtuvai, gauti iš žmonių ar gyvūnų ir iš kurių deceluliarizacijos būdu pašalinti ląsteliniai antigenai, siekiant sumažinti jų imunogeniškumą. Konservuoti tarpląstelinės matricos baltymai yra pagrindas vėlesniam pasėtų ląstelių sukibimui. Yra šie ląstelinių elementų pašalinimo (aceliuliarizacijos) metodai: užšaldymas, apdorojimas tripsinu/EDTA, plovikliais – natrio dodecilsulfatu, natrio deoksikolatu, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, taip pat daugiapakopiai fermentiniai apdorojimo metodai. Šiuo atveju pašalinamos ląstelių membranos, nukleorūgštys, lipidai, citoplazminės struktūros ir tirpios matricos molekulės, išsaugant kolageną ir elastiną. Tačiau idealus metodas dar nerastas. Tik natrio dodecilsulfatas (0,03–1 %) arba natrio deoksikolatas (0,5–2 %) lėmė visišką ląstelių pašalinimą po 24 val. apdorojimo.

Histologinis pašalintų decelularizuotų biovožtuvų (alotransplantato ir ksenotransplantato) tyrimas atliekant eksperimentą su gyvūnais (šunimis ir kiaulėmis) parodė dalinę endotelizaciją ir recipientų miofibroblastų įaugimą į pagrindą, be kalcifikacijos požymių. Pastebėta vidutinė uždegiminė infiltracija. Tačiau klinikinių decelularizuoto „SynerGraftTM“ vožtuvo tyrimų metu išsivystė ankstyvas nepakankamumas. Bioprotezės matricoje nustatyta ryški uždegiminė reakcija, kuri iš pradžių buvo nespecifinė ir lydima limfocitinės reakcijos. Per vienerius metus išsivystė bioprotezės disfunkcija ir degeneracija. Matricos ląstelių kolonizacijos nepastebėta, tačiau aptikta vožtuvų kalcifikacija ir preimplantacinių ląstelių likučiai.

Ląstelinės matricos, pasėtos endotelio ląstelėmis ir kultivuotos in vitro bei in vivo, suformavo koherentinį sluoksnį ant vožtuvų paviršiaus, o pasėtos natūralios struktūros intersticinės ląstelės pademonstravo savo gebėjimą diferenciuotis. Tačiau bioreaktoriaus dinaminėmis sąlygomis nepavyko pasiekti reikiamo fiziologinio ląstelių kolonizacijos lygio ant matricos, o implantuoti dirbtiniai širdies vožtuvai gana greitai (tris mėnesius) sustorėjo dėl pagreitėjusios ląstelių proliferacijos ir tarpląstelinės matricos susidarymo. Taigi, šiame etape donorinių ląstelių neturinčių matricų naudojimas jų kolonizacijai ląstelėmis turi nemažai neišspręstų problemų, įskaitant imunologines ir infekcines; darbas su deceluliarizuotais bioprotezais tęsiamas.

Reikėtų pažymėti, kad kolagenas taip pat yra viena iš potencialių biologinių medžiagų, skirtų biologiškai skaidomoms matricoms gaminti. Jis gali būti naudojamas putų, gelio ar plokštelių, kempinių pavidalu ir kaip pluošto pagrindo ruošinys. Tačiau kolageno naudojimas yra susijęs su daugybe technologinių sunkumų. Visų pirma, jį sunku gauti iš paciento. Todėl šiuo metu dauguma kolageno matricų yra gyvūninės kilmės. Lėtas gyvūninio kolageno biologinis skaidymas gali padidinti zoonozių riziką, sukelti imunologines ir uždegimines reakcijas.

Fibrinas yra dar viena biologinė medžiaga, pasižyminti kontroliuojamomis biologinio skaidymo savybėmis. Kadangi iš paciento kraujo galima pagaminti fibrino gelius, iš kurių vėliau gaminama autologinė matrica, tokios struktūros implantavimas nesukels toksinio jos skaidymo ir uždegiminės reakcijos. Tačiau fibrinas turi tokių trūkumų kaip difuzija ir išplovimas į aplinką bei prastos mechaninės savybės.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Dirbtiniai širdies vožtuvai, pagaminti iš sintetinių medžiagų

Dirbtiniai širdies vožtuvai taip pat gaminami iš sintetinių medžiagų. Keletas bandymų gaminti vožtuvų matricas buvo pagrįsti poliglaktino, poliglikolio rūgšties (PGA), polilaktinės rūgšties (PLA), PGA ir PLA kopolimero (PLGA) bei polihidroksialkanoatų (PHA) naudojimu. Labai porėta sintetinė medžiaga gali būti gauta iš pinto arba nepinto pluošto ir naudojant druskos išplovimo technologiją. Perspektyvi kompozicinė medžiaga (PGA/P4HB) matricų gamybai gaunama iš nepintų poliglikolio rūgšties (PGA) kilpų, padengtų poli-4-hidroksibutiratu (P4HB). Iš šios medžiagos pagaminti dirbtiniai širdies vožtuvai sterilizuojami etileno oksidu. Tačiau didelis pradinis šių polimerų kilpų standumas ir storis, jų greitas ir nekontroliuojamas skaidymasis, lydimas rūgštinių citotoksinių produktų išsiskyrimo, reikalauja tolesnių tyrimų ir kitų medžiagų paieškos.

