Fermentų ir citokinų vaidmuo osteoartrito patogenezėje

Pastaraisiais metais tyrėjai daug dėmesio skyrė proteazių, atsakingų už sąnarinės kremzlės ECM degradaciją osteoartrito atveju, nustatymui. Remiantis šiuolaikinėmis koncepcijomis, matrikso metaloproteinazės (MMP) vaidina svarbų vaidmenį osteoartrito patogenezėje. Pacientams, sergantiems osteoartroze, nustatomas padidėjęs trijų MMP – kolagenazių, stromelizinų ir želatinazių – kiekis. Kolagenazė yra atsakinga už natūralaus kolageno degradaciją, stromelizinas – už IV tipo kolageno, proteoglikanų ir laminino, želatinazė – už želatinos, IV, Vh XI tipų kolageno, elastino degradaciją. Be to, daroma prielaida, kad yra ir kitas fermentas – agrekanazė, turinti MMP savybių ir atsakinga už kremzlinių proteoglikanų agregatų proteolizę.

Žmogaus sąnario kremzlėje nustatyti trys kolagenazių tipai, kurių kiekis pacientams, sergantiems osteoartritu, yra žymiai padidėjęs: kolagenazė-1 (MMP-1), kolagenazė-2 (MMP-8) ir kolagenazė-3 (MMP-13). Trijų skirtingų kolagenazių tipų sambūvis sąnario kremzlėje rodo, kad kiekvienas iš jų atlieka savo specifinį vaidmenį. Iš tiesų, kolagenazės-1 ir -2 daugiausia lokalizuojasi sąnario kremzlės paviršinėje ir viršutinėje tarpinėje zonoje, o kolagenazė-3 – apatinėje tarpinėje zonoje ir giliojoje zonoje. Be to, imunohistocheminio tyrimo rezultatai parodė, kad osteoartritui progresuojant, kolagenazės-3 lygis pasiekia plato ir netgi mažėja, o kolagenazės-1 lygis palaipsniui didėja. Yra įrodymų, kad osteoartrito atveju kolagenazė-1 daugiausia dalyvauja sąnario kremzlės uždegiminiame procese, o kolagenazė-3 – audinių pertvarkyme. Kolagenazė-3, ekspresuojama OA sergančių pacientų kremzlėje, intensyviau skaido II tipo kolageną nei kolagenazė-1.

Iš antrosios metaloproteazių grupės atstovų trys taip pat buvo identifikuoti žmogaus stromelizine: stromelizinas-1 (MMP-3), stromelizinas-2 (MMP-10) ir stromelizinas-3 (MMP-11). Šiandien žinoma, kad osteoartrozės patologiniame procese dalyvauja tik stromelizinas-1. Stromelizinas-2 neaptinkamas pacientų, sergančių osteoartritu, sinovinėje membranoje, tačiau labai mažais kiekiais jo randama reumatoidiniu artritu sergančių pacientų sinovinėje fibroblastuose. Stromelizinas-3 taip pat randamas pacientų, sergančių reumatoidiniu artritu, sinovinėje membranoje šalia fibroblastų, ypač fibrozės zonose.

Žmogaus kremzlės audinio želatinazių grupėje identifikuotos tik dvi: 92 kD želatinazė (želatinazė B arba MMP-9) ir 72 kD želatinazė (želatinazė A arba MMP-2); pacientams, sergantiems osteoartritu, nustatomas 92 kD želatinazės lygio padidėjimas.

Neseniai buvo identifikuota dar viena MMP grupė, lokalizuota ląstelių membranų paviršiuje ir vadinama membraninio tipo MMP (MMP-MT). Šiai grupei priklauso keturi fermentai – MMP-MT1 – MMP-MT-4. MMP-MT raiška nustatyta žmogaus sąnario kremzlėje. Nors MMP-MT-1 turi kolagenazės savybių, abu fermentai MMP-MT-1 ir MMP-MT-2 geba aktyvuoti želatinazę-72 kDa ir kolagenazę-3. Šios MMP grupės vaidmuo OA patogenezėje reikalauja patikslinimo.

