Fermentų ir citokinų vaidmuo osteoartrito patogenezėje

Pastaraisiais metais daugelis tyrimų buvo nukreipti į proteazių, atsakingų už sąnarių kremzlių ECM skilimą osteoartritu, nustatymą. Remiantis šiuolaikinėmis idėjomis, svarbų vaidmenį osteoartrito patogenezėje atlieka matricos metaloproteazės (MMP). Pacientams, sergantiems osteoartritu, padidėjo trys MMP atstovai - kolagenazės, stromelizinai ir želatinazės. Kolagenazės yra atsakinga už nevalyto kolageno, sromelizinui degradacijos - kolageno IV tipo, laminino ir proteoglikanų, azhelatinaza - už želatinos, kolageno IV degradacijos, Vh XI tipai elastino. Be to, yra kito fermento agerkanazės, turinčios MMP savybes, buvimas ir yra atsakingas už protezuojančią kremzlių proteoglikano agregatus.

Sąnarių kremzlių žmogaus kolagenazės nustatė tris rūšis lygius, kurie yra padidėjusi pacientams, osteoartrito - kolagenazės-1 (MMP-1), kolagenazės-2 (MMP-8), kolagenazės-3 (MMP-13). Trijų skirtingų kolagenazių tipų košmiaštis sąnarių kremzlėje rodo, kad kiekvienas iš jų turi savo specifinį vaidmenį. Iš tiesų, kolagenazės-1 ir -2 yra lokalizuota daugiausia pavirłiniai ir viršutinės tarpinės zonos sąnario kremzlės, o kolagenazės-3 randamas tarpinių ir giliai zonose apačioje. Be to, Imunohistocheminių tyrimų rezultatai parodė, kad per osteoartrito lygio kolagenazės-3 progresavimo pasiekia plato ar net mažėja, o kolagenazės-1 lygio palaipsniui didinama. Yra įrodymų, kad osteoartrito kolagenazės-1 yra daugiausia dalyvauja uždegimo procese sąnarinės kremzlės, o kolagenazės-3 - audinių rekonstruoti. Kartlaginas-3, išreikštas OA sergančių pacientų kremzliais, II tipo kolageno skilimą intensyviau atlieka, nei kolagenazė-1.

Iš antrosios grupės atstovų metaloproteinazės žmogaus stromelizinovu kaip nustatyta, trijų - stromelizinas-1 (MMP-3), stromelizino-2 (MMP-10) ir stromeliziną-3 (MMP-11). Šiandien žinoma, kad patologinis procesas osteoartritu yra susijęs tik su stromelizinu-1. Į sinovinio membranos pacientams, sergantiems osteoartritu nėra nustatomas stromeliziną-2, bet ji yra nustatyta, labai mažais kiekiais sinovinių fibroblastų pacientams, sergantiems reumatoidinio artrito. Stromelizinas-3 taip pat randamas pacientų, sergančių reumatoidiniu artritu, netoli fibroblastų, ypač fibrozės zonose, sinovijos membranoje.

Į želatinazių į žmogaus kremzlinio audinio grupė nustatė tik du - 92 kDa, želatinaze (želatinaze B arba MMP-9) ir 72 kDa, želatinaze (želatinaze A, arba MMP-2); pacientams, sergantiems osteoartritu, nustatyta 92 kD gelatinazės koncentracija.

Ne taip seniai buvo nustatyta kita MMP grupė, lokalizuota ant ląstelių membranų paviršiaus ir vadinama MMP membrana (MMP-MT). Šiai grupei priklauso keturi fermentai - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT išraiška randama žmogaus sąnario kremzlėje. Nors MMP-MT-1 turi kolagenazės savybes, tiek MMP-MT-1, tiek MMP-MT-2 gali aktyvuoti želatinazę-72 kD ir kolagenazę-3. Šios MMP grupės vaidmuo OA patogenezėje reikalauja tobulinimo.

