Ląstelių transplantacijos apribojimai, pavojai ir komplikacijos

Regeneracinė plastinė medicina pagrįsta embrioninių ir progenitorinių kamieninių ląstelių toti- ir pluripotentinių savybių klinikiniu įgyvendinimu, kurios leidžia in vitro ir in vivo sukurti specifines ląstelių linijas, kurios atkuria pažeistus sergančio žmogaus audinius ir organus.

Reali galimybė panaudoti žmogaus embrionines kamienines ląsteles ir galutinių audinių kamienines ląsteles (vadinamąsias „suaugusiųjų“ kamienines ląsteles) terapiniais tikslais nebėra abejonių. Tačiau JAV Nacionalinės ir Medicinos akademijų („Kamieninės ląstelės ir būsimoji regeneracinė medicina“, „National Academy Press“) bei JAV Nacionalinio sveikatos instituto („Kamieninės ląstelės ir būsimosios tyrimų kryptys“, „Nat. Inst, of Health USA“) ekspertai rekomenduoja atlikti išsamesnį kamieninių ląstelių savybių tyrimą eksperimentuose su atitinkamais biologiniais modeliais ir objektyviai įvertinti visas transplantacijos pasekmes, o tik tada naudoti kamienines ląsteles klinikoje.

Nustatyta, kad kamieninės ląstelės yra visų trijų gemalinių sluoksnių audinių darinių dalis. Kamieninių ląstelių randama tinklainėje, ragenoje, odos epidermyje, kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje, kraujagyslėse, dantų minkštime, inkstuose, virškinimo trakto epitelyje, kasoje ir kepenyse. Naudojant šiuolaikinius metodus, įrodyta, kad nervinės kamieninės ląstelės yra lokalizuotos suaugusiojo smegenyse ir nugaros smegenyse. Šie sensacingi duomenys sulaukė ypatingo mokslininkų ir žiniasklaidos dėmesio, nes smegenų neuronai buvo klasikinis statinės ląstelių populiacijos, kuri neatsistato, pavyzdys. Tiek ankstyvuoju, tiek vėlyvuoju ontogenezės laikotarpiu dėl nervinių kamieninių ląstelių gyvūnų ir žmonių smegenyse susidaro neuronai, astrocitai ir oligodendrocitai (Kamieninės ląstelės: mokslo pažanga ir būsimos tyrimų kryptys. Nat. Inst, of Health USA).

Tačiau normaliomis sąlygomis galutinių audinių kamieninių ląstelių plastiškumas nepasireiškia. Norint realizuoti galutinių audinių kamieninių ląstelių plastinį potencialą, jas reikia izoliuoti, o vėliau kultivuoti terpėse su citokinais (LIF, EGF, FGF). Be to, kamieninių ląstelių dariniai sėkmingai prigiję tik persodinami į gyvūno, kurio imuninė sistema yra nusilpusi, organizmą (γ-švitinimas, citostatikai, busulfanas ir kt.). Iki šiol negauta įtikinamų įrodymų apie kamieninių ląstelių plastiškumo taikymą gyvūnams, kurie nebuvo veikiami spinduliuotės ar kitokio poveikio, sukeliančio gilų imunosupresiją.

Tokiomis sąlygomis pavojingas ESC potencialas pirmiausia pasireiškia jų transplantacijos į ektopines sritis metu – imunodeficitinėms pelėms po oda suleidžiant ESC, injekcijos vietoje susidaro teratokarcinomos. Be to, žmogaus embriono vystymosi metu chromosomų anomalijų dažnis yra didesnis nei gyvūnų embriogenezės metu. Blastocistos stadijoje tik 20–25 % žmogaus embrionų sudaro ląstelės su normaliu kariotipu, o didžioji dauguma ankstyvųjų žmogaus embrionų, gautų po apvaisinimo mėgintuvėlyje, pasižymi chaotišku chromosomų mozaikizmu ir labai dažnai susiduria su skaitinėmis ir struktūrinėmis aberacijomis.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Kamieninių ląstelių teigiamas poveikis

Preliminarūs klinikinių tyrimų rezultatai patvirtina teigiamą kamieninių ląstelių poveikį pacientui, tačiau vis dar nėra informacijos apie ilgalaikį ląstelių transplantacijos poveikį. Iš pradžių literatūroje vyravo pranešimai apie teigiamus embrioninių smegenų fragmentų transplantacijos rezultatus sergant Parkinsono liga, tačiau vėliau pradėjo atsirasti duomenų, paneigiančių veiksmingą terapinį embrioninių ar vaisiaus nervinių audinių, persodintų į pacientų smegenis, poveikį.

XX amžiaus viduryje pirmą kartą buvo atrastas mirtinai apšvitintų gyvūnų kraujodaros atkūrimas po intraveninės kaulų čiulpų ląstelių transfuzijos, o 1969 m. amerikiečių tyrėjas D. Thomas atliko pirmąją kaulų čiulpų transplantaciją žmonėms. Tuo metu trūko žinių apie donoro ir recipiento kaulų čiulpų ląstelių imunologinio nesuderinamumo mechanizmus, todėl dėl dažnos transplantacijos nesėkmės ir transplantato prieš šeimininką reakcijos išsivystymo buvo didelis mirtingumas. Pagrindinio audinių suderinamumo komplekso, apimančio žmogaus leukocitų antigenus (HbA), atradimas ir jų tipizavimo metodų patobulinimas leido žymiai padidinti išgyvenamumą po kaulų čiulpų transplantacijos, o tai lėmė platų šio gydymo metodo taikymą onkohematologijoje. Po dešimtmečio buvo atliktos pirmosios hematopoetinių kamieninių ląstelių (HSC), gautų iš periferinio kraujo naudojant leukaferezę, transplantacijos. 1988 m. Prancūzijoje virkštelės kraujas pirmą kartą buvo panaudotas kaip HSC šaltinis gydant Fanconi anemija sergantį vaiką, o nuo 2000 m. pabaigos spaudoje pasirodė pranešimų apie HSC gebėjimą diferenciuotis į įvairių audinių tipų ląsteles, o tai gali išplėsti jų klinikinio pritaikymo apimtį. Tačiau paaiškėjo, kad transplantacijos medžiagoje, kartu su HSC, yra daug nehematopoetinių ląstelių priemaišų, pasižyminčių įvairia prigimtimi ir savybėmis. Šiuo atžvilgiu kuriami transplantato gryninimo metodai ir jo ląstelinio grynumo vertinimo kriterijai. Visų pirma, naudojama teigiama CD34+ ląstelių imunoselekcija, leidžianti išskirti HSC naudojant monokloninius antikūnus.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Kamieninių ląstelių terapijos komplikacijos