Proteinazės išskiriamos zimogeno pavidalu, kurį aktyvuoja kitos proteinazės arba organiniai gyvsidabrio junginiai. MMP katalizinis aktyvumas priklauso nuo cinko buvimo aktyviojoje fermento zonoje.

MMP biologinį aktyvumą kontroliuoja specifiniai TIMP. Iki šiol nustatyti trys TIMP tipai, randami žmogaus sąnarių audiniuose: TIMP-1–TIMP-3. Ketvirtasis TIMP tipas buvo identifikuotas ir klonuotas, tačiau jis dar neaptiktas žmogaus sąnarių audiniuose. Šios molekulės specifiškai jungiasi prie MMP aktyviosios srities, nors kai kurios iš jų gali jungtis prie 72 kD progelatinazės (TIMP-2, -3, -4) ir 92 kD progelatinazės (TIMP-1 ir -3) aktyviosios srities. Įrodymai rodo, kad sergant osteoartritu (OA) sąnarių kremzlėje yra disbalansas tarp MMP ir TIMP, todėl susidaro santykinis inhibitorių trūkumas, galbūt iš dalies dėl padidėjusio aktyvių MMP kiekio audiniuose. TIMP-1 ir -2 randami sąnarių kremzlėje ir juos sintetina chondrocitai. Osteoartrozės atveju sinovinėje membranoje ir sinoviniame skystyje aptinkamas tik I tipo TIMP. TIMP-3 randamas tik išorinėje endotelio matricoje (ECM). TIMP-4 aminorūgščių seka beveik 50 % sutampa su TIMP-2 ir 38 % su TIMP-1. Kitose tikslinėse ląstelėse TIMP-4 yra atsakingas už 72 kD progelatinazės aktyvacijos moduliavimą ląstelės paviršiuje, o tai rodo svarbų vaidmenį kaip audinių specifinis ECM remodeliavimo reguliatorius.

Kitas MMP biologinio aktyvumo kontrolės mechanizmas yra jų fiziologinis aktyvavimas. Manoma, kad serino ir cisteino proteazių šeimos fermentai, tokie kaip atitinkamai AP/plazminas ir katepsinas B, yra fiziologiniai MMP aktyvatoriai. Padidėjęs urokinazės (uAP) ir plazmino kiekis nustatytas pacientų, sergančių osteoartritu, sąnarinėje kremzlėje.

Nepaisant to, kad sąnarių audiniuose randama keletas katepsinų tipų, katepsinas B laikomas labiausiai tikėtinu MMP aktyvatoriumi kremzlėje. Žmogaus sąnarių audiniuose aptikta fiziologinių serino ir cisteino proteazių inhibitorių. AP-1 inhibitoriaus (IAI-1), taip pat cisteino proteazių, aktyvumas pacientams, sergantiems osteoartritu, yra sumažėjęs. Panašiai kaip MMP/TIMP atveju, būtent disbalansas tarp serino ir cisteino proteazių bei jų inhibitorių gali paaiškinti padidėjusį MMP aktyvumą pacientų, sergančių osteoartritu, sąnarių kremzlėje. Be to, MMP gali aktyvuoti vienas kitą. Pavyzdžiui, stromelizinas-1 aktyvuoja kolagenazę-1, kolagenazę-3 ir 92 kD želatinazę; kolagenazė-3 aktyvuoja 92 kD želatinazę; MMP-MT aktyvuoja kolagenazę-3, o želatinazė-72 kDa sustiprina šį aktyvavimą; MMP-MT taip pat aktyvuoja želatinazę 72 kDa. Citokinus galima suskirstyti į tris grupes – destruktyvius (uždegiminius), reguliacinius (įskaitant priešuždegiminius) ir anabolinius (augimo faktorius).

Citokinų tipai (pagal van den Berg WB ir kt.)

