Mezenchiminės kamieninės ląstelės

Tarp regioninių kamieninių ląstelių ypatingą vietą užima mezenchiminės kamieninės ląstelės (MSC), kurių dariniai sudaro visų žmogaus kūno organų ir audinių stromos matricą. MSC tyrimų prioritetas priklauso Rusijos biologijos mokslo atstovams.

Praėjusio amžiaus viduryje A. Friedensteino laboratorijoje pirmą kartą buvo išskirta homogeninė daugiapotentinių stromos kamieninių ląstelių iš kaulų čiulpų kultūra. Prie substrato pritvirtintos mezenchiminės kamieninės ląstelės ilgą laiką išlaikė aukštą proliferacijos intensyvumą, o kultūrose su mažu sėklų tankiu po fiksacijos prie substrato jos suformavo fibroblastų tipo ląstelių klonus, kurie neturėjo fagocitinio aktyvumo. MSC proliferacijos nutraukimas baigėsi jų savaimine diferenciacija in vitro į kaulų, riebalų, kremzlės, raumenų ar jungiamojo audinio ląsteles. Tolesni tyrimai leido nustatyti įvairių žinduolių rūšių kaulų čiulpų stromos fibroblastų tipo ląstelių osteogeninį potencialą, taip pat jų kolonijas formuojantį aktyvumą. In vivo eksperimentai parodė, kad tiek hetero-, tiek ortotopinė kolonijas formuojančių fibroblastų tipo ląstelių transplantacija lemia kaulų, kremzlės, skaidulinio ir riebalinio audinio susidarymą. Kadangi kaulų čiulpų stromos kamieninėms ląstelėms būdingas didelis savęs atsinaujinimo ir daugialypės diferenciacijos gebėjimas vienoje ląstelių linijoje, jos vadinamos daugiapotentėmis mezenchiminėmis pirmtakinėmis ląstelėmis.

Reikėtų pažymėti, kad per 45 metus trukusius fundamentinius mezenchiminių kamieninių ląstelių tyrimus buvo sukurtos realios sąlygos jų darinių naudojimui klinikinėje praktikoje.

Šiandien neabejotina, kad visi žmogaus kūno audiniai susidaro iš įvairių ląstelių linijų kamieninių ląstelių dėl proliferacijos, migracijos, diferenciacijos ir brendimo procesų. Tačiau iki šiol buvo manoma, kad suaugusio organizmo kamieninės ląstelės yra audinių specifinės, t. y. geba gaminti specializuotų ląstelių linijas tik iš tų audinių, kuriuose jos yra. Šią konceptualią poziciją paneigė hematopoetinių kamieninių ląstelių transformacijos faktai ne tik į periferinio kraujo ląstelinius elementus, bet ir į kepenų ovalias ląsteles. Be to, paaiškėjo, kad nervinės kamieninės ląstelės gali sukelti tiek neuronus, tiek glijos elementus, taip pat ankstyvas hematopoetinių kamieninių ląstelių linijas. Savo ruožtu mezenchiminės kamieninės ląstelės, kurios paprastai gamina kaulų, kremzlių ir riebalinio audinio ląstelinius elementus, geba transformuotis į nervines kamienines ląsteles. Manoma, kad augimo, fiziologinės ir reparacinės audinių regeneracijos procese iš audiniams nespecifinių kamieninių rezervų susidaro laisvos progenitorinės ląstelės. Pavyzdžiui, raumenų audinio reparacija gali būti realizuota dėl mezenchiminių kamieninių ląstelių migracijos iš kaulų čiulpų į griaučių raumenis.

Nors tokį kamieninių ląstelių kryžminį pakeičiamumą pripažįsta ne visi tyrėjai, mezenchiminių kamieninių ląstelių klinikinio panaudojimo kaip ląstelių transplantacijos šaltinio ir genetinės informacijos ląstelinio vektoriaus galimybė jau nebekelia abejonių, kaip ir kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių multipotencija, kurias galima gana lengvai išskirti ir išplėsti in vitro kultūroje. Tuo pačiu metu mokslinėje literatūroje ir toliau pasirodo pranešimų apie galimą kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių pluripotenciją. Kaip įrodymai cituojami tyrimų protokolai, kuriuose, veikiant specifiniams transdiferenciacijos induktoriams, MSC transformuojamos į nervines ląsteles, kardiomiocitus ir hepatocitus. Tačiau kai kurie mokslininkai labai abejoja dėl pakartotinės genų aktyvacijos ir ekspresijos galimybės nuo ankstyvosios embriogenezės laikotarpio. Tuo pačiu metu visi supranta, kad jei bus surastos sąlygos išplėsti mezenchiminių kamieninių ląstelių multipotenciją iki ESC pluripotencijos, daugelis etinių, moralinių, religinių ir teisinių problemų regeneracinėje plastinėje medicinoje bus automatiškai išspręstos. Be to, kadangi šiuo atveju regeneracinio kamieno potencialo šaltiniu tampa paciento autologinės stromos ląstelės, išsprendžiama ir ląstelių transplantato imuninio atmetimo problema. Kiek realios šios perspektyvos, parodys artima ateitis.

[ 1 ], [ 2 ]

Mezenchiminių kamieninių ląstelių panaudojimas medicinoje

Klinikoje mezenchiminių kamieninių ląstelių darinių naudojimas pirmiausia siejamas su audinių defektų, atsirandančių esant dideliems ir giliems terminiams odos pažeidimams, atkūrimu. Ikiklinikinių tyrimų etape buvo atliktas eksperimentinis alogeninių fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių panaudojimo giliems nudegimams gydyti galimybių įvertinimas. Įrodyta, kad kaulų čiulpų fibroblastų tipo mezenchiminės kamieninės ląstelės kultūroje sudaro monosluoksnį, kuris leidžia jas persodinti, siekiant optimizuoti gilių nudegimų žaizdų regeneracijos procesus. Autoriai pažymi, kad embrioniniai fibroblastai turi panašią savybę, tačiau jų klinikinį pritaikymą riboja esamos etinės ir teisinės problemos. Gilus terminis nudegimas, pažeidžiant visus odos sluoksnius, buvo modeliuojamas Wistar žiurkėmis. Nudegimo plotas sudarė 18–20 % viso odos paviršiaus. Pirmąją eksperimentinę grupę sudarė žiurkės, patyrusios gilų terminį nudegimą ir joms buvo persodintos alogeninės fibroblastų tipo mezenchiminės kamieninės ląstelės. Antrąją grupę sudarė gyvūnai, patyrę gilų terminį nudegimą ir joms buvo persodintos alogeninės embrioninės fibroblastų ląstelės. Trečiąją grupę sudarė kontrolinės žiurkės, patyrusios gilų terminį nudegimą, kurioms nebuvo taikyta ląstelių terapija. Ant nudegimo žaizdos paviršiaus pipete buvo užtepta 2 x ^10⁻⁴ fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių ir embrioninių fibroblastų suspensija.ląstelės antrą dieną po nudegimo modeliavimo ir susidariusio nekrozinio šašo pašalinimo. Po ląstelių transplantacijos nudegimo paviršius buvo uždengtas marlės servetėle, sudrėkinta izotoniniu natrio chlorido tirpalu su gentamicinu. Kaulų čiulpų ląstelės buvo surinktos MSC gauti, o vėliau jos buvo indukuotos į fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių liniją iš suaugusių Wistar žiurkių šlaunikaulių. Embrioniniai fibroblastai buvo gauti iš 14–17 dienų amžiaus embrionų plaučių. Embrioniniai fibroblastai ir kaulų čiulpų ląstelės MSC gauti buvo preliminariai kultivuojamos Petri lėkštelėse 37 °C temperatūroje CO2 inkubatoriuje, atmosferoje su 5 % CO2 ir 95 % drėgme. Embrioniniai fibroblastai buvo kultivuojami 4–6 dienas, o MSC monosluoksnio susidarymui prireikė 14–17 dienų. Vėliau MSC buvo kriokonservuotos kaip pirminė medžiaga fibroblastų tipo mezenchiminėms kamieninėms ląstelėms, kurios buvo gautos atšildžius ir kultivuojant MSC 4 dienas. Susiformavusių fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių skaičius buvo daugiau nei 3 kartus didesnis nei per tą patį kultivavimo laikotarpį susiformavusių embrioninių fibroblastų skaičius. Siekiant identifikuoti persodintas ląsteles nudegimų žaizdose kultivavimo etape, jų genomas buvo žymimas naudojant virusinį pernešimo vektorių, pagrįstą rekombinantiniu V tipo adenovirusu, turinčiu 1ac-2 geną, koduojantį E. coli ß-galaktozidazę. Gyvos ląstelės skirtingu metu po transplantacijos buvo aptiktos imunohistochemiškai kriosekcijose, pridedant X-Gal substrato, kuris suteikia būdingą melsvai žalią spalvą. Atlikus dinaminį vizualinį, planimetrinį ir histologinį nudegimo žaizdos būklės įvertinimą, nustatyta, kad jau 3 dieną po ląstelių transplantacijos pasirinktose grupėse atsiranda reikšmingų žaizdos proceso eigos skirtumų. Šis skirtumas ypač išryškėjo 7 dieną po ląstelių transplantacijos. Pirmosios grupės gyvūnams, kuriems buvo persodintos fibroblastų tipo mezenchiminės kamieninės ląstelės, žaizda įgavo tolygiai intensyvią rausvą spalvą, granuliacinis audinys išaugo per visą savo plotą iki epidermio lygio, o nudegimo paviršius žymiai sumažėjo. Ant žaizdos paviršiaus susidariusi kolageno plėvelė šiek tiek suplonėjo, tačiau toliau dengė visą nudegimo plotą. Antros grupės gyvūnams, kuriems buvo persodinti embrioniniai fibroblastai, granuliacinis audinys pakilo iki žaizdos kraštų epidermio lygio, bet tik vietomis, o plazmorėja iš žaizdos buvo intensyvesnė nei pirmosios grupės, o iš pradžių susidariusi kolageno plėvelė praktiškai išnyko. Gyvūnams, kurie negavo ląstelių terapijos, 7 dieną nudegimo žaizda buvo blyški, duobėta, nekroziniu audiniu, padengtu fibrinu. Plazmorėja buvo pastebėta visame nudegimo paviršiuje. Histologiškai pirmosios ir antrosios grupių gyvūnams sumažėjo ląstelių infiltracija ir išsivystė kraujagyslių tinklas.ir šie prasidėjusio regeneracijos proceso požymiai buvo ryškesni I grupės žiurkėms. Kontrolinėje grupėje buvo pastebėti žaizdos ląstelių infiltracijos požymiai, naujai susiformavusių kraujagyslių histologinio modelio nebuvo. 15–30 stebėjimo dieną I grupės gyvūnų nudegimo paviršiaus plotas buvo žymiai mažesnis nei kitų grupių žiurkių, o granuliacinis paviršius buvo labiau išsivystęs. II grupės gyvūnų nudegimo paviršiaus plotas taip pat sumažėjo, palyginti su kontrolinės grupės žiurkių nudegimo žaizdų dydžiu, kurios atsirado dėl marginalinės epitelizacijos. Kontrolinėje grupėje nudegimo paviršius vietomis išliko blyškus, su retomis granuliacijomis, ant jo atsirado kraujagyslių žvaigždutės, buvo fibrininių plokštelių salelių, per visą nudegimo paviršių tęsėsi vidutinio sunkumo plazmorėja, o kai kuriose vietose išliko sunkiai atsiskiriantis šašas. Apskritai III grupės gyvūnų žaizdos dydis taip pat sumažėjo, tačiau žaizdos kraštai liko pažeisti.

Taigi, atliekant lyginamąjį žaizdų gijimo greičio tyrimą naudojant fibroblastų tipo mezenchimines kamienines ląsteles ir embrioninius fibroblastus, taip pat netaikant ląstelių terapijos, pastebėtas nudegimo paviršiaus gijimo greičio pagreitėjimas dėl fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių ir embrioninių fibroblastų transplantacijos. Tačiau, naudojant alogenines fibroblastų tipo mezenchimines kamienines ląsteles, žaizdų gijimo greitis buvo didesnis nei transplantuojant embrioninius fibroblastus. Tai pasireiškė regeneracinio proceso fazių kaitos pagreitėjimu – sutrumpėjo ląstelių infiltracijos laikas, padidėjo kraujagyslių tinklo augimo greitis, taip pat granuliacinio audinio susidarymas.

Dinaminės planimetrijos rezultatai rodo, kad nudegimo žaizdos savaiminio gijimo greitis (netaikant ląstelių terapijos) buvo mažiausias. 15 ir 30 dienomis po alogeninių fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacijos žaizdų gijimo greitis buvo didesnis nei po embrioninių fibroblastų transplantacijos. Histocheminis beta-galaktozidazės nustatymo metodas parodė, kad po fibroblastų tipo mezenchiminių kamieninių ląstelių ir embrioninių fibroblastų transplantacijos persodintos ląstelės išlieka gyvybingos regeneruojančių žaizdų paviršiuje ir gylyje per visą stebėjimo laikotarpį. Autoriai mano, kad didesnis nudegimo žaizdų regeneracijos greitis naudojant fibroblastų tipo mezenchimines kamienines ląsteles yra susijęs su biologiškai aktyvių augimą stimuliuojančių faktorių išskyrimu iš šių ląstelių brendimo proceso metu.

Klinikinėje praktikoje taip pat taikoma auto- arba alogeninių keratinocitų ir alogeninių fibroblastų transplantacija nudegimų žaizdoms gydyti. Reikėtų pažymėti, kad vaikų, patyrusių didelius gilius nudegimus, chirurginis gydymas yra sudėtinga užduotis dėl didelio trauminio pobūdžio ir daugybės chirurginių intervencijų, didelio kraujo netekimo ir įvairių reakcijų į naudojamas infuzines priemones. Pagrindiniai sunkumai atliekant odos plastines operacijas esant dideliems giliems nudegimams, kurių plotas viršija 40% kūno paviršiaus, kyla dėl nukentėjusiųjų būklės sunkumo ir donorinės odos išteklių trūkumo. Tinklelio transplantatų, turinčių didelį perforacijos koeficientą, naudojimas problemos neišsprendžia, nes po perforacijos susidariusios ląstelės epitelizuojasi labai lėtai, o patys odos atvartai dažnai lizuojasi arba išdžiūsta. Tokie nudegimų žaizdų uždengimai kaip ksenoskinas, lavonų alograftai, sintetinės plėvelės uždengimai ne visada yra pakankamai veiksmingi, todėl kuriami nauji nudegimų paviršių padengimo kultivuotų keratinocitų ir fibroblastų sluoksniais metodai. Visų pirma, buvo pasiūlytas nudegimų paviršių padengimo metodas, naudojant kultivuotus alofibroblastus, kurie, persodinti, turi ryškų stimuliuojantį poveikį epidermocitų, išsaugotų žaizdoje esant ribiniams nudegimams, taip pat keratinocitų, esančių tinklelio transplantatų pertvarose, proliferacijai. L. Budkevič ir bendraautorių (2000) darbe pateikiami šio metodo taikymo gydant vaikų nudegimus rezultatai. Tyrime dalyvavo 31 vaikas, patyręs terminę traumą, nuo 1 iki 14 metų amžiaus. Trims vaikams bendras IIIA-B - IV laipsnio nudegimų žaizdų plotas sudarė 40%, 25 - 50-70%, dar trims - 71-85% kūno paviršiaus. Ankstyva chirurginė nekrektomija buvo derinama su kultivuotų alofibroblastų transplantacija ir autodermoplastika. Pirmasis gydymo etapas apėmė nekrozinių audinių iškirpimą, antrasis etapas – kultivuotų alofibroblastų transplantaciją ant nešiklio plėvelių, o trečiasis etapas (praėjus 48 valandoms po kultivuotų alofibroblastų transplantacijos) – matricos pašalinimą ir autodermoplastiką su odos atvartais, kurių perforacijos santykis buvo 1:4. Trims pacientams, paguldytiems į kliniką dėl sunkios nudegimo ligos, kultivuoti alofibroblastai buvo persodinti ant granuliuojančių žaizdų. Kultivuotų alofibroblastų transplantacija atlikta vieną kartą 18 vaikų, du kartus 11 vaikų ir tris kartus dviem pacientams. Žaizdos paviršiaus plotas, padengtas ląstelių kultūra, svyravo nuo 30 iki 3500 cm2. Kultivuotų alofibroblastų veiksmingumas buvo įvertintas pagal bendrą odos transplantato prigijimo procentą, nudegimų gijimo laiką ir mirčių nuo sunkios terminės traumos skaičių. Transplantatas visiškai prigijo 86 % pacientų. Dalinis odos transplantatų neprigijimas pastebėtas 14 % atvejų. Nepaisant gydymo, mirė šeši (19,3 %) vaikai. Bendras odos pažeidimo plotas jose svyravo nuo 40 iki 70% kūno paviršiaus.Kultūrinių alofibroblastų transplantacija nebuvo susijusi su mirtingumu nuo nudegimų nė vienam pacientui.

