Nervų kamieninės ląstelės

Eksperimentiniai įrodymai apie CNS ląstelių regeneracijos galimybę buvo gauti daug anksčiau nei atradus embrionines kamienines ląsteles, atliekant tyrimus, kurie parodė, kad suaugusių žiurkių smegenų neokortekse, hipokampe ir uoslės svogūnėliuose yra ląstelių, kurios fiksuoja 3H-timidiną, t. y. geba sintetinti ir dalytis baltymais. Dar praėjusio amžiaus 7-ajame dešimtmetyje buvo manoma, kad šios ląstelės yra neuronų pirmtakai ir tiesiogiai dalyvauja mokymosi ir atminties procesuose. Šiek tiek vėliau buvo atskleistas de novo susiformavusių neuronų sinapsių buvimas ir pasirodė pirmieji darbai apie embrioninių kamieninių ląstelių panaudojimą neurogenezės indukcijai in vitro. XX amžiaus pabaigoje eksperimentai su kryptinga ESC diferenciacija į nervines pirmtakines ląsteles, dopaminerginius ir serotonerginius neuronus paskatino peržiūrėti klasikines idėjas apie žinduolių nervinių ląstelių gebėjimą regeneruotis. Daugybės tyrimų rezultatai įtikinamai įrodė tiek neuroninių tinklų restruktūrizavimo realybę, tiek neurogenezės buvimą per visą žinduolių organizmo postnatalinį gyvenimo laikotarpį.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Nervinių kamieninių ląstelių šaltiniai

Žmogaus nervinės kamieninės ląstelės išskiriamos operacijų metu šoninių skilvelių subventrikulinėje srityje ir hipokampo dantytoje vingyje, kurių ląstelės kultūroje sudaro neurosferas (nervines sferas), o pastarąsias išsklaidžius ir suformavus – visus pagrindinius centrinės nervų sistemos ląstelių tipus arba, specialioje terpėje, naujas mikrosferas. Disocijuoto audinio, išskirto iš embrioninių smegenų periventrikulinių sričių, suspensijos kultūrose taip pat atsiranda neurosferų.

Nesubrendusių smegenų ląstelių žymenys yra nestinas, beta-tubulinas III (neuronų linijos žymuo), vimentinas, GFAP ir NCAM, kurie identifikuojami imunocitochemiškai naudojant monokloninius antikūnus. Nestiną (tarpinį neurofilamentų baltymą IV tipą) ekspresuoja multipotentinės neuroektoderminės ląstelės. Šis baltymas naudojamas multipotentinėms neuroepitelinėms progenitorinėms ląstelėms identifikuoti ir išskirti iš CNS naudojant monokloninius antikūnus Rat-401, kurie gali aptikti iki 95 % nervinio vamzdelio ląstelių žiurkių embrionuose vienuoliktą nėštumo dieną. Nestinas nėra ekspresuojamas ant diferencijuotų nervinių kamieninių ląstelių palikuonių, bet yra ankstyvosiose nervinėse progenitorinėse ląstelėse, postmitoziniuose neuronuose ir ankstyvuosiuose neuroblastuose. Šis žymuo buvo naudojamas neuroepitelinėms progenitorinėms ląstelėms identifikuoti ir kamieninių ląstelių egzistavimui CNS įrodyti. Vimentiną (tarpinį neurofilamentų baltymą III tipą) ekspresuoja nervinės ir glijinės progenitorinės ląstelės, taip pat neuronai, fibroblastai ir lygiųjų raumenų ląstelės. Todėl abu imunocitocheminiai žymenys neturi specifiškumo, reikalingo atskirai identifikuoti nervines kamienines ir progenitorines ląsteles. Beta-tubulinas III nustato kamieninių ląstelių diferenciacijos neuroninę kryptį, tuo tarpu I tipo astrocitai identifikuojami pagal GFAP ekspresiją, o oligodendrocitai specifiškai ekspresuoja galaktocerebrozidą (Ga!C).