Destruktyvus	Interleukinas-1 TNF-α Leukemiją slopinantis faktorius Interleukinas-17
Reguliavimo	Interleukinas-4 Interleukinas-10 Interleukinas-13 Fermentų inhibitoriai
Anaboliniai	Į insuliną panašūs augimo faktoriai TGF-b Kaulų morfogenetiniai baltymai Morfogenetiniai baltymai, gauti iš kremzlės

Destruktyvūs citokinai, ypač IL-1, sukelia proteazių išsiskyrimo padidėjimą ir slopina proteoglikanų bei kolageno sintezę chondrocituose. Reguliaciniai citokinai, ypač IL-4 ir IL-10, slopina IL-1 gamybą, padidina IL-1 receptoriaus antagonisto (IL-1RA) gamybą ir sumažina NO sintazės kiekį chondrocituose. Taigi, IL-4 neutralizuoja IL-1 trimis kryptimis: 1) sumažina gamybą, užkirsdamas kelią jo poveikiui, 2) padidina pagrindinio „griautojo“ IL-1RA gamybą ir 3) sumažina pagrindinio antrinio „pasiuntinio“ NO gamybą. Be to, IL-4 sumažina fermentinį audinių skaidymą. In vivo optimalus terapinis poveikis pasiekiamas derinant IL-4 ir IL-10. Anaboliniai veiksniai, tokie kaip TGF-β ir IGF-1, iš tikrųjų netrukdo IL-1 gamybai ar veikimui, bet pasižymi priešingu aktyvumu, pavyzdžiui, stimuliuoja proteoglikanų ir kolageno sintezę, slopina proteazių aktyvumą, o TGF-β taip pat slopina fermentų išsiskyrimą ir stimuliuoja jų inhibitorius.

Uždegimą skatinantys citokinai yra atsakingi už padidėjusią MMP sintezę ir ekspresiją sąnariniuose audiniuose. Jie sintetinami sinovinėje membranoje ir vėliau per sinovinį skystį difunduoja į sąnarinę kremzlę. Uždegimą skatinantys citokinai aktyvina chondrocitus, kurie savo ruožtu taip pat geba gaminti uždegimą skatinančius citokinus. Osteoartrozės pažeistuose sąnariuose uždegimo efektoriaus vaidmenį daugiausia atlieka sinovinės membranos ląstelės. Būtent makrofagų tipo sinovocitai išskiria proteazes ir uždegimo mediatorius. Iš jų labiausiai osteoartrozės patogenezėje „dalyvauja“ IL-f, TNF-α, IL-6, leukemijos slopinamasis faktorius (LIF) ir IL-17.

Biologiškai aktyvios medžiagos, skatinančios sąnarinės kremzlės irimą sergant osteoartritu

• Interleukinas-1
• Interleukinas-3
• Interleukinas-4
• TNF-α
• Kolonijas stimuliuojantys faktoriai: makrofagai (monocitai) ir granulocitai-makrofagai
• Medžiaga P
• ₂ puslapis
• Plazminogeno aktyvatoriai (audinių ir urokinazės tipo) ir plazminas
• Metaloproteinazės (kolagenazės, ellastazės, stromelizinai)
• Katepsinai A ir B
• Trilsinas
• Bakteriniai lipopolisacharidai
• Fosfolipazės Ag

Literatūros duomenys rodo, kad IL-1 ir, galbūt, TNF-α yra pagrindiniai sąnario audinių destrukcijos mediatoriai osteoartrito atveju. Tačiau vis dar nežinoma, ar jie veikia nepriklausomai vienas nuo kito, ar tarp jų yra funkcinė hierarchija. Osteoartrozės gyvūnų modeliai parodė, kad IL-1 blokada veiksmingai apsaugo nuo sąnario kremzlės destrukcijos, o TNF-α blokada tik sumažina uždegimą sąnario audiniuose. Padidėjusi abiejų citokinų koncentracija nustatyta pacientų sinovinėje membranoje, sinoviniame skystyje ir kremzlėje. Chondrocituose jie gali padidinti ne tik proteazių (daugiausia MMP ir AP), bet ir mažiau žinomų kolagenų, tokių kaip I ir III tipo, sintezę, ir sumažinti II ir IX tipo kolagenų bei proteoglikanų sintezę. Šie citokinai taip pat stimuliuoja reaktyviąsias deguonies formas ir uždegimo mediatorius, tokius kaip PGE2 _. Tokių makromolekulinių sąnario kremzlės pokyčių osteoartrito atveju rezultatas yra reparacinių procesų neefektyvumas, dėl kurio kremzlė dar labiau irsta.