Autologinių miofibroblastų audinių kultūros plokštelių, kultivuojamų ant karkaso, naudojimas atraminėms matricoms formuoti, stimuliuojant šių ląstelių gamybą, leido gauti vožtuvų mėginius su aktyviomis gyvybingomis ląstelėmis, apsuptomis tarpląsteline matrica. Tačiau šių vožtuvų audinių mechaninės savybės vis dar nepakankamos jų implantavimui.

Reikiamas kuriamo vožtuvo proliferacijos ir audinių regeneracijos lygis gali būti nepasiektas vien tik ląstelių ir matricos deriniu. Ląstelių genų raišką ir audinių formavimąsi galima reguliuoti arba skatinti pridedant augimo faktorių, citokinų ar hormonų, mitogeninių faktorių ar adhezijos faktorių prie matricų ir karkasų. Tiriama galimybė įvesti šiuos reguliatorius į matricos biomedžiagas. Apskritai labai trūksta tyrimų apie audinių vožtuvo formavimosi reguliavimą biocheminiais stimulais.

Acelulinė kiaulių ksenogeninė plaučių bioprotezė „Matrix P“ sudaryta iš decelulinio audinio, apdoroto specialia patentuota „AutoTissue GmbH“ procedūra, įskaitant gydymą antibiotikais, natrio deoksicholatu ir alkoholiu. Šis apdorojimo metodas, patvirtintas Tarptautinės standartizacijos organizacijos, pašalina visas gyvas ląsteles ir poląstelines struktūras (fibroblastus, endotelio ląsteles, bakterijas, virusus, grybelius, mikoplazmą), išsaugo tarpląstelinės matricos architektūrą, sumažina DNR ir RNR kiekį audiniuose iki minimumo, o tai sumažina iki nulio kiaulių endogeninio retroviruso (PERV) perdavimo žmonėms tikimybę. „Matrix P“ bioprotezė sudaryta tik iš kolageno ir elastino su išsaugota struktūrine integracija.

Avių eksperimentuose, praėjus 11 mėnesių po „Matrix P“ bioprotezo implantavimo, užfiksuota minimali aplinkinių audinių reakcija, o išgyvenamumas buvo geras, ypač blizgančiame vidiniame endokardo paviršiuje. Uždegiminių reakcijų, vožtuvų lapelių sustorėjimo ir sutrumpėjimo praktiškai nebuvo. Taip pat užfiksuotas mažas audinių kalcio kiekis „Matrix P“ bioproteze, skirtumas, palyginti su tais, kurie buvo gydyti glutaraldehidu, buvo statistiškai reikšmingas.

„Matrix P“ dirbtinis širdies vožtuvas prisitaiko prie individualaus paciento būklės per kelis mėnesius po jo implantavimo. Kontrolinio laikotarpio pabaigoje atliktas tyrimas parodė nepažeistą tarpląstelinę matricą ir susiliejusį endotelį. „Matrix R“ ksenotransplantatas, implantuotas 50 pacientų, turinčių įgimtų defektų, Ross procedūros metu nuo 2002 iki 2004 m., pasižymėjo geresniu veikimu ir mažesniais transvožtuvinio slėgio gradientais, palyginti su kriokonservuotais ir decelularizuotais „SynerGraftMT“ alograftais bei glutaraldehidu apdorotais bioprotezais be karkaso. „Matrix P“ dirbtiniai širdies vožtuvai skirti plaučių vožtuvo pakeitimui rekonstruojant dešiniojo skilvelio ištekėjimo traktą chirurgijos metu dėl įgimtų ir įgytų defektų, taip pat plaučių vožtuvo keitimo metu Ross procedūros metu. Jie tiekiami 4 dydžių (pagal vidinį skersmenį): naujagimiams (15–17 mm), vaikams (18–21 mm), vidutinio dydžio (22–24 mm) ir suaugusiesiems (25–28 mm).

Audinių inžinerijos būdu sukurtų vožtuvų kūrimo pažanga priklausys nuo vožtuvų ląstelių biologijos pažangos (įskaitant genų raiškos ir reguliavimo klausimus), embriogeninio ir su amžiumi susijusio vožtuvų vystymosi tyrimų (įskaitant angiogeninius ir neurogeninius veiksnius), tikslių kiekvieno vožtuvo biomechanikos žinių, tinkamų ląstelių sėjimui identifikavimo ir optimalių matricų sukūrimo. Tolesnei pažangesnių audinių vožtuvų kūrimui reikės nuodugniai suprasti ryšį tarp natūralių vožtuvų mechaninių ir struktūrinių savybių bei stimulų (biologinių ir mechaninių), skirtų šioms savybėms atkurti in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]