FGF2 ir EGF veikia kaip mitogenai nervinėms progenitorinėms ląstelėms, palaikydami nediferencijuotų progenitorinių ląstelių proliferaciją kultūroje ir neurosferų formavimąsi. Veikiant FGF2, taip pat naudojant FGF2 + EGF derinį, nervinių kamieninių ląstelių dalijimosi greitis žymiai padidėja. FGF2 proliferacinį poveikį sukelia FGF2-R1 receptoriai. Heparinas padidina FGF2 receptorių prisijungimo afinitetą ir smarkiai sustiprina jų mitogeninį poveikį neuroepitelinėms ląstelėms. Ankstyvosiose embriogenezės stadijose FGF2 receptoriai yra ekspresuojami žiurkės telencephalone, o vėlyvosiose stadijose jų lokalizacija apsiriboja skilvelių zona. Postmitozinių ląstelių FGF2-R1 ekspresijos pikas stebimas pasibaigus ankstyvajai neurogenezės fazei. Pradiniam telencephalono vystymosi laikotarpiui būdingas žemas EGF receptorių ekspresijos lygis, daugiausia ventralinės srities ląstelėse. Vėlyvosiose embriogenezės stadijose EGF-R ekspresija padidėja nugarine kryptimi. Graužikų smegenyse EGF pasižymi dideliu afinitetu transformuojančiam augimo faktoriaus beta receptoriui (TGF-beta-R), prie kurio jis pirmiausia jungiasi. Netiesioginius įrodymus apie EGF-R funkcinį vaidmenį pateikia duomenys apie priekinių smegenų žievės disgenezę, kuri atsiranda vėlyvuoju embriogenezės ir postnatalinės ontogenezės laikotarpiu, sumažėjusią priekinių smegenų funkciją, žievės ląstelių žūtį ir hipokampinę ektopiją EGF receptoriaus geno neturinčioms pelėms. Be to, TGF-α buvimas maistinėje terpėje yra absoliučiai būtinas neurosferų formavimuisi. Pašalinus augimo faktorius iš sąlyginės terpės, ląstelės nustoja dalytis ir vyksta savaiminė diferenciacija, susidarant neuronams, astrocitams ir oligodendroblastams.

Atsižvelgiant į tai, disocijuotų kamieninių ląstelių reaggregacija ir neurosferų kultivavimas atliekami maitinamosiose terpėse, kuriose yra EGF ir bazinio FGF arba FGF2, bet be serumo. Įrodyta, kad EGF sukelia šoninių skilvelių subependiminės zonos kamieninių ląstelių proliferaciją, o bazinis FGF skatina subrendusių smegenų dryžuotojo kūno, hipokampo, neokortekso ir regos nervo kamieninių ląstelių proliferaciją. EGF ir bazinio FGF derinys yra absoliučiai būtinas aktyviai kamieninių ląstelių, išskirtų iš priekinių smegenų trečiojo ir ketvirtojo skilvelių ependimos, taip pat iš krūtinės ir juosmens nugaros smegenų stuburo kanalo, proliferacijai.

Po disociacijos nervinių kamieninių ląstelių suspensija kultivuojama plastikiniuose induose arba daugiašulinėse plokštelėse be lipnaus substrato, siekiant padidinti naujai susidarančių neurosferų dydį, o tai paprastai trunka apie 3 savaites. Neurosferų daugkartinio išsklaidymo ir dauginimo metodas leidžia gauti pakankamą skaičių linijinių daugiapotentinių kamieninių ląstelių klonų intracerebrinei transplantacijai. Šis principas taip pat yra pagrindas sukurti iš žmogaus embriono smegenų išskirtų kamieninių ląstelių banką. Jų ilgalaikis (per kelerius metus) klonavimas leidžia gauti stabilias nervinių kamieninių ląstelių linijas, iš kurių indukuotos diferenciacijos metu susidaro katecholaminerginiai neuronai.

Jei neurosferos nėra išsklaidomos ir auginamos ant lipnių substratų terpėse, kuriose trūksta augimo faktorių, proliferuojančios kamieninės ląstelės pradeda savaime diferencijuotis ir sudaro neuronines ir glijos pirmtakines ląsteles, ekspresuojančias visų tipų nervinių ląstelių žymenis: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubuliną III (neuronai), GFAP (astrocitai) ir CalC, 04 (oligodendrocitai). Skirtingai nuo pelių ir žiurkių ląstelių, neuronai sudaro daugiau nei 40 % visų diferencijuotų ląstelių žmogaus nervinių kamieninių ląstelių kultūrose (nuo 1 iki 5 % graužikams), tačiau oligodendrocitų susidaro žymiai mažiau, o tai labai svarbu demielinizuojančių ligų ląstelių terapijos požiūriu. Problema išsprendžiama pridedant B104 kultūros terpės, kuri stimuliuoja mieliną gaminančių ląstelių susidarymą.