Kaulų čiulpų transplantacijos komplikacijos dažniausiai būna hematologinės ir susijusios su ilgu jatrogeninės pancitopenijos laikotarpiu. Dažniausiai išsivysto infekcinės komplikacijos, anemija ir kraujavimas. Šiuo atžvilgiu labai svarbu pasirinkti optimalų kaulų čiulpų surinkimo, apdorojimo ir saugojimo būdą, kad kamieninės ląstelės būtų kuo išsaugotos ir užtikrintų greitą bei stabilų kraujodaros atkūrimą. Apibūdinant transplantaciją, šiuo metu dažniausiai vertinami šie parametrai: mononuklearinių ir (arba) branduolinių ląstelių skaičius, kolonijas formuojantys vienetai ir CD34 teigiamų ląstelių kiekis. Deja, šie rodikliai leidžia tik netiesiogiai įvertinti tikrąjį transplantacijos kamieninių ląstelių populiacijos kraujodaros pajėgumą. Šiandien nėra absoliučiai tikslių parametrų, pagal kuriuos būtų galima nustatyti transplantacijos pakankamumą ilgalaikiam kraujodaros atkūrimui pacientams, net ir atliekant autologinę kaulų čiulpų transplantaciją. Bendrųjų kriterijų nustatymas yra labai sudėtingas dėl griežtų transplantacijos apdorojimo, kriokonservavimo ir tyrimų standartų trūkumo. Be to, būtina atsižvelgti į visą veiksnių įvairovę, turinčią įtakos sėkmingo kraujodaros atkūrimo parametrams kiekvienam pacientui. Autologinės kaulų čiulpų transplantacijos metu svarbiausi iš jų yra ankstesnių chemoterapijos kursų skaičius, gydymo režimo ypatybės, ligos, kurios metu buvo surinkti kaulų čiulpai, laikotarpis ir kolonijas stimuliuojančių faktorių naudojimo po transplantacijos schemos. Be to, nereikėtų pamiršti, kad prieš transplantacijos surinkimą taikyta chemoterapija gali neigiamai paveikti kaulų čiulpų kamienines ląsteles.

Alogeninės kaulų čiulpų transplantacijos metu labai padidėja sunkių toksinių komplikacijų dažnis. Šiuo atžvilgiu įdomūs statistiniai duomenys apie alogeninę kaulų čiulpų transplantaciją sergant talasemija. Europos kaulų čiulpų transplantacijos grupės ataskaitose užregistruota apie 800 kaulų čiulpų transplantacijų pacientams, sergantiems didžiąja talasemija. Alogeninė transplantacija sergant talasemija daugeliu atvejų atliekama iš HLA identiškų brolių ir seserų, o tai siejama su sunkiomis komplikacijomis ir dideliu mirtingumu transplantuojant kamieninių ląstelių medžiagą iš iš dalies suderinamų giminingų arba suderinamų negiminingų donorų. Siekiant sumažinti mirtinų infekcinių komplikacijų riziką, pacientai dedami į izoliuotas aseptines dėžes su laminariniu oro srautu ir jiems taikoma mažai bakterijų turinti arba abakterinė dieta. Žarnyno bakterinei dekontaminacijai per os skiriamos nesirezorbuojančios antibiotikų ir priešgrybelinių vaistų formos. Profilaktikai amfotericinas B leidžiamas į veną. Sisteminių infekcijų prevencija sustiprinama amikacinu ir ceftazidimu, kurie skiriami dieną prieš transplantaciją, tęsiant gydymą iki paciento išrašymo. Visi kraujo produktai prieš transfuziją apšvitinami 30 Gy doze. Parenterinis maitinimas transplantacijos metu yra būtina sąlyga ir prasideda iškart po to, kai natūraliai apribojamas maisto vartojimas.

Su dideliu imunosupresinių vaistų toksiškumu siejama daug komplikacijų, kurios dažnai sukelia pykinimą, vėmimą ir mukozitą, inkstų pažeidimą ir intersticinę pneumoniją. Viena sunkiausių chemoterapijos komplikacijų yra kepenų venų okliuzinė liga, dėl kurios ankstyvuoju potransplantaciniu laikotarpiu ištinka mirtis. Kepenų vartų sistemos venų trombozės rizikos veiksniai yra pacientų amžius, hepatito ir kepenų fibrozės buvimas, taip pat imunosupresinis gydymas po kaulų čiulpų transplantacijos. Venų okliuzinė liga ypač pavojinga sergant talasemija, kurią lydi kepenų hemosiderozė, hepatitas ir fibrozė – dažni transfuzijos terapijos palydovai. Kepenų vartų sistemos venų trombozė išsivysto praėjus 1–2 savaitėms po transplantacijos ir jai būdingas greitas bilirubino ir transaminazių aktyvumo padidėjimas kraujyje, hepatomegalijos progresavimas, ascitas, encefalopatija ir skausmas viršutinėje pilvo dalyje. Histologiškai autopsijos medžiaga atskleidžia endotelio pažeidimą, subendotelines kraujavimus, centrilobulinių hepatocitų pažeidimą, trombozinę venulių ir centrinių kepenų venų obstrukciją. Pacientams, sergantiems talasemija, aprašyti mirtini širdies sustojimo atvejai, susiję su citostatikų toksiniu poveikiu.

Prieš transplantaciją ciklofosfamidas ir busulfanas dažnai sukelia toksinį-hemoraginį cistitą su patologiniais uroepitelinių ląstelių pokyčiais. Ciklosporino A vartojimas kaulų čiulpų transplantacijos metu dažnai lydimas nefro- ir neurotoksiškumo, hipertenzijos sindromo, skysčių susilaikymo organizme ir hepatocitų citolizės. Lytinės ir reprodukcinės funkcijos sutrikimai dažniau stebimi moterims. Mažiems vaikams brendimo raida po transplantacijos paprastai nepakinta, tačiau vyresniems vaikams lytinės sferos vystymosi patologija gali būti labai rimta – iki sterilumo. Su pačia transplantacija tiesiogiai susijusios komplikacijos yra alogeninių kaulų čiulpų ląstelių atmetimas, ABO nesuderinamumas, ūminės ir lėtinės transplantato prieš šeimininką ligos formos.