Proteinazės išsiskiria kaip zymogenas, kuris aktyvuojamas kitų proteinazių arba organinių gyvsidabrio junginių. MMP katalizinis aktyvumas priklauso nuo cinko buvimo aktyvioje fermento zonoje.

MMP biologinį aktyvumą kontroliuoja specifiniai TIMP. Iki šiol buvo nustatyti trys TIMP tipai, kurie randami žmogaus sąnarių audiniuose, TIMP-1-TIMP-3. Ketvirtasis TIMP tipas identifikuojamas ir klonuojamas, tačiau jis dar nėra aptiktas žmogaus sąnario audiniuose. Šios molekulės konkrečiai jungiasi prie aktyviosios vietos MMP, nors kai kurie iš jų geba surišti aktyvios vietos, 72 kDa progelatinase (timp-2, -3, -4) ir 92 kDa progelatinase (TIMP 1 ir -3). Duomenys rodo, kad OA sąnarių kremzlės tarp MMP ir timps disbalanso, kad susidaro santykinio trūkumo inhibitorių, kad gali būti iš dalies yra susijusios su padidėjusiu, MMP aktyvumo audinyje. TIMP-1 ir -2 yra rasti sąnarių kremzlėje, jie sintezuojami chondrocitais. Su osteoartritu sinovio membranoje ir sinovijos skysčiuose buvo aptikta tik pirmojo tipo TIMP. TIMP-3 aptinka tik ECM. TIMP-4 beveik 50% turi beveik identišką aminorūgščių seką su TIMP-2 ir -ZINA apie 38% -STIMP-1. Kitų tikslinių ląstelių timp-4 yra atsakingas už aktyvavimo moduliacija progelatinase 72 kDa ląstelių paviršiaus, rodo svarbų vaidmenį kaip audinių specifinių ECM remodeling reguliatorius.

Kitas MMP biologinio aktyvumo kontrolės mechanizmas yra jų fiziologinis aktyvinimas. Manoma, kad fermentai iš serino ir cisteino proteazių šeimos, tokie kaip AP / plazminas ir katepsinas B, atitinkamai yra fiziologiniai MMP aktyvikliai. Osteoartrito pacientų sąnario kremzlėje nustatyta padidėjusi urokinazės (UAP) ir plazmino koncentracija.

Nepaisant to, kad jungtinių audiniuose randama keleto tipų katepsinų, katepsinas-B laikomas labiausiai tikėtinu MMP aktyvuotoju kremzlėje. Žmogaus sąnario audiniuose buvo nustatyti fiziologiniai serino ir cisteino proteazių inhibitoriai. Pacientams, sergantiems osteoartritu, inhibitoriaus AP-1 (IAP-1), taip pat cisteino proteazių aktyvumas sumažėja. Kaip ir MMP / TIMP, serino ir cisteino proteazių bei jų inhibitorių, kurie gali paaiškinti padidėjusį MMP aktyvumą osteoartrito pacientų sąnarių kremzlėje, disbalansas. Be to, MMP gali suaktyvinti vienas kitą. Pavyzdžiui, stromelizinas-1 aktyvina kolagenazę-1, kolageną-3 ir 92 kD želatinazę; Collagenase-3 aktyvuoja 92 kD želatinazę; MMP-MT aktyvuoja kolagenazę-3, o želatinazė-72 kD potencialiai aktyvina; MMP-MT taip pat aktyvuoja 72 kD želatinazę. Citokinai gali būti suskirstyti į tris grupes: destruktyvius (uždegiminius), reguliuojančius (įskaitant priešuždegiminius) ir anabolinius (augimo faktorius).

Citokinų tipai (pagal van den Berg WB ir kt.)