Kultivuojant žmogaus embrionų smegenų nervines pirmtakines ląsteles terpėje, kurioje yra EGF, bazinio FGF ir LIF, nervinės linijos pirmtakinių ląstelių skaičius padidėja 10 milijonų kartų. In vitro išplėstos ląstelės po transplantacijos į subrendusių žiurkių smegenis išlaiko gebėjimą migruoti ir diferencijuotis į nervinius ir glijos elementus. Tačiau in vivo multipotentinių pirmtakinių ląstelių dalijimųsi skaičius yra ribotas. Ne kartą buvo pažymėta, kad Hayflicko riba „suaugusioms“ nervinėms kamieninėms ląstelėms (apie 50 mitozių) vis dar nepasiekiama net eksperimente – neurosferų pavidalo ląstelės savo savybes išlaiko tik 7 mėnesius ir tik po 8 pasažų. Manoma, kad taip yra dėl jų sklaidos metodų ypatumų perėjimo metu (tripsinizacija arba mechaninis poveikis), kurie smarkiai sumažina ląstelių proliferacinį aktyvumą dėl tarpląstelinių kontaktų sutrikimo. Iš tiesų, jei vietoj dispersijos naudojamas neurosferų padalijimo į 4 dalis metodas, ląstelių gyvybingumas perėjimo metu žymiai padidėja. Šis metodas leidžia žmogaus nervines kamienines ląsteles kultivuoti 300 dienų. Tačiau po šio laikotarpio ląstelės praranda mitozinį aktyvumą ir degeneruoja arba pereina į savaiminės diferenciacijos stadiją, susidarant neuronams ir astrocitams. Tuo remdamasis autorius mano, kad 30 mitozių yra maksimalus kultivuojamų nervinių kamieninių ląstelių dalijimųsi skaičius.

Kai žmogaus nervinės kamieninės ląstelės kultivuojamos in vitro, daugiausia susidaro GABAerginiai neuronai. Nesant specialių sąlygų, nervinės progenitorinės ląstelės dopaminerginius neuronus (būtinus Parkinsono ligos ląstelių terapijai) sukelia tik pirmuosiuose perėjimuose, po kurių visi kultūros neuronai susideda tik iš GABAerginių ląstelių. Graužikams IL-1 ir IL-11, taip pat nervinių ląstelių membranų fragmentai LIF ir GDNF in vitro sukelia dopaminerginių neuronų indukciją. Tačiau šis metodologinis metodas žmonėms pasirodė esąs nesėkmingas. Nepaisant to, kai GABAerginiai neuronai persodinami į smegenis in vivo, veikiant mikroaplinkos veiksniams, atsiranda nervinės ląstelės su skirtingais mediatorių fenotipais.

Neurotrofinių faktorių derinių paieška parodė, kad FGF2 ir IL-1 indukuoja dopaminerginių neuroblastų susidarymą, kurie, deja, negali gaminti dopaminerginių neuronų. Hipokampinių kamieninių ląstelių diferenciacija į sužadinančius glutamaterginius ir slopinančius GABA-erginius neuronus vyksta veikiant neurotrofinams, o EGF ir IGF1 indukuoja glutamaterginių ir GABA-erginių neuronų susidarymą iš žmogaus embrionų neuroninių pirmtakų ląstelių. Nuoseklus retinoinės rūgšties ir neurotrofino 3 (NT3) pridėjimas prie kultūros žymiai padidina subrendusių smegenų hipokampinių kamieninių ląstelių diferenciaciją į įvairaus mediatoriaus pobūdžio neuronus, o smegenų kilmės neurotrofinio faktoriaus (BNDF), NT3 ir GDNF derinys gali sukelti piramidinius neuronus hipokampinėse ir neokortikalinėse kultūrose.