Pacientams, kuriems atlikta su ABO nesuderinama kaulų čiulpų transplantacija, donoro izoagliutininai, priešingai nei šeimininkas, yra gaminami 330–605 dienas po transplantacijos, todėl gali užsitęsti hemolizė ir smarkiai padidėti kraujo perpylimų poreikis. Šios komplikacijos išvengiama perpilant tik 0 tipo raudonuosius kraujo kūnelius. Po transplantacijos kai kuriems pacientams pasireiškia autoimuninė neutropenija, trombocitopenija arba pancitopenija, kuriai koreguoti reikalinga splenektomija.

35–40 % recipientų ūminė transplantato prieš šeimininką liga išsivysto per 100 dienų po alogeninės HLA identiškų kaulų čiulpų transplantacijos. Odos, kepenų ir žarnyno pažeidimo laipsnis svyruoja nuo bėrimo, viduriavimo ir vidutinio sunkumo hiperbilirubinemijos iki odos pleiskanojimo, žarnyno nepraeinamumo ir ūminio kepenų nepakankamumo. Pacientams, sergantiems talasemija, I laipsnio ūminės transplantato prieš šeimininką ligos dažnis po kaulų čiulpų transplantacijos yra 75 %, o II ir aukštesnio laipsnio – 11–53 %. Lėtinė transplantato prieš šeimininką liga, kaip sisteminis daugybinių organų sindromas, paprastai išsivysto per 100–500 dienų po alogeninės kaulų čiulpų transplantacijos 30–50 % pacientų. Pažeista oda, burnos ertmė, kepenys, akys, stemplė ir viršutiniai kvėpavimo takai. Skiriama ribota lėtinės transplantato prieš šeimininką ligos forma, kai pažeidžiama oda ir (arba) kepenys, ir išplitusi forma, kai generalizuoti odos pažeidimai derinami su lėtiniu agresyviu hepatitu, akių, seilių liaukų ar bet kurio kito organo pažeidimais. Mirtį dažnai sukelia infekcinės komplikacijos, atsirandančios dėl sunkaus imunodeficito. Sergant talasemija, lengva lėtinė transplantato prieš šeimininką liga pasireiškia 12 %, vidutinio sunkumo – 3 %, o sunki – 0,9 % pacientų, kuriems persodinti alogeniniai HLA suderinami kaulų čiulpai. Sunki kaulų čiulpų transplantacijos komplikacija yra transplantato atmetimas, kuris išsivysto praėjus 50–130 dienų po operacijos. Atmetimo dažnis priklauso nuo gydymo režimo. Visų pirma, pacientams, sergantiems talasemija, kurie pasiruošimo laikotarpiu vartojo tik metotreksatą, kaulų čiulpų transplantato atmetimas pastebėtas 26 % atvejų, vartojant metotreksato derinį su ciklosporinu A – 9 % atvejų, o skiriant tik ciklosporiną A – 8 % atvejų (Gaziev ir kt., 1995).

Infekcines komplikacijas po kaulų čiulpų transplantacijos sukelia virusai, bakterijos ir grybeliai. Jų vystymasis susijęs su gilia neutropenija, kurią sukelia chemoterapiniai vaistai kondicionavimo laikotarpiu, gleivinių barjerų pažeidimu citostatikais ir transplantato prieš šeimininką reakcija. Priklausomai nuo išsivystymo laiko, skiriamos trys infekcinių komplikacijų fazės. Pirmojoje fazėje (išsivysto pirmąjį mėnesį po transplantacijos) vyrauja gleivinių barjerų pažeidimas ir neutropenija, dažnai lydima virusinių infekcijų (herpeso, Epšteino-Baro viruso, citomegaloviruso, juostinės pūslelinės), taip pat infekcijų, kurias sukelia gramteigiamos ir gramneigiamos bakterijos, Candida grybeliai, aspergiliai. Ankstyvuoju potransplantaciniu laikotarpiu (antrąjį ir trečiąjį mėnesius po transplantacijos) sunkiausia infekcija yra citomegalovirusas, kuris dažnai sukelia pacientų mirtį antroje infekcinių komplikacijų fazėje. Sergant talasemija, citomegaloviruso infekcija po kaulų čiulpų transplantacijos išsivysto 1,7–4,4 % recipientų. Trečioji fazė stebima vėlyvuoju potransplantaciniu laikotarpiu (praėjus trims mėnesiams po operacijos) ir jai būdingas sunkus kombinuotas imunodeficitas. Šiuo laikotarpiu dažnai pasitaiko infekcijos, kurias sukelia Varicella zoster, streptokokai, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae ir hepatotropiniai virusai. Sergant talasemija, pacientų mirtingumas po kaulų čiulpų transplantacijos yra susijęs su bakterine ir grybeline sepsiu, idiopatine intersticine ir citomegalovirusine pneumonija, ūminiu kvėpavimo distreso sindromu, ūminiu širdies nepakankamumu, širdies tamponada, smegenų kraujavimu, venų okliuzine kepenų liga ir ūmine transplantato prieš šeimininką liga.

Šiuo metu pasiekta tam tikrų sėkmių kuriant grynų kraujodaros kamieninių ląstelių populiacijų išskyrimo iš kaulų čiulpų metodus. Patobulinta vaisiaus kraujo gavimo iš virkštelės technika ir sukurti kraujodaros ląstelių išskyrimo iš virkštelės kraujo metodai. Mokslinėje spaudoje yra pranešimų, kad kraujodaros kamieninės ląstelės gali daugintis, kai auginamos terpėse su citokinais. Naudojant specialiai sukurtus bioreaktorius kraujodaros kamieninėms ląstelėms dauginti, žymiai padidėja iš kaulų čiulpų, periferinio ar virkštelės kraujo išskirtų kraujodaros kamieninių ląstelių biomasė. Hematopoetinių kamieninių ląstelių dauginimo galimybė yra svarbus žingsnis link klinikinio ląstelių transplantacijos vystymosi.