Analizuodami gydymo rezultatus, autoriai pažymi, kad anksčiau gilus terminis odos pažeidimas, apimantis 35–40 % kūno paviršiaus, buvo laikomas nesuderinamu su gyvybe (mažesniems vaikams – iki 3 metų – kritiniai yra gilūs nudegimai, apimantys 30 % kūno paviršiaus, vyresniems vaikams – daugiau nei 40 % kūno paviršiaus). Atliekant chirurginę nekrektomiją su kultivuotų alofibroblastų transplantacija ir vėlesne autodermoplastika su odos atvartais, turinčiais didelį perforacijos koeficientą, IIIB–IV laipsnio nudegimai išlieka kritiniai, tačiau šiuo metu daugeliu atvejų yra perspektyvų išgelbėti net ir tokių aukų gyvybes. Chirurginė nekrektomija kartu su kultivuotų alofibroblastų transplantacija ir autodermoplastika vaikams, patyrusiems gilius nudegimus, pasirodė esanti ypač veiksminga pacientams, turintiems išplitusius odos pažeidimus ir trūkstant donorinių vietų. Aktyvi chirurginė taktika ir kultivuotų alofibroblastų transplantacija padeda greitai stabilizuoti bendrą tokių pacientų būklę, sumažinti nudegimų ligos infekcinių komplikacijų skaičių, sudaryti palankias sąlygas transplantatų prigijimui, sutrumpinti prarastos odos atkūrimo laiką ir stacionarinio gydymo trukmę, sumažinti mirtinų baigčių dažnį nukentėjusiesiems, patyrusiems didelius nudegimus. Taigi, kultivuotų alofibroblastų transplantacija su vėlesne autodermoplastika su odos atvartais leidžia pasveikti vaikams, patyrusiems sunkius nudegimus, kurie anksčiau buvo laikomi pasmerktais.

Visuotinai pripažįstama, kad pagrindinis nudegimų gydymo tikslas yra kuo išsamesnis ir greitesnis pažeistos odos atkūrimas, siekiant išvengti toksinio poveikio, infekcinių komplikacijų ir dehidratacijos. Kultūrinių ląstelių naudojimo rezultatai labai priklauso nuo pačios nudegimo žaizdos pasirengimo transplantacijai. Persodinus kultivuotus keratinocitus ant žaizdos paviršiaus po chirurginės nekrektomijos, vidutiniškai 55 % (pagal plotą) persodintų ląstelių prigyja, o granuliuojančių žaizdų atveju prigijimo rodiklis sumažėja iki 15 %. Todėl sėkmingam plačių gilių odos nudegimų gydymui pirmiausia reikalinga aktyvi chirurginė taktika. Esant IIIB–IV laipsnio nudegimams, nudegimo paviršius nedelsiant išvalomas nuo nekrozinio audinio, siekiant sumažinti intoksikaciją ir sumažinti nudegimų komplikacijų skaičių. Tokios taktikos taikymas yra raktas į laiko nuo nudegimo gavimo iki žaizdų užsivėrimo sutrumpinimą ir pacientų, patyrusių didelius nudegimus, buvimo ligoninėje trukmę, taip pat žymiai sumažina mirtinų baigčių skaičių.

Pirmieji pranešimai apie sėkmingą kultivuotų keratinocitų naudojimą nudegimų paviršiams padengti pasirodė devintojo dešimtmečio pradžioje. Vėliau ši manipuliacija buvo atliekama naudojant kultivuotų keratinocitų sluoksnius, dažniausiai gautus iš autoląstelių, daug rečiau iš alokeratinocitų. Tačiau autokeratinocitoplastikos technologija neleidžia sukurti ląstelių banko, o laikas, reikalingas pakankamo ploto keratinocitų transplantatui pagaminti, yra ilgas ir siekia 3–4 savaites. Šiuo laikotarpiu smarkiai padidėja infekcinių ir kitų nudegimų ligos komplikacijų rizika, o tai žymiai pailgina bendrą pacientų buvimo ligoninėje laiką. Be to, autokeratinocitai praktiškai neįsišaknija, persodinami ant granuliuojančių nudegimų žaizdų, o didelė specialių augimo terpių ir biologiškai aktyvių keratinocitų augimo stimuliatorių kaina žymiai riboja jų klinikinį pritaikymą. Kiti biotechnologiniai metodai, tokie kaip kolagenoplastika, kriokonservuoto ksenoskino transplantacija ir įvairių biopolimerinių dangų naudojimas, padidina plačių paviršinių, bet ne gilių nudegimų gydymo efektyvumą. Žaizdos paviršiaus padengimo kultivuotais fibroblastais metodas iš esmės skiriasi tuo, kad kaip pagrindinis kultivuojamo ląstelių sluoksnio komponentas naudojami fibroblastai, o ne keratinocitai.

Metodo kūrimo prielaida buvo duomenys, kad pericitai, supantys smulkias kraujagysles, yra pirmtakinės mezenchiminės ląstelės, galinčios transformuotis į fibroblastus, kurie gamina daug augimo faktorių ir užtikrina žaizdų gijimą dėl stipraus stimuliuojančio poveikio keratinocitų proliferacijai ir adhezijai. Kultūrinių fibroblastų naudojimas žaizdų paviršiams uždaryti iš karto atskleidė nemažai reikšmingų šio metodo pranašumų, palyginti su kultūrinių keratinocitų naudojimu. Visų pirma, norint gauti fibroblastus kultūroje, nereikia naudoti specialių maistinių terpių ir augimo stimuliatorių, todėl transplantacijos kaina sumažėja daugiau nei 10 kartų, palyginti su keratinocitų gavimo kaina. Fibroblastai lengvai pasivuoja, kurio metu jie iš dalies praranda paviršiaus histosuderinamumo antigenus, o tai savo ruožtu atveria galimybę naudoti alogenines ląsteles transplantatams gaminti ir jų bankams kurti. Laikas, reikalingas transplantatams, paruoštiems naudoti klinikoje, gauti, sutrumpėja nuo 3 savaičių (keratinocitams) iki 1-2 dienų (fibroblastams). Pirminę fibroblastų kultūrą galima gauti kultivuojant ląsteles iš odos fragmentų, paimtų autodermoplastikos metu, o ląstelių sėjimo tankis žmogaus fibroblastų subkultūroms gauti yra tik 20 ^x103/1 cm2.

Siekiant ištirti fibroblastų ir jų reguliuojančių baltymų poveikį keratinocitų proliferacijai ir diferenciacijai, buvo atlikta lyginamoji keratinocitų morfologijos ir proliferacijos analizė ant I ir III tipo kolageno substratų, taip pat fibronektino, bendroje kultūroje su žmogaus fibroblastais. Žmogaus keratinocitai buvo išskirti iš nudegimus patyrusių pacientų odos fragmentų, paimtų autodermoplastikos metu. Keratinocitų sėklos tankis buvo 50 x 103 ląstelių 1 cm2. Klinikinis kultivuotos fibroblastų transplantacijos veiksmingumas buvo įvertintas 517 pacientų. Visi pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes: 1 grupė - suaugę nukentėjusieji, patyrę IIA, B - IV laipsnio nudegimus; 2 grupė - vaikai, patyrę gilius IIIB - IV laipsnio nudegimus. Vieno sluoksnio kultūros fibroblastų struktūrinės ir funkcinės organizacijos dinamikos įvertinimas, atsižvelgiant į glikozaminoglikanų, fibronektino ir kolageno vaidmenį regeneracijos procesuose, leido autoriams nustatyti 3-iąją dieną kaip palankiausią laikotarpį naudoti fibroblastų kultūras transplantacijai. Fibroblastų poveikio keratinocitų proliferacijai ir diferenciacijai tyrimas parodė, kad in vitro fibroblastai turi ryškų stimuliuojantį poveikį, pirmiausia keratinocitų adhezijos procesams, daugiau nei 2 kartus padidindami prisitvirtinusių ląstelių skaičių ir jų fiksacijos greitį. Adhezijos procesų stimuliavimą lydi DNR sintezės intensyvumo ir keratinocitų proliferacijos lygio padidėjimas. Be to, paaiškėjo, kad fibroblastų ir jų susidariusios tarpląstelinės matricos buvimas yra būtina sąlyga keratinocitų tonofibriliniam aparatui, tarpląsteliniams ryšiams ir galiausiai keratinocitų diferenciacijai bei pamatinės membranos formavimuisi. Gydant vaikus, patyrusius gilius nudegimus, nustatytas didelis klinikinis alofibroblastų kultūros transplantacijos efektyvumas, ypač pacientų grupėje, turinčiose didelius odos pažeidimus donoro vietos trūkumo sąlygomis. Išsamus morfofunkcinis tyrimas parodė, kad transplantuojamiems fibroblastams būdinga aktyvi DNR, taip pat kolageno, fibronektino ir glikozaminoglikanų, kurie yra ląstelių susidarančios tarpląstelinės matricos dalis, sintezė. Autoriai atkreipia dėmesį į didelį persodintų fibroblastų įsitvirtinimo procentą (iki 96%), staigų jų gavimo laiko sutrumpėjimą (per 24–48 valandas, o ne per 2–3 savaites, kai naudojami keratinocitai), reikšmingą nudegimo paviršiaus epitelizacijos pagreitėjimą, taip pat reikšmingą (10 kartų) transplantato auginimo iš fibroblastų technologijos kainos sumažėjimą, palyginti su keratinocitų transplantacija. Kultūrinių alofibroblastų transplantacijos naudojimas leidžia išgelbėti vaikų, patyrusių sunkius nudegimus – terminę žalą daugiau nei 50 % kūno paviršiaus, gyvybes.kuris anksčiau buvo laikomas nesuderinamu su gyvybe. Reikėtų pažymėti, kad persodinus alogeninius embrioninius fibroblastus, įtikinamai įrodyta ne tik greitesnė žaizdų regeneracija ir pacientų, patyrusių įvairaus laipsnio ir ploto nudegimus, sveikimas, bet ir žymiai sumažėja jų mirtingumas.

Autologiniai fibroblastai taip pat naudojami tokioje sudėtingoje plastinės chirurgijos srityje kaip balso stygų pažeidimų rekonstrukcinė korekcija. Šiam tikslui dažniausiai naudojamas galvijų kolagenas, kurio veikimo trukmę riboja jo imunogeniškumas. Būdamas svetimas baltymas, galvijų kolagenas yra jautrus recipiento kolagenazei ir gali sukelti imunines reakcijas, kurių rizikai sumažinti buvo sukurtos technologijos kolageno preparatams, susietiems su glutaraldehidu, gauti. Jų privalumas yra didesnis stabilumas ir mažesnis imunogeniškumas, kuris rado praktinį pritaikymą šalinant balso stygų defektus ir atrofiją. Autologinio kolageno injekcijos pirmą kartą panaudotos 1995 m. Ši technika užtikrino autologinių kolageno skaidulų pirminės struktūros, įskaitant intramolekulinius fermentų katalizuojamus kryžminius ryšius, išsaugojimą. Faktas yra tas, kad natūralios kolageno skaidulos yra atsparesnės proteazių sukeliamam ardymui nei atkurtas kolagenas, kuriame telopeptidai yra supjaustyti. Telopeptidų vientisumas yra svarbus kolageno skaidulų ketvirtinei struktūrai ir kryžminių ryšių tarp gretimų kolageno molekulių susidarymui. Skirtingai nuo galvijų kolageno preparatų, autologinis kolagenas recipientui nesukelia imuninių reakcijų, tačiau jis nėra pakankamai veiksmingas kaip papildanti medžiaga. Stabili korekcija gali būti pasiekta vietinės kolageno gamybos būdu, transplantuojant autologinius fibroblastus. Tačiau tiriant autologinės fibroblastų transplantacijos veiksmingumą klinikoje, buvo nustatyti tam tikri sunkumai. Ankstyvuoju laikotarpiu po fibroblastų transplantacijos klinikinis poveikis buvo silpnesnis, palyginti su poveikiu po galvijų kolageno įvedimo. Kultivuojant autologinius fibroblastus, negalima atmesti galimybės, kad normalūs fibroblastai virs patologiniais, vadinamaisiais miofibroblastais, atsakingais už fibrozės vystymąsi ir randų susidarymą, ką rodo kolageno gelio susitraukimas, kurį sukelia specifinė fibroblastų ir kolageno fibrilų sąveika. Be to, po nuoseklaus persėjimo in vitro fibroblastai praranda gebėjimą sintetinti tarpląstelinės matricos baltymus.

Tačiau dabar eksperimentiškai sukurtas autologinių žmogaus fibroblastų kultivavimo metodas, kuris pašalina minėtus trūkumus ir nesukelia onkogeninės normalių fibroblastų transformacijos. Šiuo metodu gauti autologiniai fibroblastai naudojami minkštųjų veido audinių defektams atkurti. G. Keller ir kt. (2000) atliktame tyrime buvo gydomi 20 pacientų nuo 37 iki 61 metų amžiaus, turinčių raukšlių ir atrofinių randų. Odos biopsijos (4 mm) iš retroaurikulinės srities buvo pervežtos į laboratoriją steriliuose mėgintuvėliuose, kuriuose buvo 10 ml kultūros terpės (Eagle terpė su antibiotikais, mikoseptiku, piruvatu ir vaisiaus veršiuko serumu). Medžiaga buvo dedama į 3–5 60 mm skersmens kultūros lėkšteles ir inkubuojama termostate su atmosfera, kurioje yra 5 % CO2. Po 1 savaitės ląstelės buvo išimtos iš lėkštelių tripsinu ir sudėtos į 25 cm2 buteliukus. Pacientams buvo sušvirkšta 4 x 10⁻⁷ ląstelių. Reikšmingas ir ilgalaikis klinikinis poveikis pastebėtas pacientams, kuriems buvo koreguojamos nosies ir lūpų raukšlės, taip pat pacientams, kuriems atsirado randų praėjus 7 ir 12 mėnesių po trečiosios autologinių fibroblastų transplantacijos. Remiantis srauto citometrijos duomenimis, kultivuoti fibroblastai gamino didelį kiekį I tipo kolageno. In vitro tyrimai parodė normalų sušvirkštų fibroblastų susitraukimą. Praėjus dviem mėnesiams po poodinio kultivuotų fibroblastų suleidimo 4 x 10⁻⁷ ląstelių doze, plikoms pelėms nebuvo aptikta jokių navikų. Sušvirkšti fibroblastai pacientams nesukėlė randų ar difuzinės fibrozės. Pasak autoriaus, prigiję autologiniai fibroblastai geba nuolat gaminti kolageną, o tai suteiks kosmetinį atjauninimo efektą. Tuo pačiu metu, kadangi diferencijuotų ląstelių gyvavimo trukmė yra ribota, iš jauno paciento paimti fibroblastai yra veiksmingesni nei gauti iš pagyvenusių žmonių. Ateityje manoma, kad bus galima kriokonservuoti iš jauno donoro paimtą fibroblastų kultūrą, kad vėliau būtų galima persodinti jo paties jaunas ląsteles pagyvenusiam pacientui. Apibendrinant, nėra visiškai teisinga daryti išvadą, kad autologiniai fibroblastai, jei jie yra funkciškai išsaugoti, yra ideali priemonė veido minkštųjų audinių defektams koreguoti. Tuo pačiu metu pats autorius pažymi, kad tyrimo metu iškilo keletas probleminių situacijų, susijusių su autologinės fibroblastų-kolageno sistemos naudojimu. Klinikinis poveikis dažnai buvo silpnesnis nei naudojant galvijų kolageną, todėl pacientai nusivylė.