Taigi, daugelio tyrimų rezultatai rodo, kad, pirma, kamieninės ląstelės iš skirtingų smegenų struktūrų, veikiamos vietinių specifinių audinių faktorių, gali in vivo diferencijuotis į šioms struktūroms būdingus neuroninius fenotipus. Antra, tikslinė indukuota nervinių kamieninių ląstelių diferenciacija in vitro, naudojant progenitorinių ląstelių klonavimą, leidžia gauti nervines ir glijos ląsteles su specifinėmis fenotipinėmis savybėmis intracerebrinei transplantacijai esant įvairioms smegenų patologijos formoms.

Neabejotina, kad iš embrionų ar suaugusiojo CNS išskirtos pluripotentinės kamieninės ląstelės gali būti laikomos naujų neuronų šaltiniu ir klinikoje naudojamos neurologinei patologijai gydyti. Tačiau pagrindinė kliūtis praktinei ląstelinės neurotransplantacijos plėtrai yra ta, kad dauguma nervinių kamieninių ląstelių po implantavimo į neneurogenines subrendusios CNS zonas nesidiferencijuoja į neuronus. Siekiant įveikti šią kliūtį, siūlomas labai originalus novatoriškas metodas, leidžiantis in vitro gauti gryną neuronų populiaciją iš žmogaus vaisiaus nervinių kamieninių ląstelių po transplantacijos į subrendusios žiurkės CNS. Autoriai įrodo, kad šiuo metodu implantuotų ląstelių diferenciacija baigiasi cholinerginio fenotipo neuronų susidarymu, kuris atsiranda dėl aplinkinės mikroaplinkos veiksnių įtakos. Siūloma technologija yra įdomi kuriant naujų tipų kamieninių ląstelių pagrindu veikiančią terapiją ir pakeitus neuronus, pažeistus dėl traumos ar neurodegeneracinės ligos, nes cholinerginiai neuronai atlieka pagrindinį vaidmenį motorinių, atminties ir mokymosi funkcijų vystyme. Visų pirma, iš žmogaus kamieninių ląstelių išskirti cholinerginiai neuronai gali būti naudojami pakeisti motorinius neuronus, prarastus dėl amiotrofinės lateralinės sklerozės ar nugaros smegenų pažeidimų. Šiuo metu nėra informacijos apie metodus, kaip iš mitogeno suformuotų kamieninių ląstelių populiacijos gauti didelį skaičių cholinerginių neuronų. Autoriai siūlo gana paprastą, bet veiksmingą metodą, kaip stimuliuoti mitogeno suformuotas pirmines žmogaus embriono nervines kamienines ląsteles, kad jos išsivystytų į praktiškai grynus neuronus po implantacijos tiek neurogeninėse, tiek neurogeninėse subrendusios žiurkės CNS zonose. Svarbiausias jų darbo rezultatas yra pakankamai didelio skaičiaus persodintų ląstelių pavertimas cholinerginiais neuronais, implantuojant jas į vidurinę membraną ir nugaros smegenis.