Sunaikink	Interleukinas-1 TNF-a Leukemija slopinantis faktorius Interleukinas-17
Reguliuojama	Interlekin-4 Interleukinas-10 Interleukinas-13 Fermentų inhibitoriai
Anabolinis	Mulsino tipo augimo veiksniai TFR-b Kaulų morfogenetiniai baltymai Morfogeneziniai baltymai, gauti iš kremzlės

Toksiškumo citokinai, visų pirma IL-1 sukeltas padidėjimą proteazių išleidimo ir slopina sintezę proteoglikanų ir kolagenai chondrocitų. Reguliavimo citokinai, ypač IL-4 ir -10, slopina IL-1 receptoriaus antagonisto gamybą, padidinti gamybą IL-1 (IL-1 RA), ir sumažinti lygio ir NO-sintazės aktyvumas į chondrocitų. Taigi, IL-4 antagonizmą IL-1 trimis būdais: 1) sumažina gamybą ir apsaugo nuo jos poveikį, 2) padidina pagrindinio "maitėda" IL-1Pa gamyba ir 3) sumažina pirminės antrinės "Messenger" »NE gamybą. Be to, IL-4 sumažina fermentinį audinio skilimą. In vivo sąlygomis optimalus terapinis poveikis pasiekiamas IL-4 ir IL-10 deriniu. Anabolinių veiksniai, tokie kakTFR-p, ir IGF-1, nėra iš tikrųjų trukdo su gamyba arba veiksmų IL-1, bet rodytų priešinga veiklos, pavyzdžiui, skatinti proteoglikanų ir kolageno sintezę, slopina proteazės aktyvumą ir TGF (3, taip pat slopina fermentų išsiskyrimą ir stimuliuoja jų inhibitorius.

Prouždegiminiai citokinai yra atsakingi už padidintą MMP sintezę ir ekspresiją sąnarių audiniuose. Jie sintetinami sinovijos membranoje, o paskui išsklaidomi į sąnarinį kremzlį per sinovijos skysčio. Prouždegiminiai citokinai aktyvina chondrocytus, kurie savo ruožtu taip pat gali gaminti uždegiminius citokinus. Osteoartrozės paveiktose sąnarėse uždegimo efektoriaus vaidmenį atlieka daugiausia sinovinės membranos ląstelės. Tai makrofagų tipo sinovitas, kuris išskiria proteazės ir uždegiminius tarpininkus. Tarp jų osteoartrito, IL-f, TNF-a, IL-6, leukemijos slopinamojo faktoriaus (LIF) ir IL-17 patologija yra didžiausia.

Biologiškai aktyvios medžiagos, skatinančios osteoartrito sąnarių kremzlių skilimą

• Interleukinas-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Kolonijas stimuliuojantys veiksniai: makrofagai (monocitai) ir granulocitų makrofagai
• Medžiaga P
• PGE ₂
• Plasminogeno (audinių ir urokinazės tipų) ir plazmino aktyvatoriai
• Metalloproteazės (kolagenazės, ellastasai, stromelizinai)
• Kathepsinai A ir B.
• trileris
• Bakteriniai lipopolisacharidai
• Fosfolipazė Ag

Literatūros duomenys rodo, kad IL-ip ir, galbūt, TNF-a yra pagrindiniai osteoartrito sąnarių audinių sunaikinimo tarpininkai. Tačiau dar nėra žinoma, ar jie veikia nepriklausomai vienas nuo kito, ar tarp jų yra funkcinė hierarchija. Modeliuose osteoartrito gyvūnų buvo parodyta, kad IL-1 blokados efektyviai apsaugo kremzlinės sunaikinimą, kadangi blokadą TNF-alfa veda prie uždegimo silpnėjimo bendruose audiniuose. Sinovijinės membranos, sinovijų skysčio ir pacientų kremzlės metu buvo nustatytos abiejų citokinų koncentracijos padidėjimas. Chondrocitų gali padidinti ne tik proteazių (MMP ir daugiausia AP), bet taip pat nedidelių kolagenų sintezę, pavyzdžiui, rūšių I ir III, taip pat sumažinti II ir IX kolageno tipų ir proteoglikanų sintezę. Šie citokinai taip pat stimuliuoja aktyvios deguonies rūšis ir uždegiminius tarpininkus, tokius kaip PGE ₂. Tokių makromolekulių pokyčių sąnario kremzlės į osteoartrito rezultatas yra neefektyvus remonto procesus, kurie veda prie tolesnio blogėjimo kremzlės.