Apskritai literatūros duomenys apie mezenchiminių kamieninių ląstelių klinikinio panaudojimo perspektyvas atrodo gana optimistiškai. Bandoma panaudoti autologines kaulų čiulpų multipotentines mezenchimines pirmtakines ląsteles degeneraciniams sąnarių pažeidimams gydyti. Atliekami pirmieji klinikiniai kultivuotų mezenchiminių pirmtakinių ląstelių naudojimo kompleksinių kaulų lūžių gydymui tyrimai. Auto- ir alogeninės mezenchiminės kaulų čiulpų stromos ląstelės naudojamos kremzlės audiniui transplantacijai sukurti, koreguojant sąnarinės kremzlės defektus, atsiradusius dėl traumos ar autoimuninių pažeidimų. Kuriami metodai, skirti multipotentinėms mezenchiminėms pirmtakinėms ląstelėms klinikiniam panaudojimui, siekiant pašalinti kaulų defektus vaikams, sergantiems sunkia nepilnos osteogenezės forma, kurią sukelia I tipo kolageno geno mutacijos. Po mieloabliacijos recipientams persodinami sveikų donorų kaulų čiulpai, suderinami su HLA, nes nefrakcionuoti kaulų čiulpai gali turėti pakankamai mezenchiminių kamieninių ląstelių, kad kompensuotų sunkų kaulų defektą. Po alogeninių kaulų čiulpų transplantacijos tokiems vaikams pastebėti teigiami histologiniai trabekulinių kaulų pokyčiai, padidėjęs augimo greitis ir sumažėjęs kaulų lūžių dažnis. Kai kuriais atvejais teigiamas klinikinis rezultatas pasiekiamas persodinant glaudžiai susijusius alogeninius kaulų čiulpus ir osteoblastus. MSC transplantacija taip pat naudojama įgimtam kaulų trapumui, kurį sukelia osteoblastų ir osteoklastų disbalansas kauliniame audinyje, gydyti. Šiuo atveju kaulų formavimosi atkūrimas pasiekiamas chimerizuojant kamieninių ir progenitorinių stromos ląstelių telkinį pacientų kauliniame audinyje.

Toliau tobulinami donorinių mezenchiminių kamieninių ląstelių genetinės modifikacijos metodai, siekiant ištaisyti stromos audinių genetinius defektus. Manoma, kad artimiausiu metu mezenchiminės progenitorinės ląstelės bus naudojamos neurologijoje tikslinei smegenų ląstelių chimerizacijai ir sveikų ląstelių, gebančių generuoti trūkstamą fermentą ar faktorių, atsakingą už klinikines ligos apraiškas, telkinio kūrimui. Mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacija gali būti naudojama kaulų čiulpų stromos atkūrimui vėžiu sergantiems pacientams po radioterapijos ir chemoterapijos, o kartu su kaulų čiulpų ląstelėmis – kraujodaros atkūrimui. Pakaitinės terapijos, skirtos pašalinti raumenų ir skeleto sistemos defektus naudojant MSC, plėtrą skatina inžinerinė plėtra matricinių biomedžiagų arba biomimetikų, sudarančių karkasus, užpildytus mezenchiminių kamieninių ląstelių palikuonimis, projektavimo srityje.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių šaltiniai

Pagrindinis mezenchiminių kamieninių ląstelių šaltinis yra kaulų čiulpai, kurių kraujodaros kamieninės ląstelės žinduolių organizme nuolat diferencijuojasi į kraujo ir imuninės sistemos ląsteles, o mezenchimines kamienines ląsteles reprezentuoja nedidelė kaulų čiulpų stromos fibroblastų tipo ląstelių populiacija ir jos prisideda prie nediferencijuotos kraujodaros kamieninių ląstelių būsenos išsaugojimo. Tam tikromis sąlygomis mezenchiminės kamieninės ląstelės diferencijuojasi į kremzlės ir kaulinio audinio ląsteles. Sėjant ant kultūros terpės mažo tankio sodinimo sąlygomis, kaulų čiulpų mononuklearinės stromos ląstelės sudaro adhezinių ląstelių kolonijas, kurios iš tikrųjų yra fibroblastų tipo daugiapotentės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės. Kai kurie autoriai mano, kad kaulų čiulpuose nusėda neprisijungusios mezenchiminės kamieninės ląstelės, kurios dėl savo gebėjimo atsinaujinti ir didelio diferenciacijos potencialo aprūpina visus kūno audinius mezenchiminiais stromos elementų pirmtakais visą žinduolio organizmo gyvenimą.

Kaulų čiulpuose stromos ląsteliniai elementai sudaro tinklą, užpildantį erdvę tarp sinusoidų ir kaulinio audinio. Neaktyvių MSC kiekis suaugusiojo kaulų čiulpuose yra panašus į kraujodaros kamieninių ląstelių kiekį ir neviršija 0,01–0,001 %. Iš kaulų čiulpų išskirtos ir nekultivuojamos mezenchiminės kamieninės ląstelės neturi adhezijos molekulių. Tokios MSC neekspresuoja CD34, ICAM, VCAM, I ir III tipo kolageno, CD44 ir CD29. Todėl in vitro prie kultūros substrato fiksuojamos ne mezenchiminės kamieninės ląstelės, o labiau pažangūs mezenchiminių kamieninių ląstelių pirmtakiniai dariniai, kurie jau suformavo citoskeleto komponentus ir ląstelių adhezijos molekulių receptorių aparatą. Stromos ląstelės, turinčios CD34 fenotipą, randamos net periferiniame kraujyje, nors kaulų čiulpuose jų yra žymiai mažiau nei CD34 teigiamų mononuklearinių ląstelių. Iš kraujo išskirtos ir į kultūrą perkeltos CD34 ląstelės prisijungia prie substrato ir sudaro fibroblastų tipo ląstelių kolonijas.

Yra žinoma, kad embriono laikotarpiu visų žinduolių ir žmonių organų bei audinių stromos pagrindas kyla iš bendro mezenchiminių kamieninių ląstelių telkinio prieš organogenezę ir jos metu. Todėl manoma, kad subrendusiame organizme dauguma mezenchiminių kamieninių ląstelių turėtų būti jungiamajame ir kauliniame audinyje. Nustatyta, kad pagrindinę laisvojo jungiamojo ir kaulinio audinio stromos ląstelinių elementų dalį sudaro įsipareigojusios progenitorinės ląstelės, kurios vis dėlto išlaiko gebėjimą daugintis ir formuoti klonus in vitro. Kai tokios ląstelės įvedamos į bendrą kraujotaką, daugiau nei 20 % mezenchiminių progenitorinių ląstelių implantuojama tarp kraujodaros audinio ir parenchiminių organų stromos elementų.

Potencialus mezenchiminių kamieninių ląstelių šaltinis yra riebalinis audinys, tarp kurio kamieninių ląstelių identifikuoti įvairaus laipsnio adipocitų pirmtakai. Mažiausiai subrendę riebalinio audinio pirmtakiniai elementai yra stromos-kraujagyslių ląstelės, kurios, kaip ir multipotentinės kaulų čiulpų mezenchiminės pirmtakinės ląstelės, veikiamos gliukokortikoidų, insulino tipo augimo faktoriaus ir insulino, geba diferencijuotis į adipocitus. Kultūroje stromos-kraujagyslių ląstelės diferencijuojasi į adipocitus ir chondrocitus, o kaulų čiulpų kilmės riebaliniame audinyje yra ląstelių, kurios sudaro adipocitus ir osteoblastus.

Stromos kamieninės ląstelės taip pat buvo aptiktos raumenyse. Pirminėje iš žmogaus skeleto raumenų išskirtų ląstelių kultūroje aptinkamos žvaigždinės ląstelės ir daugiabranduoliai miotubeliai. Arklio serume žvaigždinės ląstelės in vitro proliferuoja be citodiferenciacijos požymių, o pridėjus deksametazono į maistinę terpę, jų diferenciacijai būdingas ląstelinių elementų, turinčių skeleto ir lygiųjų raumenų ląstelių, kaulų, kremzlių ir riebalinio audinio fenotipą, atsiradimas. Todėl žmogaus raumenų audinyje yra tiek įsipareigojusių, tiek neįgyvendinusių daugiapotencinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių. Įrodyta, kad skeleto raumenyse esanti pirmtakinių ląstelių populiacija yra kilusi iš nesusijusių daugiapotencinių mezenchiminių kaulų čiulpų pirmtakinių ląstelių ir skiriasi nuo miogeninių palydovinių ląstelių.

Naujagimių žiurkių miokarde taip pat buvo rastos lipnios žvaigždėtos ląstelės, atitinkančios multipotencines mezenchimines pirmtakines ląsteles, turinčias diferenciacijos potencialą, nes, veikiamos deksametazono, jos diferencijuojasi į adipocitus, osteoblastus, chondrocitus, lygiųjų raumenų ląsteles, griaučių raumenų miotūbelius ir kardiomiocitus. Įrodyta, kad kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės (pericitai) yra nediferencijuotų perivaskulinių multipotentinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių dariniai. Kultūroje perivaskulinės mezenchiminės kamieninės ląstelės ekspresuoja lygiųjų raumenų α-aktiną ir trombocitų augimo faktoriaus receptorių ir gali diferencijuotis bent į lygiųjų raumenų ląsteles.

Ypatingą vietą, vertinant iš kamieno rezervų perspektyvos, užima kremzlinis audinys, kurio itin mažas reparacinis potencialas, kaip manoma, yra susijęs su multipotentinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių arba diferenciacijos ir augimo faktorių trūkumu. Daroma prielaida, kad multipotentinės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės, iš anksto įsipareigojusios chondro- ir osteogenezei, į kremzlinį audinį patenka iš kitų audinių šaltinių.

Mezenchiminių pirmtakinių ląstelių audinių kilmė ir jų įsitvirtinimo sausgyslėse sąlygos taip pat nebuvo nustatytos. Eksperimentiniai stebėjimai rodo, kad ankstyvuoju postnataliniu laikotarpiu triušių Achilo sausgyslių ląstelės pirminėse kultūrose ir pirmojo perėjimo metu išlaiko I tipo kolageno ir dekorino raišką, tačiau toliau kultivuojant jos praranda tenocitų diferenciacijos žymenis.

Reikėtų pažymėti, kad atsakymo į klausimą, ar įvairiuose audiniuose lokalizuotos multipotentinės mezenchiminės progenitorinės ląstelės iš tikrųjų nuolat yra jų stromoje, ar mezenchiminių kamieninių ląstelių audinių telkinys papildomas migruojant kaulų čiulpų stromos kamieninėms ląstelėms, dar negauta.

Be kaulų čiulpų ir kitų suaugusio organizmo mezenchiminių audinių zonų, virkštelės kraujas gali būti dar vienas MSC šaltinis. Įrodyta, kad virkštelės venos kraujyje yra ląstelių, kurios turi panašias morfologines ir antigenines savybes kaip ir multipotentinės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės, geba adhezuoti ir diferenciacijos potencialu neprastesnės už multipotentines kaulų čiulpų kilmės mezenchimines pirmtakines ląsteles. Virkštelės kraujo mezenchiminių kamieninių ląstelių kultūrose rasta 5–10 % neaktyvuotų multipotentinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių. Paaiškėjo, kad jų skaičius virkštelės kraujyje yra atvirkščiai proporcingas nėštumo amžiui, o tai netiesiogiai rodo multipotentinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių migraciją į įvairius audinius vaisiaus vystymosi metu. Pasirodė pirmoji informacija apie klinikinių mezenchiminių kamieninių ląstelių, išskirtų iš virkštelės kraujo, taip pat gautų iš embrioninės biomedžiagos, panaudojimą, remiantis žinomu vaisiaus kamieninių ląstelių gebėjimu integruotis, įsitvirtinti ir funkcionuoti suaugusių recipientų organuose ir audinių sistemose.

Naujų mezenchiminių kamieninių ląstelių šaltinių paieška

Embrioninės kilmės mezenchiminių kamieninių ląstelių, taip pat ir kitų vaisiaus ląstelių, naudojimas kelia daug etinių, teisinių, teisminių ir teisėkūros problemų. Todėl toliau ieškoma ekstraembrioninių donorinių ląstelių medžiagos. Bandymas klinikiniu būdu panaudoti žmogaus odos fibroblastus buvo nesėkmingas, ką lėmė ne tik didelis technologijos finansinis pajėgumas, bet ir sparti fibroblastų diferenciacija į fibrocitus, kurie turi žymiai mažesnį proliferacijos potencialą ir gamina ribotą skaičių augimo faktorių. Tolesnė pažanga tiriant MSC ir multipotentines kaulų čiulpų mezenchimines kamienines ląsteles leido mums sukurti autologinių mezenchiminių kamieninių ląstelių klinikinio naudojimo strategiją. Jų išskyrimo, kultivavimo, ex vivo reprodukcijos ir tikslinės diferenciacijos technologijai pirmiausia reikėjo ištirti MSC molekulinių žymenų spektrą. Jų analizė parodė, kad pirminėse žmogaus kaulinio audinio kultūrose yra keletas multipotentines mezenchimines kamienines ląsteles. Proosteoblastų fenotipas buvo aptiktas ląstelėse, ekspresuojančiose stromos kamieninių ląstelių žymeklį STRO-1, bet neturinčiose osteoblastų žymens – šarminės fosfatazės. Tokioms ląstelėms būdingas mažas gebėjimas formuoti mineralizuotą kaulų matricą, taip pat osteopontino ir paratiroidinio hormono receptorių ekspresijos nebuvimas. STRO-1 teigiamų ląstelių dariniai, kurie neekspresuoja šarminės fosfatazės, yra reprezentuojami vidutiniškai ir visiškai diferencijuoti osteoblastai. Nustatyta, kad klonuotų STRO-1 teigiamų žmogaus trabekulinių kaulų ląstelių linijų ląsteliniai elementai geba diferencijuotis į subrendusius osteocitus ir adipocitus. Šių ląstelių diferenciacijos kryptis priklauso nuo polinesočiųjų riebalų rūgščių, uždegimą skatinančių citokinų – IL-1b ir naviko nekrozės faktoriaus a (TNF-α), taip pat priešuždegiminio ir imunosupresinio TGF-β poveikio.

Vėliau nustatyta, kad daugiapotentės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės neturi specifinio, tik joms būdingo fenotipo, tačiau, nesant hematopoetinių ląstelių imunofenotipinių antigenų - CD45, CD34 ir CD14 - ekspresuoja mezenchiminėms, endotelio, epitelio ir raumenų ląstelėms būdingų žymenų kompleksą. Be to, mezenchiminės kamieninės ląstelės konstituciškai ir indukuojamai gamina hematopoetinius ir nehematopoetinius augimo faktorius, interleukinus ir chemokinus, o daugiapotentėse mezenchiminėse pirmtakinėse ląstelėse ekspresuojami kai kurių citokinų ir augimo faktorių receptoriai. Tarp žmogaus kūno stromos matricos ląstelių rastos ramybės būsenos arba ramybės būsenos ląstelės, kurių imunofenotipas beveik identiškas 5-fluorouracilu neapdorotų daugiapotenčių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių antigeno profiliui - abi ląstelės ekspresuoja CD117, kuris žymi „suaugusias“ kamienines ląsteles.

Taigi, dar nėra identifikuotas ląstelių žymuo, būdingas tik mezenchiminėms kamieninėms ląstelėms. Daroma prielaida, kad ramybės būsenos ląstelės atstovauja neprisijungusių daugiapotenčių mezenchiminių pirmtakų ląstelių populiacijai, nes jos neekspresuoja ląstelių, skirtų osteo- (Cbfa-1) arba adipogenezei (PPAR-y-2), žymenų. Ilgalaikis lėtai proliferuojančių ramybės būsenos ląstelių veikimas vaisiaus galvijų serumu sukelia galutinai diferencijuotų įsipareigojusių pirmtakų, kuriems būdingas greitas augimas, susidarymą. Tokių mezenchiminių kamieninių ląstelių kloninę plėtrą palaiko FGF2. Atrodo, kad stromos kamieninių ląstelių genomas yra gana sandariai „uždaras“. Yra pranešimų apie savaiminės diferenciacijos nebuvimą MSC – nesant specialių įsipareigojimo sąlygų, jos net netransformuojasi į mezenchiminės linijos ląsteles.