Be to, 8 savaičių amžiaus žmogaus embriono smegenų žievės nervinių kamieninių ląstelių formavimuisi į cholinerginius neuronus in vitro siūloma naudoti įvairius šių trofinių faktorių ir cheminių elementų derinius: rekombinantinį bazinį FGF, EGF, LIF, pelės amino-galinį garso peptidą (Shh-N), trans-retinoinę rūgštį, NGF, BDNF, NT3, NT4, natūralų lamininą ir pelės hepariną. Pradinė žmogaus nervinių kamieninių ląstelių linija (K048) buvo palaikoma in vitro dvejus metus ir atlaikė 85 pasažus be proliferacinių ir diferenciacinių savybių pokyčių, išlaikant normalų diploidinį kariotipą. Nedispersinės 19–55 pasažų (38–52 savaitės) neurosferos buvo uždėtos ant poli-d-lizino ir laminino, o po to apdorotos minėtais faktoriais skirtingomis koncentracijomis, deriniais ir sekomis. Bazinio FGF, heparino ir laminino (sutrumpintai FHL) derinys davė unikalų efektą. Po vienos dienos embrioninių nervinių kamieninių ląstelių kultivavimo FHL terpėje su Shh-N (Shh-N + FHL derinys santrumpoje SFHL) arba be jo, buvo pastebėta sparti didelių plokštuminių ląstelių proliferacija. Priešingai, visi kiti vienos dienos protokolai (pvz., bazinis FGF + lamininas) lėmė ribotą verpstės formos ląstelių radialinį plitimą, ir šios ląstelės nepaliko neurosferų šerdies. Po 6 dienų aktyvacijos ir vėlesnių 10 dienų diferenciacijos B27 turinčioje terpėje, FHL aktyvuotų sferų pakraščiuose buvo aptiktos didelės daugiapolės neuronų tipo ląstelės. Kitose protokolų grupėse dauguma neuronų tipo ląstelių išliko mažos ir bipolinės arba unipolinės. Imunocitocheminė analizė parodė, kad mažos (< 20 μm) bipolinės arba unipolinės ląstelės buvo GABAerginės arba glutamaterginės, o dauguma didelių daugiapolinių ląstelių, lokalizuotų FHL aktyvuotų neurosferų pakraščiuose, buvo cholinerginės, ekspresuojančios cholinerginiams neuronams būdingus žymenis (Islet-1 ir ChAT). Kai kurie iš šių neuronų vienu metu ekspresavo sinapsiną 1. Atlikę penkias nepriklausomų eksperimentų serijas, autoriai nustatė, kad bendra vieno sluoksnio zonų ląstelių populiacija 45,5 % diferencijuojasi į TuJ1+ neuronus, o cholinerginiai (ChAT^) neuronai sudarė tik 27,8 % tos pačios populiacijos ląstelių. Po 10 dienų papildomos diferenciacijos in vitro, be cholinerginių neuronų, FHL aktyvuotose neurosferose rastas nemažas skaičius mažų neuronų – glutamaterginių (6,3 %), GABAerginių (11,3 %), taip pat astrocitų (35,2 %) ir nestino teigiamų ląstelių (18,9 %). Naudojant kitus augimo faktorių derinius, cholinerginių neuronų nebuvo, o neurosferų marginalinėse ląstelėse susidarė arba astrocitai, arba maži glutamaterginiai ir GABAerginiai neuronai. Rezervinio ir aktyvaus potencialų stebėjimas naudojant „visos ląstelės lopo spaustuko“ techniką parodė, kad po septynių dienų FHL aktyvacijos daugumos didelių polipolinių ląstelių ramybės potencialas, nesant veikimo potencialo, buvo -29,0±2,0 mV. Po 2 savaičių ramybės potencialas padidėjo iki -63.6±3,0 mV, o depoliarizuojančių srovių indukcijos metu buvo stebimi veikimo potencialai, kuriuos blokavo 1 M tetrodotoksino, rodantys cholinerginių nesubrendusių neuronų funkcinį aktyvumą.

Autoriai taip pat nustatė, kad FHL arba SFHL aktyvacija in vitro pati savaime nesukelia subrendusių neuronų susidarymo, ir bandė nustatyti, ar FHL arba SFHL iš anksto susiformavusios kamieninės ląstelės, persodintos į subrendusių žiurkių CNS, gali diferencijuotis į cholinerginius neuronus. Šiuo tikslu aktyvuotos ląstelės buvo suleistos į neurogeninę zoną (hipokampą) ir kelias neneurogenines zonas, įskaitant suaugusių žiurkių prefrontalinę žievę, vidurinę membraną ir nugaros smegenis. Implantuotos ląstelės buvo sekamos naudojant CAO-^^p vektorių. Yra žinoma, kad OCP žymi tiek ląstelių ultrastruktūrą, tiek ląstelių procesus (molekuliniu lygmeniu) be nuotėkio ir gali būti tiesiogiai vizualizuojamos. Be to, OCP žymėtos neuroninės kamieninės ląstelės išlaiko neuronų ir glijų diferenciacijos profilį, identišką netransformuotų embrioninių smegenų kamieninių ląstelių profiliui.