Tačiau prieš pradedant hematopoetinių kamieninių ląstelių dauginimą in vitro, būtina išskirti homogeninę hematopoetinių kamieninių ląstelių populiaciją. Tai paprastai pasiekiama naudojant žymenis, kurie leidžia selektyviai žymėti hematopoetines kamienines ląsteles monokloniniais antikūnais, kovalentiškai sujungtais su fluorescenciniu arba magnetiniu žymekliu, ir jas išskirti naudojant tinkamą ląstelių rūšiavimo įrenginį. Tuo pačiu metu hematopoetinių kamieninių ląstelių fenotipinių savybių klausimas dar nėra galutinai išspręstas. A. Petrenko, V. Griščenko (2003) ląsteles, kurių paviršiuje yra CD34, AC133 ir Thyl antigenų, bet nėra CD38, HLA-DR ar kitų diferenciacijos žymenų (ląstelės su CD34+Liir fenotipu), laiko kandidatėmis į hematopoetines kamienines ląsteles. Linijos (Lin) žymenys apima glikoforiną A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Ląstelės, turinčios CD34+CD45RalüW CD71low fenotipą, taip pat CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low fenotipą, laikomos perspektyviomis transplantacijai.

Efektyviai transplantacijai pakankamo kraujodaros kamieninių ląstelių skaičiaus klausimas išlieka problemiškas. Šiuo metu kraujodaros kamieninių ląstelių šaltiniai yra kaulų čiulpai, periferinis ir virkštelės kraujas bei embrioninės kepenys. Hematopoetinių kamieninių ląstelių dauginimas pasiekiamas jas kultivuojant esant endotelio ląstelėms ir kraujodaros augimo faktoriams. Įvairiuose protokoluose mieloproteinai, SCF, eritropoetinas, į insuliną panašūs augimo faktoriai, kortikosteroidai ir estrogenai naudojami HSC proliferacijai sukelti. Naudojant citokinų derinius in vitro, galima pasiekti reikšmingą HSC telkinio padidėjimą, o jų našumo pikas pasiekiamas antrosios kultivavimo savaitės pabaigoje.

Tradiciškai virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacija daugiausia naudojama hemoblastozėms gydyti. Tačiau sėkmingai virkštelės kraujo ląstelių transplantacijai reikalinga minimali kraujodaros ląstelių dozė yra 3,7 x 10⁻⁷ ^{branduolinių} ląstelių 1 kg recipiento kūno svorio. Naudojant mažesnį virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių skaičių, žymiai padidėja transplantato atmetimo ir ligos atkryčio rizika. Todėl virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacija daugiausia naudojama vaikų hemoblastozėms gydyti.

Deja, vis dar nėra virkštelės kraujo hematopoetinių ląstelių įsigijimo standartų ar standartizuotų protokolų klinikiniam jų naudojimui. Atitinkamai, pačios virkštelės kraujo kamieninės ląstelės nėra teisiškai pripažintas hematopoetinių ląstelių šaltinis transplantacijai. Be to, nėra jokių etinių ar teisinių normų, reglamentuojančių virkštelės kraujo bankų veiklą ir organizavimą, kokios egzistuoja užsienyje. Tuo tarpu, norint saugiai transplantuoti, visi virkštelės kraujo mėginiai turi būti atidžiai stebimi. Prieš imant kraują iš nėščios moters, reikia gauti jos sutikimą. Kiekviena nėščia moteris turi būti patikrinta dėl HBsAg nešiotumo, antikūnų prieš hepatito C, ŽIV ir sifilio virusus buvimo. Kiekvienas virkštelės kraujo mėginys turi būti standartiškai ištirtas dėl branduolinių ląstelių skaičiaus, CD34+ ir kolonijų formavimo pajėgumo. Be to, atliekamas HbA tipizavimas, kraujo grupės nustatymas pagal ABO ir jos priklausomybės pagal Rh faktorių nustatymas. Būtinos tyrimų procedūros yra bakteriologinis sterilumo tyrimas, serologiniai ŽIV-1 ir ŽIV-2 infekcijų, HBsAg, virusinio hepatito C, citomegalovirusinės infekcijos, HTLY-1 ir HTLY-II, sifilio ir toksoplazmozės tyrimai. Be to, atliekama polimerazės grandininė reakcija citomegaloviruso ir ŽIV infekcijoms nustatyti. Patartina tyrimų protokolus papildyti virkštelės kraujo GSC analize, siekiant nustatyti tokias genetines ligas kaip α-talasemija, pjautuvinė ląstelių anemija, adenozino deaminazės trūkumas, Brutono agamaglobulinemija, Hurlerio ir Ponterio ligos.

Kitas pasiruošimo transplantacijai etapas yra kraujodaros kamieninių ląstelių išsaugojimo klausimas. Pavojingiausios ląstelių gyvybingumui jų paruošimo metu yra užšaldymas ir atitirpinimas. Užšaldant kraujodaros ląsteles, didelė jų dalis gali būti sunaikinta dėl kristalų susidarymo. Ląstelių žūties procentui sumažinti naudojamos specialios medžiagos – krioprotektoriai. Dažniausiai kaip krioprotekcinis preparatas naudojamas DMSO, kurio galutinė koncentracija yra 10 %. Tačiau tokios koncentracijos DMSO pasižymi tiesioginiu citotoksiniu poveikiu, kuris pasireiškia net ir esant minimaliam poveikiui. Citotoksinio poveikio sumažėjimas pasiekiamas griežtai palaikant nulinę poveikio režimo temperatūrą, taip pat laikantis medžiagos apdorojimo taisyklių atitirpinimo metu ir po jo (visų manipuliacijų greitis, daugkartinių plovimo procedūrų naudojimas). Nereikėtų naudoti mažesnės nei 5 % DMSO koncentracijos, nes tai sukelia masinį kraujodaros ląstelių žūtį užšaldymo laikotarpiu.