Siekiant ištirti mezenchiminių kamieninių ląstelių darinių populiacijos struktūrą, stromos ląstelių linijose ir pirminėse kultūrose atliekama diferenciacijos žymenų baltymų paieška. Kaulų čiulpų kolonijas formuojančių ląstelių in vitro kloninė analizė parodė, kad EGF, taikomas pirminėms kultūroms, padidina vidutinį kolonijos dydį ir sumažina šarminės fosfatazės kloninę raišką, o hidrokortizono pridėjimas aktyvuoja šarminės fosfatazės, kuri yra MSC diferenciacijos osteogeninės krypties žymuo, raišką. Monokloniniai antikūnai prieš STRO-1 leido atskirti ir ištirti STRO-1 teigiamų adhezinių ląstelių populiaciją heterogeninėje Dexterio kultūrų sistemoje. Nustatytas citokinų spektras, kuris reguliuoja ne tik hematopoetinių ir limfoidinių ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją, bet ir dalyvauja skeleto audinių formavime, formavime ir rezorbcijoje per para-, auto- ir endokrininius mechanizmus. Receptorių tarpininkaujantis tokių antrinių pasiuntinių kaip cAMP, diacilglicerolis, inozitolio trifosfatas ir Ca2+ išsiskyrimas taip pat naudojamas įvairių kategorijų stromos audinių ląstelių, ekspresuojančių atitinkamus receptorius, žymenų analizei. Monokloninių antikūnų naudojimas kaip žymenys leido nustatyti limfoidinių organų stromos retikulinių ląstelių priklausymą T ir B priklausomoms zonoms.

Kurį laiką tęsėsi mokslinės diskusijos apie MSC kilmės iš kraujodaros kamieninių ląstelių galimybę. Iš tiesų, kai kaulų čiulpų ląstelių suspensijos perkeliamos į monosluoksnines kultūras, jose auga atskiros fibroblastų kolonijos. Tačiau buvo įrodyta, kad fibroblastų kolonijų pirmtakų ir įvairių kraujodaros audinių diferenciacijos daigų buvimas kaulų čiulpuose neįrodo jų bendros kilmės iš kraujodaros kamieninių ląstelių. Naudojant kaulų čiulpų kamieninių ląstelių diskriminantinę analizę, nustatyta, kad heterotopinės kaulų čiulpų transplantacijos metu susidaranti mikroaplinka nėra perduodama kraujodaros ląstelėmis, o tai įrodo, kad kaulų čiulpuose egzistuoja MSC populiacija, kuri histogenetiškai nepriklauso nuo kraujodaros ląstelių.

Be to, selektyvus klonavimo metodas leido identifikuoti naują stromos progenitorinių ląstelių kategoriją kaulų čiulpų ląstelių monosluoksninėse kultūrose, nustatyti jų skaičių ir ištirti jų savybes, proliferacinį ir diferenciacinį potencialą. Paaiškėjo, kad stromos fibroblastų tipo ląstelės proliferuoja in vitro ir sudaro diploidines kolonijas, kurios, persodintos atgal į organizmą, užtikrina naujų kraujodaros organų formavimąsi. Atskirų klonų tyrimo rezultatai rodo, kad tarp stromos progenitorinių ląstelių yra ląstelių populiacija, kuri pagal savo proliferacinį ir diferenciacinį potencialą gali teigti, kad tai stromos audinio kamieninės ląstelės, histogenetiškai nepriklausomos nuo kraujodaros kamieninių ląstelių. Šios populiacijos ląstelėms būdingas savarankiškas augimas ir jos diferencijuojasi į kaulų, kremzlės ir kaulų čiulpų tinklinio audinio progenitorinius ląstelių elementus.

Didelį įdomumą kelia R. Chailakhyano ir bendraautorių (1997–2001 m.) tyrimų rezultatai, kurių metu triušių, jūrų kiaulyčių ir pelių kaulų čiulpų stromos progenitorinės ląstelės buvo kultivuojamos a-MEM maitinamojoje terpėje, į kurią buvo įdėta vaisiaus veršelio serumo. Autoriai atliko eksplantaciją, kurios pradinis tankis buvo 2–4 x 103 kaulų čiulpų ląstelių 1 cm2. Homologinės arba heterologinės spinduliuote inaktyvuotos kaulų čiulpų ląstelės buvo naudojamos kaip maitinamoji terpė, kurios dozė išlaikė maitinamosios terpės efektą, bet visiškai blokavo jų proliferaciją. Dviejų savaičių amžiaus pirminės atskiros fibroblastų kolonijos buvo tripsinu apdorotos, siekiant gauti monoklonines padermes. Kolonijų kloninės kilmės įrodymai buvo gauti naudojant chromosomų žymeklį mišriose jūrų kiaulyčių patinų ir patelių kaulų čiulpų kultūrose, gyvų kultūrų fotografiją pagreitintu laiku ir mišriose CBA ir CBAT6T6 pelių singeninių kaulų čiulpų kultūrose. Šviežiai izoliuotų kaulų čiulpų ląstelių arba in vitro užaugintų stromos fibroblastų suspensijos transplantacija po inkstų kapsule buvo atlikta į ivalono arba želatinos porėtus karkasus, taip pat į inaktyvuotą triušio kempinės pavidalo kaulinę matricą. Klonų transplantacijai į kaulinį apvalkalą jūrų kiaulyčių šlaunikauliai buvo išvalyti nuo minkštųjų audinių ir antkaulio, epifizės apkarpytos, o kaulų čiulpai kruopščiai išplauti. Kaulas buvo supjaustytas į fragmentus (3–5 mm), išdžiovintas ir apšvitintas 60 Gy doze. Atskiros fibroblastų kolonijos buvo dedamos į kaulinius apvalkalus ir implantuojamos į raumenis. In vitro užaugintų stromos fibroblastų intraperitoninei transplantacijai buvo naudojamos A (V = 0,015 cm3, h = 0,1 mm) ir O (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) tipo difuzijos kameros.

Tirdami kloninių padermių augimo dinamiką, R. Chailakhyan ir kt. (2001) nustatė, kad atskiros ląstelės, formuojančios fibroblastų kolonijas, taip pat ir jų palikuonys, turi milžinišką proliferacinį potencialą. Iki 10-ojo pasažo kai kuriose padermėse fibroblastų skaičius siekė 1,2–7,2 x 109 ^ląstelių. Jų vystymosi metu jos atliko iki 31–34 ląstelių padvigubėjimą. Šiuo atveju heterotopinė kaulų čiulpų kilmės padermių, susidariusių iš kelių dešimčių klonų stromos pirmtakų, transplantacija lėmė kaulų čiulpų mikroaplinkos perkėlimą ir naujo kraujodaros organo susidarymą transplantacijos zonoje. Autoriai iškėlė klausimą, ar atskiri klonai geba perkelti stromos ląstelių kaulų čiulpų mikroaplinką, ar tam reikalingas kelių skirtingų klonogeninių stromos pirmtakų bendradarbiavimas? Ir jei atskiri klonai geba perkelti mikroaplinką, ar ji bus išsami visiems trims kraujodaros daigams, ar skirtingi klonai užtikrina mikroaplinkos susidarymą skirtingiems kraujodaros daigams? Siekiant išspręsti šias problemas, buvo sukurta stromos progenitorinių ląstelių kultivavimo ant kolageno gelio technologija, leidžianti išaugintas fibroblastų kolonijas pašalinti iš paviršiaus vėlesnei heterotopinei transplantacijai. Atskiri iš CBA pelių ir jūrų kiaulyčių kaulų čiulpų ląstelių išauginti stromos fibroblastų klonai buvo iškirpti kartu su gelio dangos fragmentu ir heterotopiškai persodinti – po singeninių pelių inkstų kapsule arba į autologinių jūrų kiaulyčių pilvo raumenis. Persodinus į raumenis, ant gelio esančios kolonijos buvo dedamos į kaulų apvalkalus.

Autoriai nustatė, kad praėjus 50–90 dienų po kaulų čiulpų fibroblastų kolonijų transplantacijos, 20 % atvejų transplantacijos zonoje buvo pastebėtas kaulo arba kaulinio ir kraujodaros audinio vystymasis. 5 % recipientų gyvūnų susidariusiuose kaulinio audinio židiniuose buvo ertmė, užpildyta kaulų čiulpais. Kaulinių cilindrų viduje tokie židiniai buvo apvalios formos ir turėjo kapsulę, sudarytą iš kaulinio audinio su osteocitais ir gerai išsivysčiusiu osteoblastiniu sluoksniu. Kaulų čiulpų ertmėje buvo tinklinio audinio su mieloidinėmis ir eritroidinėmis ląstelėmis, kurių proporcingas santykis nesiskyrė nuo normalių kaulų čiulpų. Inkstuose transplantatas buvo tipiškas kaulų čiulpų organas, susiformavęs natūralių kaulų čiulpų transplantacijos metu, o kaulinė kapsulė dengė kaulų čiulpų ertmę tik iš inkstų kapsulės pusės. Hematopoetiniame audinyje buvo mieloidinių, eritroidinių ir megakariocitinių elementų. Kaulų čiulpų ertmės stroma turėjo gerai išsivysčiusią sinusų sistemą ir tipiškas riebalų ląsteles. Tuo pačiu metu kai kurių kolonijų transplantacijos zonoje po inkstų kapsule buvo rasta kaulinio audinio be kraujodaros požymių. Atskirų klonų proliferacinio ir diferenciacinio potencialo tyrimas buvo tęsiamas su triušių monokloninėmis kaulų čiulpų padermėmis, kurių ląstelės buvo resuspenduotos maitinamojoje terpėje ir atskiroje ivalono kempinėje, kurios masė 1-2 mg, buvo persodintos po triušio kaulų čiulpų donoro inkstų kapsule. Tokia autotransplantacija buvo atlikta 21 monokloninės padermės ląstelėms. Rezultatai buvo įvertinti po 2-3 mėnesių. Autoriai nustatė, kad 14 % atvejų persodintos monokloninės padermės suformavo kaulų čiulpų organą, sudarytą iš kaulinio audinio ir kaulų čiulpų ertmės, užpildytos kraujodaros ląstelėmis. 33 % atvejų persodintos padermės suformavo kompaktišką įvairaus dydžio kaulą su ertmėse įmūrytais osteocitais ir išsivysčiusiu osteoblastiniu sluoksniu. Kai kuriais atvejais kempinėse su persodintais klonais išsivystė tinklinis audinys be kaulo ar kraujodaros elementų. Kartais susiformavo tinklinė stroma su gerai išvystytu sinusoidų tinklu, bet be kraujodaros ląstelių. Taigi gauti rezultatai buvo panašūs į duomenis, gautus klonų transplantacijos ant kolageno gelio metu. Tačiau, jei transplantuojant ant substrato išaugintus klonus, 5 % atvejų susidarė kaulų čiulpų audinys, 15 % – kaulinis audinys, o 80 % – tinklinis audinys, tai transplantuojant monoklonines padermes, kaulų čiulpų elementų susidarymas pastebėtas 14 % atvejų, kaulinio audinio – 53 %, o tinklinio audinio – 53 % atvejų. Pasak autorių, tai rodo, kad transplantacijos ant porėtų karkasų metu stromos fibroblastų proliferacinio ir diferenciacinio potencialo įgyvendinimo sąlygos buvo optimalesnės nei transplantacijos metu į kaulų apvalkalus ir ant kolageno substrato.Gali būti, kad naudojant pažangesnius klonų kultivavimo ir atvirkštinės transplantacijos metodus galima pagerinti jų diferenciacijos potencialo realizavimo sąlygas klonais ir pakeisti šiuos santykius. Vienaip ar kitaip, tačiau pagrindinė atliktų tyrimų reikšmė yra ta, kad kai kurie stromos ląstelių klonai geba formuoti kaulinį audinį ir vienu metu užtikrinti stromos hematopoetinę mikroaplinką trims kaulų čiulpų hematopoezės daigams: eritroidiniam, mieloidiniam ir megakariocitiniam, sukurdami gana dideles hematopoetinio audinio ir tam tikros kaulų masės platformas.

Tada autoriai nagrinėjo atskirų klonogeninių stromos progenitorinių ląstelių gebėjimo atlikti tokio tipo ląstelių diferenciaciją uždaroje difuzijos kamerų sistemoje klausimą. Be to, reikėjo nustatyti, ar atskiri klonai pasižymi polipotencija, ar diferenciacijos potencialo pasireiškimui reikalinga kelių klonų, turinčių fiksuotą citodiferenciacijos požymį, kooperacinė sąveika, kurių skirtingi santykiai lemia pirmenybę teikiantį kaulinio, tinklinio ar kremzlinio audinio formavimuisi. Derindami du metodologinius metodus – monokloninių kaulų čiulpų stromos progenitorinių ląstelių padermių gavimą ir jų persodinimą į difuzijos kameras – R. Chailakhyan ir bendraautoriai (2001) gavo rezultatų, kurie leido jiems priartėti prie kaulų čiulpų stromos struktūrinės organizacijos supratimo. Monokloninių stromos progenitorinių ląstelių padermių transplantacija į O tipo kameras lėmė ir kaulinio, ir kremzlinio audinio susidarymą, o tai rodo vienos stromos kolonijas formuojančios ląstelės palikuonių gebėjimą vienu metu formuoti kaulinį ir kremzlinį audinį. Ne kartą buvo keliama prielaida, kad kaulinis ir kremzlinis audinys kyla iš bendros stromos progenitorinės ląstelės. Tačiau ši hipotezė neturėjo teisingo eksperimentinio patvirtinimo. Kaulų ir kremzlių susidarymas difuzijos kamerose buvo būtinas įrodymas, kad tarp kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių egzistuoja bendros šių dviejų audinių tipų pirmtakinės ląstelės.

Tuomet 29 antrojo ir trečiojo pasažo kloninės padermės, gautos iš pirminių triušių kaulų čiulpų kultūrų, buvo patalpintos difuzijos kamerose ir implantuotos intraperitoniškai homologiškiems gyvūnams. Tyrimai parodė, kad 45 % kaulų čiulpų monokloninių padermių turi osteogeninį potencialą. Devyniose kamerose buvo tik tinklinis audinys, tačiau dar 13 kamerų, kurios sudarė 76 % visų padermių, jo buvo kartu su kauliniu ir kremzliniu audiniu. O tipo kamerose, kuriose buvo įmanoma diferencijuoti ir kaulinį, ir kremzlinį audinį, buvo tirtos 16 padermių. Keturiose kamerose (25 %) susiformavo ir kaulinis, ir kremzlinis audinys. Dar kartą reikėtų pažymėti, kad R. Chailakhyan ir kt. (2001) tyrimuose atskiros progenitorinės ląstelės vienoje ląstelių padermėje dvigubėjo nuo 31 iki 34 kartų, o jų palikuonys sudarė 0,9–2,0 x 109 ^ląstelių. Polikloninių padermių progenitorinių ląstelių atliktų mitozių skaičius buvo praktiškai identiškas monokloninių padermių mitozių skaičiui. Polikloninių padermių vystymosi greitis, ypač pirmajame jų formavimosi etape, labai priklausė nuo kolonijų, panaudotų padermėms inicijuoti, skaičiaus. Žmogaus embriono fibroblastų (WI-38) diploidinės padermės, pakartotinai klonuotos 12–15-ajame dvigubėjimo lygyje, taip pat suformavo kolonijas, kurios skyrėsi skersmeniu ir ląstelių kiekiu. Didelės kolonijos, turinčios daugiau nei 103 ląstelių, sudarė tik 5–10 %. Didėjant dalijimųsi skaičiui, didelių kolonijų procentinė dalis sumažėjo. Kaulų čiulpų stromos fibroblastų mono- ir polikloninės padermės išlaikė diploidinį chromosomų rinkinį po 20 ar daugiau dvigubėjimų, o jų vystymosi tendencija buvo panaši į embriono fibroblastų diploidinių padermių vystymosi dinamiką. Atskirų kaulų čiulpų stromos progenitorinių ląstelių diferenciacijos potencialo analizė, atlikta persodinant monoklonines padermes į difuzijos kameras, parodė, kad pusė jų buvo osteogeninės. Didelės kolonijos sudarė 10 % viso jų skaičiaus. Todėl osteogeninių kolonijas formuojančių ląstelių skaičius atitiko maždaug 5 % viso jų populiacijos. Bendra autorių nustatytų osteogeninių progenitorinių ląstelių masė apėmė ląsteles, galinčias vienu metu formuoti kaulinį ir kremzlinį audinį. Be to, pirmą kartą nustatyta, kad šie du audinių tipai suaugusio organizmo sudėtyje turi bendrą progenitorinę ląstelę: 25 % tirtų klonų buvo sukurti tokių ląstelių, o jų skaičius bendroje progenitorinių ląstelių populiacijoje buvo ne mažesnis kaip 2,5 %.