Aukščiau paminėti uždegimą skatinantys citokinai moduliuoja MMP slopinimo / aktyvavimo procesus osteoartrito atveju. Pavyzdžiui, disbalansas tarp TIMP-1 ir MMP lygių kremzlėje osteoartrito atveju gali būti susijęs su IL-1, nes in vitro tyrimas parodė, kad padidėjusi IL-1 beta koncentracija lemia TIMP-1 koncentracijos sumažėjimą ir MMP sintezės padidėjimą chondrocituose. ŠP sintezę taip pat moduliuoja IL-1 beta. Sąnarinių kremzlių chondrocitų stimuliavimas IL-1 in vitro sukelia nuo dozės priklausomą ŠP sintezės padidėjimą ir staigų iAP-1 sintezės sumažėjimą. IL-1 gebėjimas sumažinti iAP-1 sintezę ir stimuliuoti ŠP sintezę yra galingas plazmino susidarymo ir MMP aktyvavimo mechanizmas. Be to, plazminas yra ne tik fermentas, aktyvuojantis kitus fermentus, bet ir dalyvauja kremzlės degradacijos procese tiesioginės proteolizės būdu.

IL-ip sintetinamas kaip neaktyvus pirmtakas, kurio masė yra 31 kD (pre-IL-ip), o po signalinio peptido skilimo paverčiamas aktyviu citokinu, kurio masė yra 17,5 kD. Sąnarių audiniuose, įskaitant sinovinę membraną, sinovinį skystį ir sąnarinę kremzlę, IL-ip randamas aktyvia forma, o in vivo tyrimai parodė sinovinės membranos gebėjimą sergant osteoartritu išskirti šį citokiną. Kai kurios serino proteazės geba konvertuoti pre-IL-ip į bioaktyvią formą. Žinduoliams tokios savybės buvo aptiktos tik vienoje proteazėje, kuri priklauso cisteino aspartato specifinių fermentų šeimai ir vadinama IL-1β konvertuojančiu fermentu (ICF arba kaspaze-1). Šis fermentas geba specifiškai konvertuoti pre-IL-ip į biologiškai aktyvų „subrendusį“ IL-ip, kurio masė yra 17,5 kD. ICF yra 45 kD proenzimas (p45), lokalizuotas ląstelės membranoje. Po proteolitinio p45 proenzimo skilimo susidaro du subvienetai, žinomi kaip p10 ir p20, kuriems būdingas fermentinis aktyvumas.

TNF-α taip pat sintetinamas kaip prie membranos surištas pirmtakas, kurio masė yra 26 kDa; proteolitinio skilimo būdu jis išsiskiria iš ląstelės kaip aktyvi tirpi forma, kurios masė yra 17 kDa. Proteolitinį skilimą atlieka TNF-α konvertuojantis fermentas (TNF-AC), priklausantis adamalizinų šeimai. AR Amin ir kt. (1997) nustatė padidėjusią TNF-AC mRNR raišką osteoartritu sergančių pacientų sąnario kremzlėje.