Eritrocitų priemaišų buvimas kraujodaros kamieninių ląstelių suspensijos mišinyje sukelia nesuderinamumo reakcijos su eritrocitų antigenais riziką. Tuo pačiu metu, pašalinus eritrocitus, žymiai padidėja kraujodaros ląstelių netekimas. Šiuo atžvilgiu buvo pasiūlytas nefrakcionuoto kraujodaros kamieninių ląstelių išskyrimo metodas. Šiuo atveju, siekiant apsaugoti branduolines ląsteles nuo žalingo žemos temperatūros poveikio, naudojamas 10 % DMSO tirpalas ir pastovaus greičio (GS/min) aušinimas iki -80 °C, po kurio ląstelių suspensija užšaldoma skystame azote. Manoma, kad taikant šį kriokonservavimo metodą eritrocitai dalinai lizuojami, todėl kraujo mėginių nereikia frakcionuoti. Prieš transplantaciją ląstelių suspensija atšildoma, nuplaunama nuo laisvo hemoglobino ir DMSO žmogaus albumino tirpale arba kraujo serume. Hematopoetinių pirmtakų išsaugojimas naudojant šį metodą iš tiesų yra didesnis nei po virkštelės kraujo frakcionavimo, tačiau išlieka transfuzijos komplikacijų rizika dėl ABO nesuderinamų eritrocitų perpylimo.

Bankininkystės sistemos, skirtos HLA ištirtiems ir tipizuotiems HSC mėginiams saugoti, sukūrimas galėtų išspręsti minėtas problemas. Tačiau tam reikia parengti etikos ir teisines normas, kurios šiuo metu tik svarstomos. Prieš kuriant bankininkystės tinklą, būtina priimti keletą reglamentų ir dokumentų dėl HSC surinkimo, frakcionavimo, tyrimo ir tipizavimo, taip pat kriokonservavimo procedūrų standartizavimo. Privaloma efektyvaus HSC bankų veikimo sąlyga yra kompiuterinės bazės, skirtos sąveikai su Pasaulio čiulpų donorų asociacijos (WMDA) ir JAV nacionalinės čiulpų donorų programos (NMDP) registrais, organizavimas.

Be to, būtina optimizuoti ir standartizuoti HSC, pirmiausia virkštelės kraujo hematopoetinių ląstelių, išplėtimo in vitro metodus. Virkštelės kraujo HSC išplėtimas yra būtinas siekiant padidinti potencialių recipientų, suderinamų su HLA sistema, skaičių. Dėl mažo virkštelės kraujo tūrio jame esančių HSC skaičius paprastai negali užtikrinti kaulų čiulpų repopulacijos suaugusiems pacientams. Tuo pačiu metu, norint atlikti negiminingas transplantacijas, būtina turėti prieigą prie pakankamo skaičiaus tipizuotų HSC mėginių (nuo 10 000 iki 1 500 000 vienam recipientui).

Hematopoetinių kamieninių ląstelių transplantacija nepašalina komplikacijų, susijusių su kaulų čiulpų transplantacija. Analizė rodo, kad po virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijos sunkios ūminės transplantato prieš šeimininką ligos formos išsivysto 23 % recipientų, o lėtinės – 25 % recipientų. Onkohematologiniams pacientams ūminės leukemijos recidyvai per pirmuosius metus po virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijos stebimi 26 % atvejų.

Pastaraisiais metais intensyviai vystomi periferinių kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijos metodai. HSC kiekis periferiniame kraujyje yra toks mažas (1 HSC 100 000 kraujo ląstelių), kad jų išskyrimas be specialaus paruošimo neturi prasmės. Todėl donorui pirmiausia atliekamas vaistų, skatinančių kaulų čiulpų kraujodaros ląstelių išsiskyrimą į kraują, kursas. Šiuo tikslu naudojami tokie toli gražu ne nekenksmingi vaistai kaip ciklofosfamidas ir granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius. Tačiau net ir po HSC mobilizacijos į periferinį kraują procedūros CD34+ ląstelių kiekis jame neviršija 1,6%.

Klinikoje kraujodaros kamieninių ląstelių mobilizacijai dažniausiai naudojamas S-SEC metodas, kuriam būdingas gana geras toleravimas, išskyrus beveik natūralų kaulų skausmo atsiradimą. Reikėtų pažymėti, kad šiuolaikinių kraujo separatorių naudojimas leidžia efektyviai išskirti kraujodaros kamienines ląsteles. Tačiau normaliomis kraujodaros sąlygomis norint gauti pakankamą kraujodaros kamieninių ląstelių skaičių, kurio repopuliacijos pajėgumas būtų panašus į kaulų čiulpų suspensijos, reikia atlikti bent 6 procedūras. Kiekvienai tokiai procedūrai separatoriuje reikia apdoroti 10–12 litrų kraujo, o tai gali sukelti trombocitopeniją ir leukopeniją. Atskyrimo procedūra apima antikoagulianto (natrio citrato) įvedimą donorui, tačiau tai neatmeta trombocitų kontaktinės aktyvacijos ekstrakorporalinės centrifugavimo metu. Šie veiksniai sudaro sąlygas infekcinėms ir hemoraginėms komplikacijoms išsivystyti. Kitas metodo trūkumas yra didelis mobilizacijos atsako kintamumas, dėl kurio reikia stebėti HSC kiekį donorų periferiniame kraujyje, o tai yra būtina norint nustatyti jų maksimalų lygį.

Autogeninė kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacija, skirtingai nei alogeninė transplantacija, visiškai pašalina atmetimo reakcijos atsiradimą. Tačiau reikšmingas kraujodaros kamieninių ląstelių autotransplantacijos trūkumas, ribojantis jos taikymo indikacijų spektrą, yra didelė leukeminių kloninių ląstelių reinfuzijos tikimybė transplantato metu. Be to, imuninio tarpininkavimo „transplantato prieš naviką“ efekto nebuvimas žymiai padidina piktybinių kraujo ligų recidyvų dažnį. Todėl vienintelis radikalus metodas, skirtas pašalinti neoplastinę kloninę hematopoezę ir atkurti normalią polikloninę hematopoezę mielodisplazinių sindromų atveju, išlieka intensyvi polichemoterapija su alogeninės hematopoezės transplantacija.