Taigi, heterotopinė atskirų kaulų čiulpų fibroblastų klonų transplantacija atskleidė naujus mezenchiminių progenitorinių ląstelių populiacijos struktūrinės organizacijos aspektus. Rastos stromos progenitorinės ląstelės, gebančios vienu metu perkelti specifinę mikroaplinką visiems kraujodaros daigams, kurių skaičius tarp didelių klonų, tirtų skirtinguose modeliuose, svyruoja nuo 5 iki 15 % (0,5–1,5 % nuo viso aptiktų progenitorinių ląstelių skaičiaus). Kartu su klonais, kurie perkelia visą kaulų čiulpų mikroaplinką, yra ir progenitorinių ląstelių, kurioms lemta tik osteogenezė, kurios, perkeltos atviroje sistemoje, sudaro kaulinį audinį, kuris nepalaiko kraujodaros vystymosi. Jų skaičius nuo bendro progenitorinių ląstelių skaičiaus yra 1,5–3 %. Kai kurios iš šių ląstelių geba formuoti kaulinį audinį su ribotu savikontrolės laikotarpiu. Todėl stromos progenitorinių ląstelių populiacija yra nevienalytė savo diferenciacijos potencialu. Tarp jų yra ląstelių kategorija, kurios teigia esančios stromos kamieninėmis ląstelėmis, gebančiomis diferenciuotis visomis trimis kaulų čiulpų stromos audiniui būdingomis kryptimis, formuodamos kaulinį, kremzlinį ir tinklinį audinį. Pateikti duomenys leidžia tikėtis, kad, naudojant įvairius ląstelių žymenis, bus galima nustatyti kiekvieno tipo stromos ląstelių indėlį į specifinės mikroaplinkos organizavimą ir hematopoezės palaikymą Dexterio kultūrose.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių savybės

Pastaraisiais metais nustatyta, kad stacionariose kaulų čiulpų kultūrose daugiapotentėms mezenchiminėms progenitorinėms ląstelėms būdinga ribota mažų agranulinių ląstelių (RS-1 ląstelių) populiacija, kuriai būdingas mažas kolonijų formavimo pajėgumas ir proliferuojančioms ląstelėms būdingo Ki-67 antigeno ekspresijos nebuvimas. Neaktyvių RS-1 ląstelių antigeniniai parametrai skiriasi nuo sparčiai proliferuojančių įsipareigojusių stromos progenitorinių ląstelių antigenų spektro. Nustatyta, kad didelis įsipareigojusių progenitorinių ląstelių proliferacijos greitis stebimas tik esant RS-1 ląstelėms. Savo ruožtu RS-1 ląstelės padidina savo augimo greitį veikiant faktoriams, kuriuos išskiria brandžiausi daugiapotenčių mezenchiminių progenitorinių ląstelių dariniai. Atrodo, kad RS-1 ląstelės yra nesusijusių MSC, galinčių perdirbtis, poklasis. In vitro 5-fluorouracilui atsparioms kaulų čiulpų stromos progenitorinėms ląstelėms būdingas mažas RNR kiekis ir didelė ornitino dekarboksilazės geno, neproliferuojančių ląstelių žymens, ekspresija.

Intensyvi stromos progenitorinių ląstelių proliferacija prasideda po jų fiksacijos ant substrato. Šiuo atveju išreiškiami blogai diferencijuotų ląstelių žymenų profiliai: SH2 (TGF-(3) receptorius), SH3 (signalinio baltymo domenas), I ir III tipo kolagenas, fibronektinas, adhezijos receptoriai VCAM-1 (CD106) ir ICAM (CD54), kadherinas-11, CD44, CD71 (transferino receptorius), CD90, CD120a ir CD124, tačiau be būdingų kraujodaros kamieninių ląstelių žymenų (CD34, CD14, CD45) ekspresijos. Kloninis augimas leidžia pakartotinai persuoti mezenchimines kamienines ląsteles, kultūroje susidarant daugybei genetiškai homogeniškų stromos progenitorinių pluripotentinių ląstelių. Po 2-3 persėjimų jų skaičius pasiekia 50-300 milijonų. Pakankamo tankio kultūroje, nutraukus proliferaciją, stromos progenitorinės ląstelės, skirtingai nei kraujodaros audinių fibroblastai, diferencijuojasi į adipocitus, miocitus, kremzlės ir kaulų ląsteles. Trijų reguliavimo diferenciacijos signalų derinys, įskaitant 1-metilizobutilksantiną (ląstelės viduje susidarančio cAMP formavimosi induktorių), deksametazoną (fosfolipazių A ir C inhibitorių) ir indometaciną (ciklooksigenazės inhibitorių, kuris taip pat mažina tromboksano sintazės aktyvumą), iki 95 % mezenchiminių progenitorinių ląstelių paverčia adipocitais. Adipocitų susidarymą iš nesubrendusių stromos elementų patvirtina lipoproteinų lipazės geno ekspresija, apolipoproteinų ir peroksisominių receptorių histocheminis nustatymas. To paties klono ląstelės, veikiamos TGF-β serumo neturinčioje terpėje, sukuria homogeninę chondrocitų populiaciją. Šio kremzlinio audinio daugiasluoksnei ląstelių kultūrai būdinga išsivysčiusi tarpląstelinė matrica, sudaryta iš proteoglikano ir II tipo kolageno. Maistinėje terpėje su 10 % diferenciacijos signalo komplekso, sudaryto iš b-glicerofosfato (neorganinio fosfato donoro), askorbo rūgšties ir deksametazono, poveikis toje pačioje stromos progenitorinių ląstelių kultūroje lemia ląstelių agregatų susidarymą. Tokiose ląstelėse stebimas laipsniškas šarminės fosfatazės aktyvumo ir osteopontino lygio padidėjimas, rodantis kaulinio audinio susidarymą, kurio ląstelių mineralizaciją patvirtina laipsniškas tarpląstelinio kalcio kiekio padidėjimas.

Remiantis kai kuriais duomenimis, mezenchiminių kamieninių ląstelių gebėjimas neribotai dalytis ir daugintis įvairių tipų mezenchiminės diferenciacijos linijos ląstelėms yra derinamas su dideliu plastiškumo laipsniu. Patekusios į smegenų skilvelius arba baltąją medžiagą, mezenchiminės kamieninės ląstelės migruoja į nervinio audinio parenchimą ir diferencijuojasi į glijos arba neuronų ląstelių linijos darinius. Be to, yra informacijos apie MSC transdiferenciaciją į kraujodaros kamienines ląsteles tiek in vitro, tiek in vivo. Išsamesnė kai kurių tyrimų analizė nustatė išskirtinai didelį MSC plastiškumą, kuris pasireiškia jų gebėjimu diferencijuotis į astrocitus, oligodendrocitus, neuronus, kardiomiocitus, lygiųjų raumenų ląsteles ir griaučių raumenų ląsteles. Nemažai tyrimų apie MSC transdiferenciacijos potencialą in vitro ir in vivo nustatė, kad daugiapotencės kaulų čiulpų kilmės mezenchiminės progenitorinės ląstelės galutinai diferencijuojasi į ląstelių linijas, kurios sudaro kaulinį, kremzlinį, raumenų, nervų ir riebalinį audinį, taip pat sausgysles ir stromą, kurios palaiko kraujodarą.

Vis dėlto kituose tyrimuose nepavyko atskleisti jokių mezenchiminių kamieninių ląstelių genomo ir stromos ląstelių pirmtakų populiacijų pluripotentiškumo ribojimo požymių, nors buvo ištirta daugiau nei 200 iš vienos pirminės kultūros išskirtų MSC klonų, siekiant patikrinti galimą stromos ląstelių pluripotentiškumą. Didžioji dauguma klonų in vitro išlaikė gebėjimą diferenciuotis osteogenine, chondrogenine ir adipogenine kryptimis. Atmetus recipientų ląstelių migracijos tikimybę persodinant mezenchimines kamienines ląsteles po inkstų kapsule arba difuzijos kamerose, paaiškėjo, kad stromos pirmtakinės ląstelės in situ išlaiko heterogeninį fenotipą, o tai rodo arba restrikcijos faktorių nebuvimą transplantacijos zonoje, arba paties MSC pluripotentiškumo nebuvimą. Tuo pačiu metu leidžiamas reto tipo somatinių pluripotentinių kamieninių ląstelių, kurios yra dažni visų suaugusių kamieninių ląstelių pirmtakai, egzistavimas.

Tikrųjų mezenchiminių kamieninių ląstelių, kurios sudaro labai mažą kaulų čiulpų ląstelių dalį ir tam tikromis sąlygomis in vitro auginimo metu gali proliferuoti be diferenciacijos, multipotencialumas, bet ne pluripotentiškumas, įrodytas jų indukuotu prisijungimu prie kaulų, kremzlių, riebalinio, raumeninio audinio ląstelių, taip pat tenocitų ir stromos elementų, kurie palaiko kraujodarą. Paprastai ilgalaikis sąlytis su auginimo terpe su vaisiaus veršiuko serumu provokuoja MSC išsiskyrimą į įsipareigojusias stromos pirmtakines ląsteles, kurių palikuonys patiria savaiminę galutinę diferenciaciją. In vitro galima pasiekti tikslinį osteoblastų susidarymą į kondicionavimo terpę pridedant deksametazono, β-glicerofosfato ir askorbo rūgšties, o deksametazono ir insulino diferenciacijos signalų derinys sukelia adipocitų susidarymą.

Nustatyta, kad prieš pereinant į terminalinės diferenciacijos stadiją, kaulų čiulpų MSC tam tikromis kultūros sąlygomis iš pradžių diferencijuojasi į fibroblastų tipo mezenchimines kamienines ląsteles. Šių ląstelių dariniai in vivo dalyvauja kaulų, kremzlių, sausgyslių, riebalinio ir raumeninio audinio, taip pat hematopoezę palaikančios stromos formavime. Daugelis autorių terminą „multipotentinės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės“ supranta kaip pačias MSC ir įsipareigojusias kaulų čiulpų bei mezenchiminių audinių stromos pirmtakines ląsteles. Kloninė multipotentinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių, kilusių iš kaulų čiulpų, analizė parodė, kad šiek tiek daugiau nei trečdalis visų klonų diferencijuojasi į osteo-, chondro- ir adipocitus, o likusių klonų ląstelės turi tik osteogeninį potencialą ir sudaro tik chondro- ir osteocitus. Multipotentinių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių, tokių kaip BMC-9, klonas, esant tinkamoms mikroaplinkos sąlygoms, diferencijuojasi į ląsteles, turinčias ne tik osteoblastų, chondrocitų ir adipocitų, bet ir hematopoezę palaikančių stromos ląstelių fenotipą ir funkcines savybes. Iš žiurkės vaisiaus kaulų čiulpų išskirtas RCJ3.1 ląstelių klonas diferencijuojasi į įvairių fenotipų mezenchimines ląsteles. Veikiant askorbo rūgščiai, b-glicerofosfatui ir deksametazonui, šio klono ląsteliniai elementai pirmiausia suformuoja daugiabranduolinius miocitus, o vėliau – adipocitus, chondrocitus ir mineralizuoto kaulinio audinio saleles. Žiurkių vaisių antkaulio granuliuotų ląstelių populiacija atitinka nesusijusias daugiapotentes mezenchimines pirmtakines ląsteles, nes jai būdingas mažas proliferacijos greitis, ji neekspresuoja diferenciacijos žymenų ir kultūros sąlygomis diferencijuojasi į chondro-, osteo- ir adipocitus, taip pat lygiųjų raumenų ląsteles.

Taigi, reikėtų pripažinti, kad mezenchiminių kamieninių ląstelių genomo pluri- arba multipotentiškumo klausimas lieka atviras, o tai atitinkamai veikia ir idėjas apie stromos progenitorinių ląstelių diferenciacijos potencialą, kuris taip pat nėra galutinai nustatytas.

Eksperimentiškai įrodyta ir svarbi mezenchiminių kamieninių ląstelių savybė yra jų gebėjimas palikti audinių nišą ir cirkuliuoti bendroje kraujotakoje. Kad aktyvuotų genetinės diferenciacijos programą, tokios cirkuliuojančios kamieninės ląstelės turi patekti į tinkamą mikroaplinką. Įrodyta, kad sistemingai įvedant MSC į recipientų gyvūnų kraujotaką, nesubrendusios ląstelės implantuojamos į įvairius organus ir audinius, o vėliau diferencijuojasi į kraujo ląsteles, miocitus, adipocitus, chondrocitus ir fibroblastus. Dėl to vietinėse audinių zonose vyksta signalinė-reguliacinė sąveika tarp neesminių ir įsipareigojusių stromos pirmtakinių ląstelių, taip pat tarp jų ir aplinkinių subrendusių ląstelių. Daroma prielaida, kad diferenciaciją sukelia mezenchiminės ir nemechiminės kilmės parakrininiai reguliavimo faktoriai (augimo faktoriai, eikozanoidai, tarpląstelinės matricos molekulės), kurie užtikrina erdvinius ir laiko ryšius daugiapotenčių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių mikroaplinkoje. Todėl vietinis mezenchiminio audinio pažeidimas turėtų lemti daugiapotenčių mezenchiminių pirmtakinių ląstelių mikroaplinkos zonų, kurios kokybiškai skiriasi nuo nepažeistų audinių reguliavimo signalų komplekso, susidarymą, kuriose vyksta fiziologiniai, o ne reparaciniai regeneracijos procesai. Šis skirtumas yra nepaprastai svarbus kalbant apie ląstelių fenotipo specializaciją normalioje ir pažeidimų sukeltoje mikroaplinkoje.

Remiantis koncepcijomis, būtent čia slypi esminio skirtumo tarp dviejų žinomų procesų – fiziologinės regeneracijos ir uždegiminės proliferacijos – mechanizmai. Pirmasis iš jų baigiasi specializuotos audinio ląstelinės sudėties ir jos funkcijos atkūrimu, o proliferacijos proceso įgyvendinimo rezultatas yra subrendusių jungiamojo audinio elementų susidarymas ir pažeistos audinio zonos funkcijos praradimas. Taigi, norint sukurti optimalias daugiapotencinių mezenchiminių progenitorinių ląstelių naudojimo regeneracinėje-plastinėje medicinoje programas, būtina atlikti išsamų mikroaplinkos veiksnių poveikio MSC diferenciacijai tyrimą.

Kamieninių ląstelių skyriaus struktūros priklausomybė nuo ląstelių para- ir autokrinių reguliatorių, kurių raišką moduliuoja išoriniai signalai, nekelia abejonių. Tarp reguliavimo veiksnių funkcijų svarbiausios yra asimetrinio MSC dalijimosi kontrolė ir genų, lemiančių įsipareigojimo stadijas ir ląstelių dalijimųsi skaičių, raiška. Išorinius signalus, nuo kurių priklauso tolesnis MSC vystymasis, teikia jų mikroaplinka. Nesubrendusios būsenos MSC ilgą laiką proliferuoja, išlaikydamos gebėjimą diferencijuotis į adipocitų, miofibroblastų, hematogeninės audinių stromos, kremzlės ir kaulų ląsteles. Nustatyta, kad ribota CD34 neigiamų stromos ląstelių elementų, cirkuliuojančių kraujyje, populiacija iš bendros kraujotakos grįžta į kaulų čiulpų stromą, kur transformuojama į CD34 teigiamų kraujodaros kamieninių ląstelių linijas. Šie stebėjimai rodo, kad progenitorinių mezenchiminių ląstelių recirkuliacija kraujyje palaiko stromos kamieninių ląstelių audinių pusiausvyrą skirtinguose organuose, mobilizuodama bendrą nesubrendusių kaulų čiulpų stromos elementų telkinį. MSC diferenciacija į ląsteles su keliais mezenchiminiais fenotipais ir jų dalyvavimas kaulų, kremzlių, riebalinio audinio ir sausgyslių regeneracijoje ar atstatyme in vivo buvo įrodyta naudojant adaptyvaus perdavimo modelius eksperimentiniams gyvūnams. Pasak kitų autorių, tolima MSC migracija kraujagyslių vaga yra derinama su trumpais atstumais arba lokaliu daugiapotenčių mezenchiminių pirmtakų ląstelių judėjimu audinio viduje kremzlės atstatymo, raumenų regeneracijos ir kitų atstatymo procesų metu.