Aukščiau minėti uždegimo citokinai moduliuoja MMP slopinimo / aktyvinimo procesus osteoartritu. Pavyzdžiui, tarp TIMP-1 lygio ir MMP į kremzlės osteoartrito disbalansas gali būti susijęs su IL-IP, nes tyrimas in vitro parodė, kad didinant koncentraciją IL-1beta sumažina TIMP-1 ir MMP koncentracija padidėjo sintezę chondrocitų. AP sintezė taip pat moduliuoja IL-1beta. Stimuliacija in vitro chondrocitų kremzlinės su IL-1 vyzyvet dozės priklausoma sintezėje ir aštriu AP sumažėjimo sintezės PAI-1. IL-1 gebėjimas sumažinti IAP-1 sintezę ir stimuliuoti AP sintezę yra galingas mechanizmas generuoti plazminą ir aktyvuoti MMP. Be to, plazminą yra ne tik fermentas aktyvuojant kitus fermentus, jis taip pat dalyvauja kremzlių degradacijos tiesioginiu proteolizė.

IL-IP yra sintetinamas, kaip neaktyvų pirmtako masės 31 kD (iš anksto-IL-IP), Azat, po to, kai skaldant signalinio peptido, yra paverčiamas į veikliąją citokino nuo 17,5 kD masės. Atsižvelgiant į tai, sąnarių, įskaitant sinovinio membranos ir sąnarių skysčio kremzlinės audinių, IL-IP aptikta aktyvios formos, ir tyrimų in vivo parodė, kad ši sinovinio membranos sugebėjimą osteoartrito sekretuoja šį citokiną. Kai serino proteazės gali konvertuoti prieš IL-ip į jo biologiškai aktyvią formą. Žinduolių, tokie savybės yra nustatyta tik viena proteazės, kuri priklauso cisteino aspartatspetsificheskih fermentų šeimai, vadinamai IL-1p-konvertuojančio fermento (IKF arba kaspazės-1). Šis fermentas yra galintis specifiškai konvertuoti iš anksto-IL-ip biologiškai aktyvų "subręsti" IL-IP su 17,5 kD masės. IKF - tai proenzyme, kurio molekulinė masė 45 kDa (p45), kuri yra lokalizuota ląstelių membranos. Po to, kai proenzima p45 proteolitinis skaldymas, kad sudarytų du subvienetus, žinomas kaip P10 ir P20, kuri yra būdinga fermentinio aktyvumo.

TNF-a taip pat sintezuojamas kaip membraninis junginys, kurio masė yra 26 kD; proteolitiniu skilimu, iš ląstelės išsiskiria kaip aktyvi tirpi medžiaga, kurios masė yra 17 kD. Proteolitinis skilimas atliekamas TNF-a konvertuojančio fermento (TNF-KF), kuris priklauso adamalizinų šeimai. AR Amin ir kiti jo autoriai (1997) nustatė didesnę TNF-CF mRNR ekspresiją osteoartrito pacientų sąnariniame kremzlyje.