Tačiau net ir šiuo atveju daugumos hemoblastozių gydymas yra skirtas tik pacientų išgyvenamumo pailginimui ir jų gyvenimo kokybės gerinimui. Remiantis keliais dideliais tyrimais, ilgalaikis išgyvenamumas be recidyvų po HSC alotransplantacijos pasiekiamas 40 % onkohematologinių pacientų. Naudojant HLA suderinamo brolio ar sesers kamienines ląsteles, geriausi rezultatai stebimi jauniems pacientams, turintiems trumpą ligos istoriją, iki 10 % blastinių ląstelių skaičių ir palankią citogenetiką. Deja, su HSC alotransplantacijos procedūra susijęs mirtingumas pacientams, sergantiems mielodisplazinėmis ligomis, išlieka didelis (daugumoje ataskaitų – apie 40 %). 10 metų trukusio Nacionalinės kaulų čiulpų donorų programos darbo JAV rezultatai (510 pacientų, vidutinis amžius – 38 metai) rodo, kad dvejų metų išgyvenamumas be recidyvų yra 29 %, o recidyvo tikimybė yra santykinai maža (14 %). Tačiau mirtingumas, susijęs su HSC alotransplantacijos iš negiminingo donoro procedūra, yra itin didelis ir per dvejus metus siekia 54 %. Panašūs rezultatai gauti ir atliekant Europos tyrimą (118 pacientų, amžiaus mediana – 24 metai, dvejų metų išgyvenamumas be recidyvų – 28 %, recidyvas – 35 %, mirtingumas – 58 %).

Intensyvios chemoterapijos kursų metu, po kurio atkuriama kraujodaros sistema alogeninėmis kraujodaros ląstelėmis, dažnai pasitaiko imunohematologinių ir transfuzijos komplikacijų. Jos daugiausia atsiranda dėl to, kad žmogaus kraujo grupės paveldimos nepriklausomai nuo MHC molekulių. Todėl, net jei donoras ir recipientas yra suderinami pagal pagrindinius HLA antigenus, jų eritrocitai gali turėti skirtingus fenotipus. Skiriamas „didelis“ nesuderinamumas, kai recipientas jau turi antikūnų prieš donoro eritrocitų antigenus, ir „nedidelis“ nesuderinamumas, kai donoras turi antikūnų prieš recipiento eritrocitų antigenus. Galimi „didelio“ ir „nedidelio“ nesuderinamumo derinio atvejai.

Lyginamosios kaulų čiulpų ir virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių alotransplantacijos klinikinio veiksmingumo hemoblastozėse analizės rezultatai rodo, kad vaikams po virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių alotransplantacijos transplantato prieš šeimininką reakcijos rizika žymiai sumažėja, tačiau neutrofilų ir trombocitų skaičiaus atsistatymo laikotarpis yra ilgesnis, o 100 dienų po transplantacijos mirtingumas yra didesnis.

Ankstyvo mirtingumo priežasčių tyrimas leido išsiaiškinti alogeninės HSC transplantacijos kontraindikacijas, tarp kurių svarbiausios yra:

• teigiamų citomegalovirusinės infekcijos tyrimų buvimas recipientui arba donorui (be profilaktinio gydymo);
• ūminė radiacinė liga;
• paciento mikotinės infekcijos buvimas ar net įtarimas (neatliekant sisteminės ankstyvos profilaktikos fungicidiniais vaistais);
• hemoblastozės, kai pacientai ilgą laiką buvo gydomi citostatikais (dėl didelės staigaus širdies sustojimo ir daugelio organų nepakankamumo tikimybės);
• transplantacija iš HLA neidentiškų donorų (be ūminės transplantato prieš šeimininką reakcijos profilaktikos ciklosporinu A);
• lėtinis virusinis hepatitas C (dėl didelės kepenų venų okliuzinės ligos išsivystymo rizikos).

Taigi, HSC transplantacija gali sukelti rimtų komplikacijų, kurios dažnai baigiasi mirtimi. Ankstyvuoju (iki 100 dienų po transplantacijos) laikotarpiu tai yra infekcinės komplikacijos, ūminė transplantato prieš šeimininką liga, transplantato atmetimas (donoro HSC nepakankamumas), veno okliuzinė kepenų liga, taip pat audinių pažeidimas, kurį sukelia toksinis parengiamojo režimo poveikis, kuriam būdingas didelis remodeliacijos greitis (oda, kraujagyslių endotelis, žarnyno epitelis). Vėlyvojo potransplantacinio laikotarpio komplikacijos yra lėtinė transplantato prieš šeimininką liga, pagrindinės ligos atkryčiai, vaikų augimo sulėtėjimas, reprodukcinės sistemos ir skydliaukės disfunkcija bei akių pažeidimai.

Pastaruoju metu, atsižvelgiant į publikacijas apie kaulų čiulpų ląstelių plastiškumą, iškilo idėja naudoti HSC širdies priepuoliams ir kitoms ligoms gydyti. Nors kai kurie eksperimentai su gyvūnais patvirtina šią galimybę, išvados apie kaulų čiulpų ląstelių plastiškumą turi būti patvirtintos. Į šią aplinkybę turėtų atsižvelgti tie tyrėjai, kurie mano, kad persodintos žmogaus kaulų čiulpų ląstelės lengvai transformuojamos į griaučių raumenų, miokardo ar CNS ląsteles. Hipotezė, kad HSC yra natūralus šių organų regeneracijos ląstelinis šaltinis, reikalauja rimtų įrodymų.

Visų pirma, buvo paskelbti pirmieji V. Belenkovo (2003 m.) atviro atsitiktinių imčių tyrimo rezultatai. Jo tikslas buvo ištirti C-SvK (t. y. autologinių HSC mobilizacijos į kraują) poveikį pacientų, sergančių vidutinio sunkumo ar sunkiu lėtiniu širdies nepakankamumu, klinikinei, hemodinaminei ir neurohumoralinei būklei, taip pat įvertinti jo saugumą, atsižvelgiant į standartinę terapiją (angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai, beta adrenoblokatoriai, diuretikai, širdies glikozidai). Pirmojoje tyrimo rezultatų publikacijoje programos autoriai pažymi, kad vienintelis argumentas O-SvK naudai yra vieno paciento gydymo rezultatai, kuris, taikant gydymą šiuo vaistu, parodė neginčijamą visų klinikinių ir hemodinaminių parametrų pagerėjimą. Tačiau HSC mobilizacijos į kraują ir vėlesnės miokardo regeneracijos poinfarkto zonoje teorija nebuvo patvirtinta – net pacientui, kuriam buvo teigiama klinikinė dinamika, krūvio echokardiografija su dobutaminu neparodė gyvybingo miokardo zonų atsiradimo rando srityje.