Vietinės stromos audinių bazės kamieninės atsargos veikia kaip ląstelių šaltinis fiziologinio audinių regeneracijos procesuose ir yra papildomos tolimu MSC pernešimu, kai sunaudojami stromos audinių kamieniniai ištekliai. Tačiau esant skubiam reparacinio ląstelių potencialo mobilizacijos poreikiui, pavyzdžiui, politraumos atveju, visas MSC ešelonas dalyvauja reparacinio regeneracijos procesuose, o mezenchiminės kaulų čiulpų pirmtakinės ląstelės per bendrą kraujotaką patenka į periferiją.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacija

Galima įžvelgti tam tikrų paralelių tarp fiziologinės audinių regeneracijos procesų ir jų susidarymo intrauterininės raidos metu. Žmogaus ir žinduolių embriogenezės metu įvairių tipų specializuotos ląstelės susidaro iš gemalinių sluoksnių ekto-, mezo- ir endoderminio telkinio, tačiau būtinai dalyvaujant mezenchimams. Laisvas embriono mezenchiminio audinio ląstelių tinklas atlieka daugybę reguliavimo, metabolinių, karkasinių ir morfogenetinių funkcijų. Laikinieji organai kloduojami tik po mezenchimo kondensacijos dėl klonogeninio pirmtakinių ląstelių augimo, kurios generuoja pirminius organogenezės morfogenetinius signalus. Embriono mezenchimo stromos dariniai sukuria laikinųjų organų ląstelinį karkasą ir sudaro pagrindą jų būsimam energetiniam-plastiniam aprūpinimui dėl pirminių kraujo ir limfagyslių augimo. Kitaip tariant, vaisiaus organų mikrocirkuliacinio vieneto stromos elementai atsiranda dar prieš susidarant jų struktūriniams ir funkciniams vienetams. Be to, aktyvi mezenchiminių ląstelių migracija organogenezės metu suteikia besivystančių organų erdvinę orientaciją, pažymint jų tūrio ribas per homeotinių Hox tipų apribojimą. Stromos karkasas taip pat yra parenchiminių organų struktūrinių ir funkcinių vienetų, kurie dažnai apima morfogenetiškai ir funkciškai visiškai skirtingas ląsteles, surinkimo pagrindas. Todėl embriogenezės metu mezenchimo funkcijos yra pirminės ir realizuojamos generuojant reguliavimo signalus, kurie aktyvina regioninę epitelio progenitorinių ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją. Embrioninės mezenchimo ląstelės gamina augimo faktorius, tokius kaip HGF-b, HGF-b, CSF, kuriems parenchiminės progenitorinės ląstelės turi atitinkamus receptorius. Diferencijuotame subrendusiame suaugusio organizmo audinyje stromos ląstelių tinklas taip pat generuoja signalus, skirtus nemechiminės kilmės progenitorinių ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai palaikyti. Tačiau postnatalinės ontogenezės metu stromos reguliavimo signalų spektras yra skirtingas (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF ir kt.) ir yra skirtas užtikrinti fiziologinę regeneraciją arba pažeistų audinių zonų atstatymą. Be to, stromos reguliavimo veiksnių spektrinės charakteristikos kiekviename audinių tipe ir net viename organe yra skirtingos. Visų pirma, hematopoezė ir limfopoezė su hematopoetinių ir imunokompetentinių ląstelių proliferacija ir diferenciacija vyksta tik tam tikruose organuose, kurių ribose veikia stromos mikroaplinka, sudarydama sąlygas hematopoetinių ir limfoidinių ląstelių brendimui. Hematopoetinių ir limfoidinių ląstelių gebėjimas atkurti tam tikrą organą, proliferuoti ir bręsti jo mikrostruktūrinėse nišose priklauso nuo mikroaplinkos reguliavimo veiksnių.

Tarp tarpląstelinės matricos komponentų, kuriuos gamina multipotentinės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės, reikėtų atkreipti dėmesį į fibronektiną, lamininą, kolageną ir proteoglikanus, taip pat į CD44 (hialuronano ir osteopontino receptorius), kurie atlieka svarbų vaidmenį organizuojant tarpląstelinę sąveiką ir formuojant tarpląstelinę matricą kaulų čiulpuose ir kauliniame audinyje. Įrodyta, kad kaulų čiulpų multipotentinės mezenchiminės pirmtakinės ląstelės sukuria stromos mikroaplinką, kuri teikia indukcinius ir reguliavimo signalus ne tik MSC, bet ir hematopoetinėms pirmtakėms bei kitoms nemechiminėms kaulų čiulpų kamieninėms ląstelėms. Yra žinoma, kad MSC dalyvavimą kraujodaroje lemia jų gebėjimas diferencijuotis į stromos ląsteles, palaikančias kraujodarą, o šį instruktyvų signalą MSC gauna tiesiogiai iš hematopoetinių kamieninių ląstelių. Štai kodėl kultūroje stromos pirmtakinių ląstelių tinklas tarnauja kaip visų hematopoetinių ląstelių klonų vystymosi maitinimo bazė.

Subrendusiame organizme hemo- ir limfopoezės intensyvumas yra dinaminės pusiausvyros būsenoje su subrendusių kraujo ląstelių ir imuninės sistemos ląstelių „išnaudojimu“ periferijoje. Kadangi kaulų čiulpų ir limfoidinių organų stromos ląstelės atsinaujina itin retai, reikšmingas stromos struktūrų pertvarkymas jose nevyksta. Sistemą gali išvesti iš dinaminės pusiausvyros mechaninis bet kurio hemo- ar limfopoezės organo pažeidimas, dėl kurio atsiranda vienodi nuoseklūs pokyčiai, susiję ne tik su hematopoetiniais ar limfoidiniais elementais, kiek su pažeisto organo stromos struktūromis. Reparacinės regeneracijos procese pirmiausia susidaro stromos bazė, kurią vėliau papildo hematopoetinės arba imunokompetentės ląstelės. Šis seniai žinomas faktas daro potrauminę regeneraciją patogiu modeliu tiriant hematopoetinių organų stromos mikroaplinką. Visų pirma, mechaninis vamzdinių kaulų medulinės ertmės ištuštinimas naudojamas tiriant kaulų čiulpų reparacinę regeneraciją – kiuretažą, kuris leidžia greitai ir efektyviai pašalinti kraujodaros audinį iš dinaminės pusiausvyros būsenos. Tiriant hematopoetinių ir stromos kaulų čiulpų komponentų reparacinės regeneracijos procesus po mechaninio jūrų kiaulyčių blauzdikaulio šerdies ertmės ištuštinimo, nustatyta, kad nėra tiesioginės koreliacijos tarp hematopoetinių ir stromos ląstelių regeneracijos rodiklių (hematopoetinių ląstelių skaičiaus, stromos pirmtakinių ląstelių koncentracijos ir skaičiaus). Be to, paaiškėjo, kad stromos pirmtakinių ląstelių populiacijos padidėjimas po kiuretažo įvyksta anksčiau, o patys stromos fibroblastai tampa fosfatazės teigiami, kas būdinga osteogeniniam audiniui. Taip pat nustatyta, kad 3–5 vamzdinių kaulų kiuretažas lemia šių ląstelių populiacijos augimą neoperuotų kaulų kaulų čiulpuose ir net blužnyje, kuri jūrų kiaulytėms yra išskirtinai limfopoetinis organas.

Jūrų kiaulyčių išgręžtų blauzdikaulių reparacinių procesų morfologinis vaizdas iš esmės atitinka literatūroje aprašytus duomenis, gautus atliekant eksperimentus su kitų rūšių gyvūnais, o pokyčių, atsirandančių pašalinus kraujodaros audinį, dinamika visoms gyvūnų rūšims yra vienoda, o skirtumas susijęs tik su laiko parametrais. Morfologiškai kraujodaros atkūrimo fazinė tvarka ištuštėjusioje kaulų čiulpų šerdyje susideda iš nuoseklių kraujo krešulio organizacijos, šiurkščiojo skaidulinio kaulinio audinio susidarymo, jo rezorbcijos, sinusoidų vystymosi ir tinklinės stromos susidarymo procesų, kuri vėliau vėl užpildoma kraujodaros elementais. Šiuo atveju kamieninių kraujodaros ląstelių skaičius kaulų čiulpų audinių regeneracijos procese didėja lygiagrečiai su kraujodaros kamieninių ląstelių kiekio padidėjimu.

J. Gerasimovas ir bendraautoriai (2001) palygino kraujodaros ląstelių ir stromos pirmtakų ląstelių skaičiaus pokyčius atskiruose regeneracijos proceso etapuose. Paaiškėjo, kad kiekybiniai kaulų čiulpų ląstelių pokyčiai kiuretuotame kaule atitinka regeneracijos morfologinių charakteristikų dinamiką. Autoriai ląstelių kiekio sumažėjimą regenerate per pirmąsias tris dienas sieja su kraujodaros ląstelių žūtimi dėl nepalankaus mikroaplinkos poveikio, kurią sukuria proliferuojantis tinklinis audinys konservuotuose kaulų čiulpuose epifizės srityje, taip pat su osteoidinio audinio židinių susidarymu pastarajame ir kraujagyslių pažeidimu kiuretažo metu. 7–12 dieną branduolinių ląstelių lygio padidėjimas sutampa su atskirų mieloidinės kraujodaros židinių atsiradimu stromos elementų proliferacijos zonose. 20 dieną atsiranda reikšmingos regeneruotų kaulų čiulpų ir gerai išsivysčiusių sinusų sritys, kurias lydi reikšmingas bendro ląstelių skaičiaus padidėjimas. Tačiau kraujodaros elementų skaičius per šį laikotarpį sudaro 68 % kontrolinio lygio. Tai atitinka anksčiau paskelbtus duomenis, kad kraujodaros ląstelių skaičius po kiuretažo pasiekia normą tik 35–40 dieną po operacijos.

Ankstyvuoju potrauminiu laikotarpiu pagrindinis kraujodaros atkūrimo šaltinis yra vietiniai ląsteliniai elementai, išsaugoti kiuretažo metu. Vėlesniuose etapuose pagrindinis kaulų čiulpų kraujodaros audinio regeneracijos šaltinis yra kamieninės ląstelės, atkuriančios laisvas stromos zonas. Kalbant apie atskiras stromos ląstelių kategorijas (endotelio, tinklines ir osteogenines), šaltiniai, užtikrinantys jų susidarymą kaulų čiulpų ertmės reorganizavimo metu, lieka neaiškūs. J. V. Gerasimovo ir bendraautorių (2001) tyrimo rezultatai rodo, kad po kiuretažo išsaugotuose kaulų čiulpuose fibroblastų kolonijas formuojančių ląstelių koncentracija yra žymiai didesnė nei normaliuose kaulų čiulpuose. Autoriai mano, kad kiuretažas lemia intensyvesnį selektyvų kraujodaros ląstelių išplovimą, palyginti su kolonijas formuojančiomis stromos ląstelėmis, kurios dalyvauja stromos formavime ir yra stipriau susijusios su jos pagrindine medžiaga nei kraujodaros ląstelės.

Fibroblastų kolonijas formuojančių ląstelių skaičiaus pokyčio dinamika koreliuoja su osteogenezės procesų intensyvumu, vėlesne kaulų trabekulų rezorbcija ir tinklinės stromos, kurią užpildo kraujodaros ląstelės, susidarymu. Dauguma stromos pirmtakinių ląstelių nurodytais regeneracijos terminais sudaro šiurkštų skaidulinį kaulinį audinį ir tinklinę stromą. Šlaunikaulio lūžių atveju, užsitęsusios osteosintezės sąlygomis, 5-tą dieną regeneracijos zonoje padidėja fibroblastų kolonijas formuojančių ląstelių koncentracija ir skaičius, o intensyvaus kaulų formavimosi laikotarpiu jų skaičius padidėja 6 kartus. Yra žinoma, kad fibroblastų kolonijas formuojančios kaulų čiulpų ląstelės turi osteogeninių savybių. Stromos pirmtakinių ląstelių skaičius padidėja prieš tai, kai kraujodaros ląstelės apsigyvena sukietėjusioje kaulų čiulpų teritorijoje. Tai gerai atitinka duomenis, kad stromos ląstelės užtikrina kraujodaros mikroaplinkos susidarymą. Matyt, kraujodaros mikroaplinkos sukūrimas atitinka tam tikrą stromos audinių regeneracijos lygį, o kraujodaros ląstelių skaičius didėja plečiantis kraujodarai tinkamai stromos platformai.

Didžiausią susidomėjimą kelia autorių duomenys, rodantys, kad iškart po kiuretažo padidėja stromos progenitorinių ląstelių skaičius atokiose skeleto dalyse. Nuo šeštos valandos iki dvidešimtos dienos imtinai kontralateraliniame blauzdikaulyje stebimas daugiau nei dvigubas fibroblastų kolonijas formuojančių ląstelių koncentracijos ir skaičiaus padidėjimas. Šio reiškinio mechanizmas tikriausiai susijęs su tuo, kad dėl didelio kaulų čiulpų pažeidimo susidaro daug kraujo krešulių, tuo pačiu metu sunaikinama daug trombocitų ir į kraują išsiskiria trombocitų augimo faktorius (PDGF), kuris, kaip žinoma, sukelia ląstelių, formuojančių fibroblastų kolonijas, esančias organizme už proliferacinio telkinio ribų, proliferaciją. Eksperimentuose su triušiais vietinis MSC vartojimas skatina chirurginiu būdu pažeisto kelio sąnario kremzlės audinio atsistatymą, o tai gali būti susiję su chondrocitų, kilusių iš suleistų MSC, susidarymu. Tačiau laboratorinių žiurkių kaulų defektų reparacinė regeneracija žymiai pagerėja naudojant keraminiame karkase esančias mezenchimines kamienines ląsteles. Todėl galima daryti prielaidą, kad jei ne RBOC, tai koks nors kitas veiksnys, kilęs iš pažeistų stromos ląstelių, daro tolimą stimuliuojantį poveikį mezenchiminių progenitorinių ląstelių proliferacijai nepažeistose kaulų čiulpų zonose ir skatina jų migraciją į kaulų čiulpų defekto vietą. Savo ruožtu tai prieštarauja ankstesnių metų literatūros duomenys, rodantys, kad už mikroaplinką atsakingos stromos ląstelės, skirtingai nei hematopoetinės ląstelės, negali migruoti ir yra kilusios iš vietinių šaltinių.

Nepaisant to, J. Gerasimovo ir bendraautorių (2001 m.) tyrimo rezultatai rodo, kad mechaninė trauma sukelia ne tik staigų stromos audinio restruktūrizavimą kiurete, bet ir reikšmingus stromos pokyčius tolimuose nepažeistuose kauluose, t. y. atsiranda sisteminė stromos audinio reakcija į vietinę traumą. Be to, kai padaroma politrauma – daugkartinis kiuretažas – ši reakcija sustiprėja ir stebima ne tik operuotame kaule ir tolimose skeleto dalyse, bet ir limfoidiniuose organuose, ypač blužnyje. Tokio sisteminio kaulų čiulpų ir blužnies stromos audinio atsako į vietinę traumą ir politraumą mechanizmas lieka nežinomas. Manoma, kad šis procesas susijęs su humoralinio faktoriaus, kurį išskiria kaulų čiulpų šerdies ertmės mezenchiminė stroma, veikimu. Kaulų čiulpų ir blužnies stromos ląstelių galimybę gaminti organui nespecifinį humoralinį faktorių, atsakingą už ląstelių, sudarančių fibroblastų kolonijas, proliferaciją, įrodo duomenys apie jų kolonijas stimuliuojantį aktyvumą monosluoksninėse kaulų čiulpų kultūrose.