^{Praėjus vienai ar dviem savaitėms po 5 x 10⁻⁴} aktyvuotų ir paženklintų nervinių kamieninių ląstelių implantavimo, jos buvo rastos žiurkių nugaros smegenyse arba galvos smegenyse, o OCD+ ląstelės daugiausia buvo šalia injekcijos vietos. Migracijos ir integracijos procesai buvo stebimi jau praėjus mėnesiui po transplantacijos. Migracijos ribos priklausė nuo injekcijos vietos: suleidus į prefrontalinę žievę, OCD+ ląstelės buvo 0,4–2 mm atstumu nuo injekcijos vietos, o implantavus į vidurinę membraną, hipokampą arba nugaros smegenis, ląstelės migravo daug didesnius atstumus – iki 1–2 cm. Transplantuotos ląstelės buvo lokalizuotos labai organizuotose CNS struktūrose, įskaitant kaktinę žievę, vidurinę membraną, hipokampą ir nugaros smegenis. OCD žymėti neuroniniai elementai buvo matomi jau pirmąją savaitę po transplantacijos, o jų skaičius reikšmingai padidėjo praėjus mėnesiui po operacijos. Stereologinė analizė parodė didesnį implantuotų ląstelių išgyvenamumą įvairiose smegenų struktūrose, palyginti su nugaros smegenimis.

Yra žinoma, kad daugumoje suaugusio žinduolio organizmo audinių yra išlikusi regioninių kamieninių ląstelių populiacija, kurios transformaciją į subrendusias ląsteles reguliuoja specifiniai audinių faktoriai. Kamieninių ląstelių proliferacija, pirmtakinių ląstelių diferenciacija ir tam tikrai smegenų struktūrai būdingų neuronų fenotipų susidarymas in vivo daug labiau išreiškiamas embriono smegenyse, o tai lemia didelės vietinės mikroaplinkos morfogenetinių faktorių – neurotrofinų BDNF, NGF, NT3, NT4/5 ir augimo faktorių FGF2, TGF-α, IGF1, GNDF, PDGF – koncentracijos.

Kur yra neuroninės kamieninės ląstelės?

Nustatyta, kad nervinės kamieninės ląstelės ekspresuoja glijos rūgštinį fibrilinį baltymą, kuris tarp subrendusių nervinės linijos ląstelių yra išlikęs tik astrocituose. Todėl astrocitinės ląstelės gali būti kamieninių ląstelių rezervas subrendusioje CNS. Iš tiesų, uoslės svogūnėliuose ir dantytoje vingyje buvo identifikuoti neuronai, kilę iš GFAP teigiamų pirmtakų, o tai prieštarauja tradicinėms idėjoms apie radialinės glijos, kuri suaugus dantytoje vingyje GFAP neekspresuoja, pirmtakinį vaidmenį. Gali būti, kad CNS yra dvi kamieninių ląstelių populiacijos.

Kamieninių ląstelių lokalizacijos subventrikulinėje zonoje klausimas taip pat lieka neaiškus. Kai kurių autorių teigimu, ependiminės ląstelės kultūroje sudaro sferinius klonus, kurie nėra tikros neurosferos (kaip subependiminių ląstelių klonai), nes jos geba diferenciuotis tik į astrocitus. Kita vertus, po fluorescencinio arba virusinio ependiminių ląstelių žymėjimo žymuo aptinkamas subependiminio sluoksnio ir uoslės svogūnėlių ląstelėse. Tokios žymėtos ląstelės in vitro sudaro neurosferas ir diferencijuojasi į neuronus, astrocitus ir oligodendrocitus. Be to, įrodyta, kad apie 5% ependimos ląstelių ekspresuoja kamieninius žymenis – nestiną, Notch-1 ir Mussashi-1. Manoma, kad asimetrinės mitozės mechanizmas susijęs su netolygiu membraninio receptoriaus Notch-1 pasiskirstymu, dėl kurio pastarasis lieka ant dukterinės ląstelės, lokalizuotos ependiminėje zonoje, membranos, o motininė ląstelė, migruojanti į subependiminį sluoksnį, netenka šio receptoriaus. Šiuo požiūriu subependiminė zona gali būti laikoma neuronų ir glijos pirmtakų, susidarančių iš ependiminio sluoksnio kamieninių ląstelių, rinkėju. Kitų autorių teigimu, subventrikulinės zonos kaudalinėse dalyse susidaro tik glijos ląstelės, o neurogenezės šaltinis yra rostrali-lateralinės dalies ląstelės. Trečiajame variante šoninių skilvelių subventrikulinės zonos priekinei ir užpakalinei dalims suteikiamas lygiavertis neurogeninis potencialas.