Reikėtų pažymėti, kad šiuo metu akivaizdžiai nepakanka duomenų, kad būtų galima rekomenduoti pakaitinę ląstelių terapiją plačiai taikyti kasdienėje klinikinėje praktikoje. Reikalingi gerai suplanuoti ir aukštos kokybės klinikiniai tyrimai, siekiant nustatyti įvairių regeneracinės ląstelių terapijos variantų veiksmingumą, parengti jos indikacijas ir kontraindikacijas, taip pat regeneracinės-plastinės terapijos ir tradicinio chirurginio ar konservatyvaus gydymo derinio gaires. Vis dar nėra atsakymo į klausimą, kuri konkreti kaulų čiulpų ląstelių populiacija (kamieninė hematopoetinė ar strominė) gali sukelti neuronus ir kardiomiocitus, taip pat neaišku, kokios sąlygos prie to prisideda in vivo.

Darbas šiose srityse atliekamas daugelyje šalių. JAV Nacionalinių sveikatos institutų ūminio kepenų nepakankamumo simpoziumo santraukoje, be perspektyvių gydymo metodų, kartu su kepenų transplantacija, pažymima kseno- arba alogeninių hepatocitų transplantacija ir ekstrakorporinis bioreaktorių sujungimas su kepenų ląstelėmis. Yra tiesioginių įrodymų, kad tik svetimos funkciškai aktyvios hepatocitai gali veiksmingai palaikyti recipiento kepenis. Klinikiniam izoliuotų hepatocitų naudojimui būtina sukurti ląstelių banką, kuris žymiai sutrumpins laiką tarp ląstelių išskyrimo ir jų panaudojimo. Priimtiniausias izoliuotų hepatocitų banko kūrimo būdas yra kepenų ląstelių kriokonservavimas skystame azote. Klinikoje naudojant tokias ląsteles pacientams, sergantiems ūminiu ir lėtiniu kepenų nepakankamumu, nustatytas gana didelis terapinis poveikis.

Nepaisant optimistiškų ir daug žadančių kepenų ląstelių transplantacijos rezultatų eksperimentuose ir klinikinėje praktikoje, vis dar yra daug problemų, kurios toli gražu nėra išspręstos. Tai ribotas organų, tinkamų izoliuotiems hepatocitams gauti, skaičius, nepakankamai veiksmingi jų išskyrimo metodai, standartizuotų kepenų ląstelių išsaugojimo metodų nebuvimas, neaiškios idėjos apie persodintų ląstelių augimo ir proliferacijos reguliavimo mechanizmus, tinkamų alogeninių hepatocitų įsitvirtinimo ar atmetimo įvertinimo metodų nebuvimas. Tai taip pat apima transplantacijos imuniteto buvimą naudojant alogenines ir ksenogenines ląsteles, nors ir mažesnį nei ortotopinės kepenų transplantacijos metu, tačiau reikalaujantį imunosupresantų naudojimo, izoliuotų hepatocitų kapsuliavimo arba specialaus jų apdorojimo fermentais. Hepatocitų transplantacija dažnai sukelia imuninį konfliktą tarp recipiento ir donoro atmetimo reakcijos forma, kuriai reikia naudoti citostatikus. Vienas iš šios problemos sprendimų gali būti polimerinių mikroporinių nešiklių naudojimas kepenų ląstelėms išskirti, o tai pagerins jų išgyvenamumą, nes kapsulės membrana veiksmingai apsaugo hepatocitus, nepaisant šeimininko imunizacijos.

Tačiau esant ūminiam kepenų nepakankamumui, tokia hepatocitų transplantacija yra neefektyvi dėl gana ilgo laiko, reikalingo kepenų ląstelėms prisitaikyti prie naujos aplinkos ir pasiekti optimalaus funkcionavimo stadiją. Galimas apribojimas yra tulžies sekrecija atliekant ektopinę izoliuotų hepatocitų transplantaciją, o naudojant bioreaktorius, reikšmingas fiziologinis barjeras yra žmogaus baltymų ir ksenogeninių hepatocitų gaminamų baltymų rūšių neatitikimas.

Literatūroje yra pranešimų, kad vietinė kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių transplantacija palengvina efektyvų kaulų defektų korekciją, o kaulinio audinio atkūrimas šiuo atveju vyksta intensyviau nei savaiminės reparacinės regeneracijos metu. Keletas ikiklinikinių tyrimų su eksperimentiniais modeliais įtikinamai įrodo kaulų čiulpų stromos ląstelių transplantacijos naudojimo ortopedijoje galimybę, nors reikia toliau dirbti, kad šie metodai būtų optimizuoti net ir paprasčiausiais atvejais. Visų pirma, dar nerastos optimalios sąlygos osteogeninių stromos ląstelių plitimui ex vivo, o jų idealaus nešiklio (matricos) struktūra ir sudėtis lieka neišvystyta. Minimalus ląstelių skaičius, reikalingas tūrinei kaulų regeneracijai, nenustatytas.

Įrodyta, kad mezenchiminės kamieninės ląstelės pasižymi transgermaliniu plastiškumu, t. y. gebėjimu diferencijuotis į ląstelių tipus, fenotipiškai nesusijusius su pradinės linijos ląstelėmis. Optimaliomis kultivavimo sąlygomis polikloninės kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių linijos in vitro gali atlaikyti daugiau nei 50 dalijimųsi, todėl iš 1 ml kaulų čiulpų aspirato galima gauti milijardus stromos ląstelių. Tačiau mezenchiminių kamieninių ląstelių populiacija yra heterogeniška, pasireiškianti tiek kolonijų dydžių kintamumu, skirtingu jų formavimosi greičiu, tiek ląstelių tipų morfologine įvairove – nuo fibroblastų formos verpstės formos iki didelių plokščių ląstelių. Fenotipinis heterogeniškumas stebimas jau po 3 savaičių stromos kamieninių ląstelių kultivavimo: kai kurios kolonijos sudaro kaulinio audinio mazgelius, kitos – adipocitų sankaupas, o dar kitos, rečiau, sudaro kremzlės audinio salas.