Šiuo atžvilgiu verta paminėti, kad sistemingai skiriant daugiapotentines mezenchimines progenitorines ląsteles, jų dariniai vėl užpildo ne tik kaulų čiulpus, bet ir kitus audinius, o tai ypač naudojama genų terapijai. Įrodyta, kad į veną suleidus didelius kiekius MSC su laukinio tipo genomu pelėms, turinčioms mutaciją kolageno I gene, donoro ląstelės pakeičia iki 30% recipientų kaulų ir kremzlių audinių ląstelių, o transfekuotos pelių mezenchiminės kamieninės ląstelės, išskiriančios žmogaus IL-3, veiksmingai palaiko kraujodarą 9 mėnesius, jei jos kartu su žmogaus kraujodaros kamieninėmis ląstelėmis skiriamos imunodeficito pelėms.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Mezenchiminių kamieninių ląstelių genetinė modifikacija

Tarp sėkmingų eksperimentinės MSC genetinės modifikacijos atvejų verta paminėti IX faktoriaus geno transfekciją į žmogaus MSC, o vėliau perkėlus transfektantines ląsteles į imunodeficitines peles, kraujyje 8 savaites po transplantacijos atsiranda antihemofilinis B faktorius. Šiame eksperimente transfekuotose ląstelėse buvo atlikta posttransliacinė IX faktoriaus modifikacija γ-glutamilkarboksilaze. MSC transdukcija retrovirusiniu vektoriumi, koduojančiu žmogaus IX faktorių, buvo mažiau sėkminga – vėlesnis šių ląstelių įvedimas šuniui, sergančiam hemofilija B, užtikrino terapinį IX faktoriaus lygį, palaikant normalų krešėjimo hemostazės intensyvumą tik 12 dienų.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacija į gyvūnų smegenų parenchimą parodė, kad nesubrendusios donoro ląstelės transformuojasi tiek į neuronų, tiek į glijos populiacijas. Sveiko donoro mezenchiminio audinio neuroninių darinių įskiepijimas teoriškai leidžia ištaisyti genetinius smegenų metabolizmo sutrikimus pacientams, sergantiems Gošė liga ir kitais lipidų, gangliozidų ar angliavandenių metabolizmo sutrikimais.

Eksperimentinės kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių transdiferenciacijos į nervines ir kepenų audinių pirmtakines ląsteles sąlygos tęsiamos. Tyrėjų dėmesys sutelktas į diferenciacijos induktorių ir specialių kondicionuotų terpių derinius. Visų pirma, norint išskirti pirminę stromos ląstelių kultūrą, į jas 200 000/cm2 tankiu pasėjamos nuplautos ir DMEM/F12 (1/1) kultūros terpėje su 10 % vaisiaus veršiuko serumo resuspenduotos kaulų čiulpų ląstelės. Po 24 valandų neprilipusios ląstelės pašalinamos, o prie plastiko prilipusios fibroblastų tipo ląstelės kultivuojamos vieną savaitę. Kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciacijai į neuroblastus naudojama kondicionuota terpė, gauta tris dienas kultivuojant pirminę pelių embrioninių fibroblastų kultūrą, taip pat DMEM/F12 terpė (1/1) su 2 % vaisiaus veršiuko serumu ir 20 ng/ml NF arba 10-6 M retinoinės rūgšties (neuroinduktorius, naudojamą pelių ir žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių neuroninei diferenciacijai). Kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciacija į hepatocitų pirmtakines ląsteles indukuojama kondicionuotoje terpėje, sukurtoje tris dienas auginant pirminę pelių embrioninių kepenų ląstelių kultūrą DMEM/F12 terpėje (1/1), į kurią įdėta 10 % vaisiaus veršelio serumo.

Čia dar kartą reikėtų pažymėti, kad kaulų čiulpų stromos kolonijas formuojančios ląstelės yra heteromorfinės ir gali būti suskirstytos į du tipus. Pirmajam tipui priklauso fibroblastų tipo ląstelės, kurios sudaro filopodijas su dideliais branduoliais ir vienu ar dviem branduolėliais. Antrajam tipui būdingos mažos verpstės formos ląstelės. Auginant abiejų tipų ląsteles kondicionuotoje terpėje, gautoje ant pirminių pelių embrioninių fibroblastų maitinimo sluoksnio, ląstelės, panašios į neuroblastus, kultūroje atsiranda 3–4 dieną. Šiame etape jos dažniausiai turi verpstės formos formą su viena ar dviem ilgomis ataugomis, pasibaigiančiomis filopodijomis. Rečiau pasitaiko piramidės arba žvaigždės formos ląstelės su trumpais dendritais. Kai kurių neuroblastų dendritai distalinėje dalyje turi būdingus išsiplėtimus (augimo pumpurus) ir šakas, o kiti turi ryškius augimo kūgelius su filopodijomis, per kurias auga dendritai. Panašūs morfologiniai požymiai (pumpurai ir augimo kūgeliai su filopodijomis), būdingi neuroblastams, besiskiriantiems į neuronus, buvo išsamiai aprašyti neurogenezės tyrimuose. Remdamiesi tuo, kai kurie autoriai daro išvadą, kad kultūroje rastos ląstelės yra neuroblastai. Visų pirma, E. Ščegelskaja ir bendraautoriai (2002), dvi savaites kultivavę pirminę stromos ląstelių kultūrą kondicionuotoje terpėje, keičiamoje kas 3–4 dienas, nustatė, kad kai kurios ląstelės proliferavo išlaikydamos nediferencijuotą būseną. Išoriškai tokios ląstelės priminė fibroblastus ir kultūroje buvo aptiktos kartu su besiskiriančiais neuroblastais. Dauguma ląstelių (apie 80 %) buvo skirtingose diferenciacijos į nervinio audinio ląsteles, pirmiausia į neuronus, stadijose. Šių ląstelių dendritinės ataugos buvo glaudžiai susijusios viena su kita, todėl ląstelės palaipsniui formavo nervinio tinklo dalis ant substrato ilgų daugialąsčių grandžių pavidalu. Neuroblastų dendritinės ataugos tapo žymiai ilgesnės, kai kurios iš jų 8–10 kartų viršijo paties neurono kūno ilgį. Palaipsniui didėjo piramidinių ir žvaigždinių ląstelių dalis. Žvaigždinių ląstelių dendritai šakojosi. Pasak autorių, vėlesnė piramidinių ir žvaigždinių ląstelių diferenciacija, palyginti su verpstės formos ląstelėmis, atitinka normalios neurogenezės etapų seką gyvūnams. Todėl autoriai daro išvadą, kad kaulų čiulpų stromos kamieninės ląstelės patiria indukuotą neurogenezę, kurios metu iš neuroblastų in vitro susidaro visi trys pagrindiniai neuronų tipai. Nervų ląstelių pirmtakai taip pat buvo aptikti kaulų čiulpų stromos ląstelių kultivavimo metu 3–4 dienas terpėje su 2 % vaisiaus serumu ir 20 ng/ml LIF. Tačiau šiuo atveju kamieninės ląstelės dalijosi labai lėtai, neuroblastų diferenciacija įvyko tik 30 % atvejų ir jos nesudarė neuroninių tinklų. Naudodami retinoinę rūgštį kaip vieną iš nervinių ląstelių diferenciacijos induktorių, autoriai kultūroje gavo iki 25–30 % nervinių ląstelių,su daugiausia glijos elementais - astrocitais ir oligodendrocitais. Neuronai sudarė tik trečdalį visų nervinių ląstelių, nors jie buvo atstovaujami visų trijų tipų: verpstės formos, piramidės ir žvaigždinės ląstelės. Šeštąją stromos ląstelių kultivavimo terpėje su retinoine rūgštimi dieną nervinės ląstelės tapo labiau diferencijuotos, o atskiruose piramidiniuose neuronuose buvo rasti aksonai, kurie normalios neuroontogenezės metu atsiranda vėliau nei formuojasi dendritinės ataugos. Pasak autorių, nepaisant mažo nervinių ląstelių derliaus, retinoinės rūgšties indukcijos metodas turi savo privalumų: oligodendrocitai ir astrocitai atlieka mielinizacijos ir mitybos funkcijas dendritų ir aksonų augimo metu ir yra būtini normaliam nervinio audinio formavimuisi. Todėl pažeistų vietų atstatymui in vivo geriau naudoti neuronų suspensiją, praturtintą glijos ląstelėmis.

Antroje eksperimentų serijoje autoriai bandė sukelti kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciaciją į kepenų ląsteles. Po trijų dienų kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių kultivavimo kondicionuotoje terpėje, gautoje inkubuojant pelių embrioninius hepatocitus, buvo rastos didelės, sferinės ląstelės, dažnai dvibranduolės, su įvairaus dydžio citoplazminiais intarpais. Šios ląstelės buvo skirtingose diferenciacijos stadijose ir skyrėsi dydžiu, branduolių skaičiumi ir intarpais citoplazmoje. Daugumoje šių ląstelių buvo aptiktas glikogenas, kuriuo remdamiesi autoriai jas identifikavo kaip hepatocitų pirmtakines ląsteles. Kadangi kultūroje nerasta ląstelių, panašių į neuroblastus, buvo padaryta išvada, kad kultivuojant embrioninius hepatocitus gautoje kondicionuotoje terpėje trūko nervinių ląstelių diferenciacijos faktorių ir, atvirkščiai, buvo faktorių, skatinančių kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciaciją į hepatocitų pirmtakines ląsteles. Apibendrinant, autoriai teigia, kad kaulų čiulpų stromos ląstelės yra pluripotentiškos, nes jos in vitro diferencijuojasi į nervines arba kepenų audinių ląsteles, priklausomai nuo naudojamos specifinės kondicionuotos terpės ir induktorių.

Kai kurie tyrimai iš tiesų teisingai parodė kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciaciją į kardiomiocitus, kremzlės, kaulinio ir nervinio audinio ląsteles. Yra įrodymų, kad tarp kaulų čiulpų ląstelių yra kamieninių ląstelių populiacijų, galinčių diferencijuotis į hepatocitus. Atsižvelgiant į šiuos duomenis, minėtų eksperimentų su pelėmis rezultatus vis dar galima laikyti dar vienu pluripotentinių mezenchiminių kamieninių ląstelių, galinčių diferencijuotis į įvairių suaugusio organizmo audinių ląsteles, buvimo kaulų čiulpuose patvirtinimu.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacija

Klinikinėje transplantologijoje žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės gali būti naudojamos hematopoetinių kamieninių ląstelių, taip pat jų ankstyvųjų preliminarių palikuonių, plitimui užtikrinti. Visų pirma, autologinių hematopoetinių kamieninių ląstelių ir MSC įvedimas vėžiu sergantiems pacientams po didelės dozės chemoterapijos pagreitina neutrofilų ir trombocitų skaičiaus atkūrimą periferiniame kraujyje. Alo- ir autologinės mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacijos naudojamos daugybinei mielomai, aplazinei anemijai ir savaiminei trombocitopenijai – ligoms, susijusioms su pirminiu hematopoetinio audinio stromos defektu, gydyti. Ląstelių terapijos efektyvumas onkohematologinėje patologijoje daugeliu atvejų yra didesnis, vienu metu įvedant stromos ir hematopoetines kamienines ląsteles, o tai pasireiškia hematopoezės atkūrimo pooperacinio laikotarpio sutrumpėjimu, mirtinų baigčių dėl neselektyvaus regioninių ir cirkuliuojančių vėžio ląstelių sunaikinimo, kurio metu žūsta ir paties paciento hematopoetinės kamieninės ląstelės, skaičiaus sumažėjimu. MSC ir kitų daugiapotenčių mezenchiminių kamieninių ląstelių naudojimo klinikinėje praktikoje perspektyvos atsiranda dėl santykinai lengvo jų gavimo iš kaulų čiulpų aspiratų, plitimo kultūroje ir terapinių genų transfekcijos. Tuo pačiu metu vietinis daugiapotentinių mezenchiminių progenitorinių ląstelių implantavimas gali būti naudojamas kompensuoti vietinius audinių defektus, o esant sisteminiams mezenchiminės kilmės audinių sutrikimams, neatmetama galimybė jų patekti į bendrą kraujotaką.

Darbų, kuriuose stromos ląstelių biologijos požiūriu analizuojamos MSC panaudojimo vietinei, sisteminei transplantacijai ir genų terapijai perspektyvos, autoriai savo samprotavimuose yra atsargesni. Postnataliniai kaulų čiulpai tradiciškai laikomi organu, susidedančiu iš dviejų pagrindinių aiškiai apibrėžtų ląstelių linijų sistemų – paties kraujodaros audinio ir su juo susijusios atraminės stromos. Todėl kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės iš pradžių buvo laikomos išskirtinai stromos pagrindo šaltiniu reguliuojantiems kraujodaros mikroaplinkos faktoriams gaminti. Vėliau tyrėjų dėmesys nukrypo į MSC, kaip skeleto audinių kamieninio šaltinio, vaidmens tyrimus. Naujausi duomenys rodo netikėtą kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciacijos potencialą susidarant nerviniam arba raumeniniam audiniui. Kitaip tariant, mezenchiminės kamieninės ląstelės pasižymi transgemaliniu plastiškumu – gebėjimu diferencijuotis į ląstelių tipus, fenotipiškai nesusijusius su pradinio audinio ląstelėmis. Tuo pačiu metu kai kurie kaulų čiulpų stromos ląstelių biologijos aspektai lieka neaiškūs ir neišspręsti tiek bendra biologine prasme, tiek atskiromis detalėmis, įskaitant kaulų čiulpų stromos ląstelių identifikavimą, prigimtį, kilmę, vystymąsi ir funkciją in vivo, taip pat leistiną diferenciacijos potencialą ex vivo ir terapinio panaudojimo galimybes in vivo. Gauti duomenys apie MSC potencialą, taip pat kitų kamieninių ląstelių regeneracinio potencialo tyrimų rezultatai smarkiai prieštarauja biologijoje nusistovėjusioms dogmoms.

Kultivuojant mažo tankio sąlygomis, kaulų čiulpų stromos kamieninės ląstelės sudaro atskiras kolonijas, kurių kiekviena yra kilusi iš vienos progenitorinės ląstelės. Stromos progenitorinių ląstelių procentinė dalis branduolį turinčiose kaulų čiulpų ląstelėse, nustatoma pagal kolonijų formavimo gebėjimą, labai priklauso tiek nuo kultivavimo sąlygų, tiek nuo MSC rūšių. Pavyzdžiui, graužikams, norint gauti maksimalų stromos progenitorinių ląstelių skaičių, absoliučiai būtina, kad kultūroje būtų apšvitintų kaulų čiulpų maitinančiųjų ląstelių ir serumo, o žmonėms mezenchiminių kamieninių ląstelių kolonijų formavimo efektyvumas nepriklauso nei nuo maitinamosios ląstelės, nei nuo kultivavimo terpės. Žinomų mitogeninių veiksnių, stimuliuojančių stromos progenitorinių ląstelių proliferaciją, skaičius yra ribotas. Tai apima PDGF, EGF, FGF, TGF-b ir IGF1. Optimaliomis kultivavimo sąlygomis polikloninės MSC linijos in vitro gali atlaikyti daugiau nei 50 ląstelių dalijimųsi, todėl iš 1 ml jų aspirato galima gauti milijardus kaulų čiulpų stromos ląstelių.

Tačiau kaulų čiulpų stromos ląstelių populiacija yra heterogeniška, pasireiškianti tiek kolonijų dydžių kintamumu, tiek skirtingu jų susidarymo greičiu, tiek įvairia ląstelių morfologija, apimančia diapazoną nuo fibroblastų formos verpstės formos iki didelių plokščių ląstelių. Tokių kultūrų vystymosi metu po 20 dienų pastebimas ir fenotipinis heterogeniškumas. Kai kurioms kolonijoms būdinga didelė šarminės fosfatazės ekspresija, kitos jos visai neekspresuoja, o trečiojo tipo kolonijos centrinėje srityje yra fosfatazės teigiamos, o periferijoje – neigiamos. Atskiros kolonijos sudaro kaulinio audinio mazgelius (matricos mineralizacijos pradžia žymima dažymu alizarino raudonuoju arba kalciu pagal Van Kossą). Kitose kolonijose kaupiasi riebalai, kurie nustatomi G dažymu aliejiniu raudonuoju. Rečiau mezenchiminių kamieninių ląstelių kolonijos sudaro kremzles, nudažytas Alciano mėlynuoju).

Po ektopinės transplantacijos eksperimentiniams gyvūnams, polikloninės MGK linijos suformuoja ektopinį kaulą su tinkline stroma, susijusia su mielopoeze ir adipocitais, rečiau – su kremzlės audiniu. Transplantavus kaulų čiulpų stromos ląstelių monoklonines linijas, kai kuriais atvejais stebimas chimerizmas, kai de novo kaulas susideda iš kaulinio audinio ląstelių, jame yra donorinės kilmės stromos ir adipocitų, o hematopoetinės linijos ir kraujagyslių sistemos ląstelės yra gautos iš recipiento.