Biologinis chondrocitų ir sinovitocitų aktyvinimas IL-1 ir TNF-a yra susijęs su specifiniais receptoriais ląstelių paviršiuje - IL-R ir TNF-R. Kiekvienam citokinui buvo nustatyti du receptorių tipai: I ir II tipų IL-IP ir TNF-P I (p55) ir II (p75) tipai. Norint perduoti signalus jungiamųjų audinių ląstelėse, atsako IL-1PI ir p55. I tipo IL-1P yra šiek tiek didesnė afinitetas IL-1beta nei IL-1a; II tipo IL-1P, atvirkščiai, turi didesnį IL-1a afinitetą nei IL-ip. Neaišku, ar IL-II II tipo II gali tarpininkauti IL-1 signalais, ar jis veikia tik konkurenciniu būdu slopindamas IL-1 prisijungimą prie IL-1PI tipo. Be hondroiitah ir sąnarių fibroblastų sergančiųjų osteoartritu rasti didelį kiekį IL-1PI ir P55, kuri savo ruožtu paaiškina didelį jautrumą šių ląstelių stimuliacija citokinai atitinkamas. Šis procesas lemia ir padidėjusią proteolitinių fermentų sekreciją, ir sąnarių kremzlių nykimą.

Neatmetama IL-6 dalyvavimas patologiniame procese osteoartritu. Ši prielaida pagrįsta šiomis pastabomis:

• IL-6 padidina uždegiminių ląstelių skaičių sinovijos membranoje,
• IL-6 stimuliuoja chondrocytų dauginimąsi,
• IL-6 pagerina IL-1 poveikį MMP sintezės ir slopinimo proteoglikanų sintezę padidėjimą.

Tačiau, IL-6 gali sukelti TIMP gamybą, tačiau neturi įtakos todėl MMP gamyba laikoma, kad ši citokinų dalyvauja izoliavimo nuo proteolitinei degradacijos sąnarinės kremzlės, kuris yra atliekamas per grįžtamojo ryšio mechanizmą procese.

Dar vienas IL-6 šeimos atstovas yra LIF - citokinų, kuris yra gaminamas chondrocitų, gautų iš pacientų su osteoartrito, reaguojant į stimuliavimo Pro-uždegiminių citokinų IL-IP ir TNF-a. LIF stimuliuoja proteoglikanų kremzlių rezorbciją, taip pat MMP ir NO produkcijos sintezę. Šio citokino vaidmuo osteoartritu nėra visiškai suprantamas.

IL-17 yra 20-30 kD homodimeras, turintis IL-1 panašų poveikį, bet daug mažiau ryškus. IL-17 stimuliuoja sintezę ir atpalaidavimą prouždegiminių citokinų, įskaitant IL-IP, TNF-a, IL-6 ir MMP į tikslines ląsteles, pavyzdžiui, žmogaus makrofagų skaičius. Be to, IL-17 stimuliuoja NO produkciją chondrocitais. Kaip ir LIF, IL-17 vaidmuo OA patogenezėje yra mažai ištirtas.

Neorganinis NO laisvasis radikalas vaidina svarbų vaidmenį sąnarių kremzlių skilimui su OA. Chondrocytai, gauti pacientams, sergantiems osteoartritu, gamina daugiau NO kaip spontaniškai, taip pat po stimuliavimo priešuždegiminiais citokinais, palyginti su įprastomis ląstelėmis. Didelės koncentracijos jokio aptikta sinovinio skysčio ir serume pacientams, sergantiems osteoartritu - yra padidėjusios raiškos ir sintezės sukeltos NO-sintazę (hNOC) rezultatas - fermentas, atsakingas už NO gamybai. Neseniai klonuota chondrocyte specifinių hNOC DNR, nustatyta fermento aminorūgščių seka. Aminorūgščių seka rodo 50% identiškumą ir 70% panašumą į hNOC, specifinį endotelio ir nervų audiniui.

NO slopina sąnario kremzlės ECM makromolekulių sintezę ir stimuliuoja MMP sintezę. Be to, padidėjus NO kiekiui, antrąsias sąnarius IL-IP (IL-1RA) sintezuoja chondrocitai. Taigi, IL-1 lygio padidėjimas ir IL-1 RA sumažėjimas sukelia chondrocytų NO hiperstimuliaciją, o tai, savo ruožtu, padidina kremzlės matricos skilimą. Buvo pranešimų apie gydomąjį poveikį in vivo selektyviam hNOC inhibitoriui dėl eksperimentinio osteoartrito progresavimo.