Chondrocitų ir sinovocitų biologinis aktyvavimas IL-1 ir TNF-α vyksta jiems prisijungiant prie specifinių receptorių ląstelės paviršiuje – IL-R ir TNF-R. Kiekvienam citokinui nustatyti dviejų tipų receptoriai – IL-IP I ir II tipai bei TNF-R I tipai (p55) ir II (p75). IL-1PI ir p55 yra atsakingi už signalo perdavimą sąnarių audinių ląstelėse. IL-1R I tipas turi šiek tiek didesnį afinitetą IL-1beta nei IL-1a; priešingai, IL-1R II tipas turi didesnį afinitetą IL-1a nei IL-ip. Lieka neaišku, ar IL-IP II tipas gali tarpininkauti IL-1 signalams, ar jis skirtas tik konkurenciniam IL-1 asociacijos su IL-1R I tipu slopinimui. Osteoartritu sergančių pacientų chondroitituose ir sinovijos fibroblastuose yra daug IL-1PI ir p55, o tai savo ruožtu paaiškina didelį šių ląstelių jautrumą atitinkamų citokinų stimuliacijai. Šis procesas lemia ir padidėjusią proteolitinių fermentų sekreciją, ir sąnarinės kremzlės irimą.

IL-6 dalyvavimo osteoartrito patologiniame procese negalima atmesti. Ši prielaida pagrįsta šiais stebėjimais:

• IL-6 padidina uždegiminių ląstelių skaičių sinovinėje membranoje,
• IL-6 stimuliuoja chondrocitų proliferaciją,
• IL-6 sustiprina IL-1 poveikį didinant MMP sintezę ir slopinant proteoglikanų sintezę.

Tačiau IL-6 gali sukelti TIMP gamybą, bet neturi įtakos MMP gamybai, todėl manoma, kad šis citokinas dalyvauja sąnarinės kremzlės proteolitinio skaidymo slopinimo procese, kuris atliekamas grįžtamojo ryšio mechanizmu.

Kitas IL-6 šeimos narys yra LIF – citokinas, kurį gamina iš osteoartroze sergančių pacientų gautų chondrocitų, reaguodami į uždegimą skatinančių citokinų IL-1p ir TNF-α stimuliaciją. LIF stimuliuoja kremzlės proteoglikanų rezorbciją, taip pat MMP sintezę ir NO gamybą. Šio citokino vaidmuo osteoartrito atveju nėra iki galo išaiškintas.

IL-17 yra 20–30 kD homodimeras, turintis panašų į IL-1 poveikį, bet daug mažiau ryškų. IL-17 stimuliuoja daugelio uždegimą skatinančių citokinų, įskaitant IL-1p, TNF-α, IL-6 ir MMP, sintezę ir išsiskyrimą tikslinėse ląstelėse, tokiose kaip žmogaus makrofagai. Be to, IL-17 stimuliuoja NO gamybą chondrocituose. Kaip ir LIF, IL-17 vaidmuo OA patogenezėje buvo mažai ištirtas.

Neorganinis laisvasis radikalas NO vaidina svarbų vaidmenį sąnarinės kremzlės irime sergant osteoartritu. Iš pacientų, sergančių osteoartritu, išskirti chondrocitai gamina didesnį NO kiekį tiek savaime, tiek po stimuliacijos uždegimą skatinančiais citokinais, palyginti su normaliomis ląstelėmis. Didelis NO kiekis nustatytas pacientų, sergančių osteoartritu, sinoviniame skystyje ir serume – tai padidėjusios indukuotos NO sintazės (hNOC), fermento, atsakingo už NO gamybą, raiškos ir sintezės rezultatas. Neseniai buvo klonuota chondrocitams būdingo hNOC DNR ir nustatyta fermento aminorūgščių seka. Aminorūgščių seka rodo 50 % identiškumą ir 70 % panašumą su endoteliui ir nerviniam audiniui būdingu hNOC.

NO slopina sąnarinės kremzlės ECM makromolekulių sintezę ir stimuliuoja MMP sintezę. Be to, padidėjusi NO gamyba yra susijusi su IL-IP antagonisto (IL-1RA) sintezės sumažėjimu chondrocituose. Taigi, padidėjęs IL-1 kiekis ir sumažėjęs IL-1RA kiekis sukelia NO hiperstimuliaciją chondrocituose, o tai savo ruožtu padidina kremzlės matricos irimą. Yra pranešimų apie selektyvaus hNOC inhibitoriaus terapinį poveikį in vivo eksperimentinės osteoartrozės progresavimui.