Embrioninio nervinio audinio transplantacija iš pradžių buvo naudojama centrinės nervų sistemos degeneracinėms ligoms gydyti. Pastaraisiais metais vietoj embrioninio smegenų audinio buvo persodinami iš nervinių kamieninių ląstelių gauti neurosferų ląsteliniai elementai (Poltavtseva, 2001). Neurosferose yra neuronų ir neuroglijos pirmtakų, kurie suteikia vilties atkurti prarastas smegenų funkcijas po jų transplantacijos. Persodinus išsklaidytas neurosferos ląsteles į žiurkės smegenų dryžuotąjį kūną, pastebėta jų proliferacija ir diferenciacija į dopaminerginius neuronus, kurie pašalino motorinę asimetriją žiurkėms, sergančioms eksperimentiniu hemiparkinsonizmu. Tačiau kai kuriais atvejais iš neurosferos ląstelių išsivystė navikai, dėl kurių gyvūnai žuvo (Bjorklund, 2002).

Klinikoje atlikti kruopštūs dviejų pacientų grupių tyrimai, kurių metu nei pacientai, nei juos stebintys gydytojai nežinojo (dvigubai aklas tyrimas), kad vienai pacientų grupei buvo persodintas embrioninis audinys su dopaminą gaminančiais neuronais, o antrajai pacientų grupei buvo atlikta fiktyvi operacija, davė netikėtų rezultatų. Pacientai, kuriems buvo persodintas embrioninis nervinis audinys, jautėsi ne geriau nei kontrolinės grupės pacientai. Be to, 5 iš 33 pacientų praėjus 2 metams po embrioninio nervinio audinio transplantacijos išsivystė persistuojanti diskinezija, kurios kontrolinės grupės pacientams nebuvo (Kamieninės ląstelės: mokslo pažanga ir būsimos tyrimų kryptys. Nat. Inst, of Health. USA). Viena iš neišspręstų smegenų nervinių kamieninių ląstelių klinikinių tyrimų problemų išlieka jų darinių transplantacijos realių perspektyvų ir apribojimų analizė CNS sutrikimų korekcijai. Gali būti, kad užsitęsusio traukulių aktyvumo sukelta hipokampo neuronogenezė, vedanti prie jos struktūrinės ir funkcinės reorganizacijos, gali būti progresuojančio epilepsijos vystymosi veiksnys. Ši išvada nusipelno ypatingo dėmesio, nes ji nurodo galimas neigiamas naujų neuronų susidarymo brandžiose smegenyse ir jų aberantinių sinapsinių jungčių susidarymo pasekmes.

Nereikėtų pamiršti, kad auginimas terpėse su citokinais (mitogenais) kamieninių ląstelių savybes priartina prie navikinių ląstelių savybių, nes jose vyksta panašūs ląstelių ciklo reguliavimo pokyčiai, lemiantys neriboto dalijimosi gebėjimą. Persodinti ankstyvuosius embrioninių kamieninių ląstelių darinius žmogui yra neapgalvota, nes tokiu atveju piktybinių navikų išsivystymo grėsmė yra labai didelė. Daug saugiau naudoti labiau įsipareigojusius jų palikuonis, t. y. diferencijuotų linijų pirmtakines ląsteles. Tačiau šiuo metu dar nėra sukurta patikima technika, kaip gauti stabilias žmogaus ląstelių linijas, kurios diferencijuojasi norima kryptimi.

Molekulinės biologijos technologijų panaudojimas paveldimos patologijos ir žmonių ligų korekcijai modifikuojant kamienines ląsteles yra labai svarbus praktinei medicinai. Kamieninių ląstelių genomo ypatybės leidžia sukurti unikalias transplantacijos schemas genetinėms ligoms koreguoti. Tačiau šioje srityje yra nemažai apribojimų, kuriuos reikia įveikti prieš pradedant praktiškai taikyti kamieninių ląstelių genetinę inžineriją. Visų pirma, būtina optimizuoti kamieninių ląstelių genomo modifikavimo ex vivo procesą. Yra žinoma, kad ilgalaikė (3–4 savaičių) kamieninių ląstelių proliferacija sumažina jų transfekciją, todėl norint pasiekti aukštą jų genetinės modifikacijos lygį, būtini keli transfekcijos ciklai. Tačiau pagrindinė problema yra susijusi su terapinės genų ekspresijos trukme. Iki šiol nė viename tyrime modifikuotų ląstelių transplantacijos efektyvios ekspresijos laikotarpis neviršijo keturių mėnesių. 100 % atvejų laikui bėgant transfekuotų genų ekspresija mažėja dėl promotorių inaktyvavimo ir (arba) ląstelių su modifikuotu genomu mirties.

Svarbus klausimas yra ląstelių technologijų naudojimo medicinoje kaina. Pavyzdžiui, apskaičiuota, kad vien kaulų čiulpų transplantacijos skyriaus, skirto atlikti 50 transplantacijų per metus, medicininėms išlaidoms finansuoti metinis poreikis yra apie 900 000 JAV dolerių.

Ląstelių technologijų plėtra klinikinėje medicinoje yra sudėtingas ir daugiapakopis procesas, apimantis konstruktyvų daugiadisciplininių mokslo ir klinikinių centrų bei tarptautinės bendruomenės bendradarbiavimą. Tuo pačiu metu ypatingas dėmesys reikalauja mokslinio tyrimų organizavimo ląstelių terapijos srityje klausimų. Svarbiausi iš jų yra klinikinių tyrimų protokolų rengimas, klinikinių duomenų patikimumo kontrolė, nacionalinio tyrimų registro formavimas, integracija į tarptautines daugiacentrių klinikinių tyrimų programas ir rezultatų diegimas klinikinėje praktikoje.

Baigdamas įvadą į ląstelių transplantologijos problemas, norėčiau išreikšti viltį, kad suvienijus pirmaujančių Ukrainos specialistų iš įvairių mokslo sričių pastangas, bus užtikrinta didelė pažanga eksperimentinių ir klinikinių tyrimų srityje ir ateinančiais metais bus galima rasti veiksmingų būdų, kaip padėti sunkiai sergantiems žmonėms, kuriems reikalinga organų, audinių ir ląstelių transplantacija.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]