Natūralūs citokinų inhibitoriai gali tiesiogiai slopinti citokinų prisijungimą prie ląstelių membranų receptorių, mažinant jų uždegiminį aktyvumą. Natūralūs citokinų inhibitoriai gali būti suskirstyti į tris klases pagal jų veikimo būdą.

Pirmoji inhibitorių klasė apima receptorių antagonistus, kurie neleidžia ligandui prisijungti prie jo receptoriaus, konkuruojant su rišančia vieta. Iki šiol toks inhibitorius yra tik IL-1 - tai yra aukščiau minėtas IL-1 / ILIP IL-1 PA sistemos konkurencinis inhibitorius. IL-1 RA blokai daug iš poveikių, kad yra pastebėta, kad sąnarių audinių osteoartrito, įskaitant prostaglandinų sintezei sinovinių ląstelių, iš kolagenazės gamybą chondrocitų ir skilimo sąnario kremzlės į korpusą.

IL-1RA nustatomas įvairiomis formomis - viena tirpi medžiaga (rIL-1PA) ir du tarpeliu (μIL-lPAI ir μIL-1APAP). Tirpios IL-1RA formos afinitetas yra 5 kartus didesnis už tarptulingines formas. Nepaisant intensyvios mokslinės paieškos, pastarosios funkcija lieka nežinoma. Eksperimety in vitro parodė, kad IL-1beta veiklos reikiamos koncentracijos IL-1Pa slopinimą 10-100 kartus viršijančios būklių, ribą in vivo reikia tūkstanteriopai padidėjimą IL-1Pa koncentraciją. Šis faktas iš dalies gali paaiškinti santykinį IL-1 RA trūkumą ir IL-1 perteklių pacientų, sergančių osteoartritu, sinovija.

Antroji natūralių citokinų inhibitorių klasė yra tirpių citokinų receptorių. Tokių žmogaus inhibitorių, susijusių su osteoartroze, patogenezės pavyzdys yra pIL-1P ir pp55. Tirpūs receptoriai yra citokino sutrumpintas formas ir įprastų receptorių jungimosi prie citokino, jos užkerta kelią jų jungimosi prie membranos-susijęs receptorių tikslinių ląstelių, spręsdama mechanizmas konkurencinio antagonizmo.

Pagrindinis tirpių receptorių pirmtakas yra IL-1PP su membrana. RIL-IP priklausomybė IL-1 ir IL-1 PA atžvilgiu yra skirtinga. Pavyzdžiui, RIL-1RN turi didesnį trauka prie IL-1 p, nei prie IL-1 RA, ir RIL-1PI - eksponuoja didesnį giminingumą IL-1Pa nei IL-IP.

TNF, taip pat yra dviejų tipų tirpių receptorių - PP55 ir PP75, taip pat tirpių IL-1 receptorių, jie yra suformuotos "Shedding" (nuimti). In vivo, abu receptoriai randami pažeidžiamų sąnarių audiniuose. Aptariamas tirpių TNF receptorių vaidmuo osteoartrito patogenezėje. Manoma, kad mažos koncentracijos jie stabilizuoti trimatę struktūrą TNF ir padidinti pusinės biologiškai aktyvių citokinų, o didelės koncentracijos PP55 ir PP75 gali sumažinti TNF veiklą konkurencingoje antagonizmas. Matyt, pp75 gali veikti kaip TNF nešiklis, palengvinant jo prisijungimą prie membranos asocijuotojo receptoriaus.

Trečią natūralių citokinų inhibitorių klasę sudaro grupė priešuždegiminių citokinų, kurių sudėtyje yra TGF-beta, IL-4, IL-10 ir IL-13. Anti-uždegiminiai citokinai mažina pro-uždegimo, taip pat kai kurių proteazių gamybą, skatina IL-1RA ir TIMP gamybą.