Šių tyrimų rezultatai patvirtina kaulų čiulpų stromos progenitorinių ląstelių, iš kurių buvo gauta kloninė linija, kamieninę prigimtį. Jie taip pat rodo, kad ne visos kultūroje klonogeniškos ląstelės yra išties multipotentinės kamieninės ląstelės. Kai kurie tyrėjai mano, ir mes pritariame jų nuomonei, kad patikimiausią informaciją apie tikrąjį atskirų klonų diferenciacijos potencialą galima gauti tik in vivo po transplantacijos, o ne nustatant jų darinių fenotipą in vitro. Osteo-, chondro- ar adipogenezės fenotipinių žymenų (nustatomų mRNR arba histocheminiais metodais) raiška kultūroje ir net mineralizuotos matricos gamyba neatspindi individualaus klono pluripotentiškumo laipsnio in vivo. Todėl kamieninių ląstelių identifikavimas stromos ląstelių grupėje įmanomas tik a posteriori, esant tinkamoms biologinio transplantacijos tyrimo sąlygoms. Visų pirma, chondrogenezė labai retai stebima atvirose transplantacijos sistemose, o kremzlės susidarymas toli gražu nėra neįprastas uždarose sistemose, tokiose kaip difuzijos kameros arba stromos ląstelių mikromasių kultūros in vitro, kur pasiekiamas vietinis mažas deguonies slėgis, kuris skatina kremzlės audinio susidarymą. Todėl net transplantacijos technika, taip pat nespecifinės in vitro kultūros sąlygos, reikšmingai veikia MSC diferenciacijos diapazoną.

Eksperimentinė transplantacija nustatytomis eksperimentinėmis sąlygomis yra auksinis standartas kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciacijos potencialui nustatyti ir pagrindinis jų identifikavimo elementas. Istoriškai kaulų čiulpų stromos ląstelių transplantacijos tyrimai yra susiję su bendra kaulų čiulpų transplantacijos problema. Nustatyta, kad hematopoetinė mikroaplinka sukuriama persodinant kaulų čiulpų stromos ląstelių linijas ir užtikrina ektopinį hematopoetinio audinio vystymąsi transplantacijos zonoje. Mikroaplinkos kilmė iš donoro ir hematopoetinio audinio kilmė iš šeimininko leidžia mums laikyti ektopinį kaulą tikra „apversta“ kaulų čiulpų transplantacija. Vietinė kaulų čiulpų stromos ląstelių transplantacija skatina efektyvią kaulų defektų korekciją, kuri yra ryškesnė nei savaiminės reparacinės regeneracijos metu. Keletas ikiklinikinių tyrimų su eksperimentiniais modeliais įtikinamai parodė kaulų čiulpų stromos ląstelių transplantacijos naudojimo ortopedijoje galimybę, nors norint optimizuoti šiuos metodus, net ir paprasčiausiais atvejais, reikia atlikti kruopščiausią darbą ir analizę. Visų pirma, dar nėra nustatytos optimalios osteogeninių stromos ląstelių plitimo ex vivo sąlygos, idealaus nešiklio struktūra ir sudėtis, taip pat ląstelių skaičius, reikalingas tūrinei kaulų regeneracijai, lieka neišvystyti.

Be ex vivo išplėstų kaulų čiulpų stromos ląstelių naudojimo mezenchiminės kilmės audinių regeneracijai, netradicinis MSC plastiškumas atveria potencialias galimybes neuronų ląstelių regeneracijai arba genų produktų perdavimui į CNS. Iš esmės tai supaprastina ląstelių terapiją nervų sistemos pažeidimams gydyti, nes nereikia gauti autologinių žmogaus nervinių kamieninių ląstelių. Buvo pranešta apie galimą kaulų čiulpų ląstelių pritaikymą kardiomiocitų ir miogeninių progenitorinių ląstelių, turinčių tiek tikrąją strominę, tiek ekstrastrominę kilmę, generavimui.

Atliekami sisteminės kaulų čiulpų stromos ląstelių transplantacijos eksperimentai, skirti dažnoms skeleto ligoms gydyti. Neabejotina, kad kaulų čiulpų stromos ląstelės yra populiacija, atsakinga už genetinius sutrikimus sergant skeleto ligomis, ką puikiai iliustruoja genetinės informacijos perdavimas naudojant šias ląsteles, dėl kurio eksperimentiniams gyvūnams susidaro patologinis kaulinis audinys. Tačiau stromos ląstelių gebėjimas implantuotis, prigiti, proliferuoti ir diferencijuotis skeleto kauluose po įvedimo į bendrą kraujotaką dar neįrodytas.

Iš dalies taip yra todėl, kad atliekant standartinę kaulų čiulpų transplantaciją stroma nepersodinama kartu su kraujodaros audiniu, todėl dar nėra sukurti griežti kriterijai, skirti įvertinti sėkmingą sistemingai skiriamų stromos ląstelių prigijimą. Reikėtų nepamiršti, kad žymenų genų buvimas audinių ekstraktuose arba donorinės kilmės ląstelių išskyrimas kultūroje nerodo ląstelių prigijimo, o tik jų išgyvenimą. Net ir į pelės galūnę suleidus kaulų čiulpų stromos ląstelių, transplantacijos beveik visiškai neįmanoma, nepaisant to, kad kaulų čiulpų mikrokraujagyslėse randama daug donorinės kilmės ląstelių. Deja, tokios ląstelės paprastai apibūdinamos kaip „prisigijusios“ tiesiog remiantis donorinių ląstelių žymenų genų aptikimu ex vivo kultūroje. Be to, reikia pateikti įtikinamų įrodymų apie ilgalaikę diferencijuotų ir funkciškai aktyvių donorinės kilmės ląstelių integraciją į tiriamus audinius. Daugelyje paskelbtų straipsnių, kuriuose pranešama apie kaulų čiulpų stromos ląstelių prigijimą skelete, aiškių tokio pobūdžio duomenų trūkumas yra ryškus. Vis dėlto reikėtų pažymėti, kad kai kurie teisingi eksperimentai su gyvūnais iš tiesų nustatė ribotą, bet realų stromos progenitorinių ląstelių prigijimą po jų sisteminio vartojimo.

Šie duomenys atitinka tyrimų, kuriuose nagrinėjama galimybė kaulų čiulpų miogenines progenitorines ląsteles pernešti į raumenis per kraujagyslių sistemą, rezultatus. Tačiau nereikėtų pamiršti, kad tiek skeleto, tiek raumeninis audinys formuojasi vystymosi ir augimo metu, remiantis ekstravaskuliniais ląstelių judėjimais, kuriuose naudojami migracijos procesai, nedalyvaujantys kraujotakai. Jei egzistuoja nepriklausomas kraujotakos kelias progenitorinėms ląstelėms pernešti į kietosios fazės audinius, ar galima daryti prielaidą apie fiziologiškai cirkuliuojančių mezenchiminių progenitorinių ląstelių egzistavimą? Kokia šių ląstelių kilmė tiek besivystančiame, tiek postnataliniame organizme ir kaip jos prasiskverbia pro kraujagyslių sienelę? Šių klausimų sprendimas atrodo absoliučiai būtinas ir reikalauja kruopščiausios ikiklinikinės analizės. Net ir radus atsakymus į šiuos klausimus, probleminiai kinetiniai aspektai, susiję su skeleto augimu ir jungiamojo audinio pertvarkymu, liks neišspręsti. Tuo pačiu metu osteogenezės sutrikimų gydymas pakeičiant visą mutavusių skeleto progenitorinių ląstelių populiaciją sveikais stromos elementais atrodo reali klinikinė perspektyva. Šiuo atveju vietinės lūžių zonos ar deformacijos dėl patologinės osteogenezės, taip pat destruktyvūs kaulinio audinio pokyčiai gali būti koreguojami naudojant in vitro kultivuojamas stromos kamienines ląsteles. Todėl patartina būsimus tyrimus sutelkti į autologinių mutavusių osteogeninių progenitorinių ląstelių transformacijos ar genetinės korekcijos ex vivo problemas.

Ląstelių genetinė inžinerija, trumpalaikė ar nuolatinė, tapo ląstelių ir molekulinės biologijos pagrindu, daugelio mokslinių atradimų, susijusių su atskirų baltymų vaidmeniu ląstelių metabolizme in vitro ir in vivo, šaltiniu. Molekulinių technologijų panaudojimas paveldimai patologijai ir žmonių ligoms koreguoti yra labai perspektyvus praktinei medicinai, nes kaulų čiulpų stromos kamieninių ląstelių savybės leidžia sukurti unikalias transplantacijos schemas genetinėms skeleto ligoms koreguoti. Tuo pačiu metu mezenchimines pirmtakines ląsteles galima lengvai gauti iš būsimo recipiento, jos yra tinkamos genetinei manipuliacijai ir gali daugintis dideliais kiekiais per trumpą laiką. Mezenchiminių kamieninių ląstelių naudojimas leidžia išvengti apribojimų ir rizikos, susijusios su genetinės informacinės medžiagos perdavimu tiesiogiai pacientui per intravaskulines vektoriaus konstrukcijas. Panaši strategija taikoma ir embrioninėms kamieninėms ląstelėms, tačiau autologinės postnatalinės kaulų čiulpų stromos ląstelės yra labiau pageidautina medžiaga, nes jų įvedimas pašalina galimas imunologines po transplantacijos komplikacijas. Norint pasiekti trumpalaikį efektą, pavyzdžiui, pagreitinti kaulų regeneraciją, optimaliausias metodas yra mezenchiminių kamieninių ląstelių genetinė modifikacija, naudojant elektroporaciją, cheminę sintezę, lipofekciją, plazmides ir adenovirusines konstrukcijas. Visų pirma, viruso transfekcija į kaulų čiulpų stromos ląsteles BMP-2 pasirodė esanti veiksminga pagreitinant kaulų regeneraciją eksperimentinės politraumos metu. Adenovirusinių vektorių konstrukcijų kūrimas yra pageidautinas dėl toksiškumo nebuvimo. Tačiau kaulų čiulpų stromos ląstelių genetinė modifikacija šiuo atveju pasižymi itin mažu stabilumu. Be to, normalioms transformuotoms kaulų čiulpų stromos ląstelėms reikia naudoti genetinės informacijos vektorių nešėjus, kurie yra 10 kartų užkrečiamesni nei kitų tipų ląstelės, o tai žymiai padidina transfekuotų ląstelių žūties procentą.

Recesyvinių ligų, kurias sukelia tam tikrų genų mažas arba nulinis biologinis aktyvumas, gydymas reikalauja ilgalaikės arba nuolatinės mezenchiminių kamieninių ląstelių modifikacijos, kuriai reikalingi adeno-asocijuoti virusai, retrovirusai, lentivirusai arba adeno-retrovirusinės chimeros. Šių virusų transportavimo regionai geba perkelti didelius DNR transfektus (iki 8 kb). Mokslinėje literatūroje jau buvo pranešta apie kaulų čiulpų stromos ląstelių, transfekuotų retrovirusinėmis konstrukcijomis, koduojančiomis reguliavimo ir žymenų molekulių – IL-3, CD2, VIII faktoriaus, taip pat fermentų, dalyvaujančių L-DOPA sintezėje, sintezę, egzogeninį biologinį aktyvumą. Tačiau net ir šiuose tyrimuose autoriai nurodo keletą apribojimų, kuriuos reikia įveikti prieš praktiškai pritaikant šią technologiją. Pirmoji problema yra MSC modifikacijos proceso optimizavimas ex vivo. Yra žinoma, kad ilgalaikė (3–4 savaičių) kaulų čiulpų stromos ląstelių proliferacija in vitro sumažina jų transfekciją. Tuo pačiu metu, norint pasiekti aukštą MSC genetinės modifikacijos lygį, būtina atlikti kelis transfekcijos ciklus. Antroji problema susijusi su terapinės genų ekspresijos trukme, kuri dar neviršija keturių mėnesių. Natūralus efektyvios genų ekspresijos sumažėjimas atsiranda dėl promotoriaus inaktyvacijos ir modifikuotų ląstelių mirties. Atsižvelgiant į bendras genetinės informacijos perdavimo naudojant mezenchimines kamienines ląsteles perspektyvas, preliminarių tyrimų rezultatai rodo, kad reikia toliau optimizuoti ex vivo transfekcijos metodus, pasirinkti tinkamą promotorių, reguliuojantį biologinį aktyvumą norima kryptimi, ir padidinti modifikuotų kaulų čiulpų stromos ląstelių gebėjimą savarankiškai išlikti in vivo po transplantacijos. Reikėtų pažymėti, kad retrovirusinių konstrukcijų naudojimas kaulų čiulpų stromos ląstelėms modifikuoti norima kryptimi ne visada reikalauja privalomo jų įsitvirtinimo. Transfekuotos mezenchiminės kamieninės ląstelės gali atlikti korekcinę funkciją stabilios rezidencijos fone ir be privalomo aktyvaus fizinio įtraukimo ir funkcionavimo jungiamajame audinyje. Šiuo atveju jas reikėtų laikyti biologiniu mini siurbliu, in vivo gaminančiu faktorių, kurio trūkumas lemia genetinės patologijos pasireiškimą.

Transformuotų kaulų čiulpų stromos ląstelių panaudojimas dominantinei genetinei patologijai, kuriai būdingas patologinio ar nenormalaus biologinio aktyvumo geno raiška, gydyti yra daug problemiškesnis, nes šiuo atveju būtina blokuoti iškreiptos genetinės informacijos perdavimą ar įgyvendinimą. Vienas iš genų inžinerijos metodų yra embrioninių kamieninių ląstelių homologinė rekombinacija, siekiant sukurti transgeninius gyvūnus. Tačiau itin mažas homologinės rekombinacijos laipsnis kartu su tokių rekombinantų identifikavimo, atskyrimo ir išplitimo problemomis vargu ar prisidės prie plataus šio metodo taikymo artimiausioje ateityje, net jei bus sukurti nauji technologiniai metodai. Antrasis dominantinės patologijos genų terapijos metodas pagrįstas pažeistos DNR automatine korekcija, nes genetines mutacijas galima koreguoti įvedant egzogeninę DNR su norima seka (trumpos DNR oligonukleotidai arba chimerinės RNR/DNR oligonukleotidai), kuri jungiasi prie homologų pažeistame genome. Trečiasis variantas apima patologinės informacijos perdavimo blokavimą, kuris pasiekiamas naudojant specialiai sukurtus oligonukleotidus, kurie jungiasi prie konkretaus geno ir sudaro trinarę spiralinę struktūrą, kuri pašalina transkripcijos galimybę.

Nors genetinės ligos korekcija genomo lygmenyje išlieka optimaliausiu ir pageidaujamu terapiniu metodu, mRNR taip pat yra perspektyvus vektorius (galbūt net labiau prieinamas) dominuojančio neigiamo geno blokavimui. Baltymų molekulės su antisensiniais oligonukleotidais arba pilnomis sekomis, kurios blokuoja mRNR prisijungimą prie ląstelės biosintezės aparato, jau seniai naudojamos transliacijai slopinti ir (arba) mRNR degradacijai padidinti. Be to, dvigrandė RNR sukelia greitą mRNR degradaciją, kurios mechanizmas lieka neaiškus. Tačiau mažai tikėtina, kad vien tik iš mutantinio alelio su trumpomis arba pavienėmis mutacijomis transkribuotų mRNR pašalinimas paskatins normalaus alelio mRNR ekspresiją. Alternatyva yra plaktuko galvutės ir plaukų segtuko ribosintezių naudojimas, kurios gali prisijungti prie labai specifinių mRNR sričių, vėliau sukeliant jų skilimą ir inaktyvaciją transliacijos metu. Šiuo metu tiriama šio metodo taikymo patologinės osteogenezės terapijoje galimybė. Nepriklausomai nuo to, kas tiksliai yra taikinys – genominiai ar citoplazminiai elementai, naujų genų terapijos technologijų sėkmę lems reagentų įtraukimo į kaulų čiulpų stromos ląsteles ex vivo efektyvumas, optimalus konkretaus vektoriaus pasirinkimas ir stabilus mezenchiminių kamieninių ląstelių gebėjimas ekspresuoti reikiamus faktorius in vivo.

Taigi, mezenchiminių kamieninių ląstelių, pasižyminčių netikėtomis savybėmis, atradimas sukuria naują ląstelių linijų kūrimo konceptualią schemą. Tačiau norint suprasti stromos kamieninių ląstelių biologinį vaidmenį, jų prigimtį, gebėjimą transdiferencijuotis arba dediferencijuotis, jų fiziologinę reikšmę embriono vystymosi, postnatalinio augimo, brendimo ir senėjimo metu, taip pat žmonių ligų atveju, reikalingi tolesni tarpdisciplininiai tyrimai.