Natūralūs citokinų inhibitoriai gali tiesiogiai užkirsti kelią citokinams prisijungti prie ląstelių membranų receptorių, mažindami jų uždegimą skatinantį aktyvumą. Natūralius citokinų inhibitorius galima suskirstyti į tris klases pagal jų veikimo būdą.

Pirmajai inhibitorių klasei priklauso receptorių antagonistai, kurie neleidžia ligandui prisijungti prie receptoriaus, konkuruodami dėl prisijungimo vietos. Iki šiol toks inhibitorius rastas tik IL-1 – tai minėtas konkurencinis IL-1/ILIP sistemos IL-1 PA inhibitorius. IL-1 PA blokuoja daugelį poveikių, kurie stebimi sąnarių audiniuose sergant osteoartritu, įskaitant prostaglandinų sintezę sinovijos ląstelėse, kolagenazės gamybą chondrocituose ir sąnarinės kremzlės kaulų čiulpų irimą.

IL-1RA randamas skirtingomis formomis – viena tirpi (rIL-1RA) ir dvi tarpląstelinės (μIL-lPAI ir μIL-1RAP). Tirpios IL-1RA formos afinitetas yra 5 kartus didesnis nei tarpląstelinių formų. Nepaisant intensyvių mokslinių tyrimų, pastarosios funkcija lieka nežinoma. In vitro eksperimentai parodė, kad IL-1beta aktyvumui slopinti reikalinga 10–100 kartų didesnė IL-1RA koncentracija nei įprasta, o in vivo sąlygomis IL-1RA koncentracija turi būti tūkstantį kartų didesnė. Šis faktas gali iš dalies paaiškinti santykinį IL-1RA trūkumą ir IL-1 perteklių pacientų, sergančių osteoartritu, sinovijoje.

Antra natūralių citokinų inhibitorių klasė yra tirpūs citokinų receptoriai. Tokių inhibitorių, susijusių su osteoartrito patogeneze, pavyzdžiai žmonėms yra rIL-1R ir pp55. Tirpūs citokinų receptoriai yra sutrumpėjusios normalių receptorių formos; prisijungdami prie citokinų, jie neleidžia jiems prisijungti prie tikslinių ląstelių membranų receptorių, veikdami konkurencinio antagonizmo mechanizmu.

Pagrindinis tirpių receptorių pirmtakas yra su membrana susijungęs IL-1RP. rIL-IP afinitetas IL-1 ir IL-1RA yra skirtingas. Taigi, rIL-1RN turi didesnį afinitetą IL-1β nei IL-1RA, o rIL-1PI pasižymi didesniu afinitetu IL-1RA nei IL-ip.

Taip pat yra dviejų tipų tirpūs TNF receptoriai – pp55 ir pp75, kaip ir tirpūs IL-1 receptoriai, jie susidaro „išsilydymo“ būdu. In vivo abu receptoriai randami pažeistų sąnarių audiniuose. Tirpių TNF receptorių vaidmuo osteoartrito patogenezėje yra diskutuojamas. Manoma, kad mažomis koncentracijomis jie stabilizuoja trimatę TNF struktūrą ir padidina bioaktyvaus citokino pusinės eliminacijos laiką, o didelės pp55 ir pp75 koncentracijos gali sumažinti TNF aktyvumą dėl konkurencinio antagonizmo. Tikėtina, kad pp75 gali veikti kaip TNF nešiklis, palengvindamas jo prisijungimą prie su membrana susijusio receptoriaus.

Trečiąją natūralių citokinų inhibitorių klasę atstovauja priešuždegiminių citokinų grupė, kuriai priklauso TGF-beta, IL-4, IL-10 ir IL-13. Priešuždegiminiai citokinai mažina uždegimą skatinančių ir kai kurių proteazių gamybą ir stimuliuoja IL-1RA bei TIMP gamybą.