Ketvirtasis kamieninio rezervo organizavimo centrinėje nervų sistemoje variantas atrodo priimtinesnis, pagal kurį subventrikulinėje zonoje išskiriami trys pagrindiniai nervinių pirmtakų ląstelių tipai - A, B ir C. A ląstelės ekspresuoja ankstyvuosius neuroninius žymenis (PSA-NCAM, TuJl) ir yra apsuptos B ląstelių, kurios pagal antigenų ekspresiją identifikuojamos kaip astrocitai. C ląstelės, neturėdamos neuronų ar glijos antigeninių savybių, pasižymi dideliu proliferaciniu aktyvumu. Autorius įtikinamai įrodė, kad B ląstelės yra uoslės svogūnėlių A ląstelių ir de novo neuronų pirmtakai. Migracijos metu A ląsteles supa nervinių pirmtakų ląstelių grandinės, o tai labai skiriasi nuo postmitozinių neuroblastų migracijos mechanizmo išilgai radialinės glijos embrioninėse smegenyse. Migracija baigiasi uoslės svogūnėliuose, kai vyksta A ir B ląstelių mitozinis dalijimasis, kurių dariniai įtraukiami į granuliarinius ląstelių sluoksnius ir į smegenų uoslės zonos glomerulų sluoksnį.

Besivystančiose embriono smegenyse trūksta diferencijuotų ependiminių ląstelių, o skilvelių sienelėse yra proliferuojančių skilvelių germinalinės ir subventrikulinės zonų kamieninių ląstelių, kur migruoja pirminiai neuro- ir glioblastai. Remdamiesi tuo, kai kurie autoriai mano, kad subrendusių smegenų subependiminėje srityje yra sumažėjęs embriono germinalinis nervinis audinys, kurį sudaro astrocitai, neuroblastai ir neidentifikuotos ląstelės. Tikrosios nervinės kamieninės ląstelės sudaro mažiau nei 1% ląstelių šoninės skilvelio sienelės germinalinėje zonoje. Iš dalies dėl šios priežasties, taip pat dėl duomenų, kad subependiminės zonos astrocitai yra nervinių kamieninių ląstelių pirmtakai, neatmetama astrocitinių glijos elementų transdiferenciacijos galimybė įgyjant neuronų fenotipines savybes.

Pagrindinė kliūtis galutinai išspręsti nervinių kamieninių ląstelių lokalizacijos in vivo problemą yra specifinių šių ląstelių žymenų trūkumas. Nepaisant to, praktiniu požiūriu labai įdomūs yra pranešimai, kad nervinės kamieninės ląstelės buvo išskirtos iš CNS sričių, kuriose nėra subependiminių zonų – priekinių smegenų trečiojo ir ketvirtojo skilvelių, nugaros smegenų krūtinės ir juosmens sričių stuburo kanalo. Ypač svarbu tai, kad nugaros smegenų pažeidimas padidina centrinio kanalo ependiminių kamieninių ląstelių proliferaciją, susidarant progenitorinėms ląstelėms, kurios migruoja ir diferencijuojasi į gliomesoderminio rando astrocitus. Be to, astro- ir oligodendrocitų pirmtakinės ląstelės taip pat buvo rastos nepažeistose suaugusių žiurkių nugaros smegenyse.

Taigi, literatūros duomenys įtikinamai įrodo, kad suaugusių žinduolių, įskaitant žmones, CNS yra regioninis kamieno rezervas, kurio regeneracinis-plastinis pajėgumas, deja, gali užtikrinti tik fiziologinės regeneracijos procesus, formuojant naujus neuroninius tinklus, bet netenkina reparacinės regeneracijos poreikių. Tai kelia užduotį ieškoti galimybių padidinti CNS kamieno išteklius egzogeninėmis priemonėmis, o tai neįmanoma be aiškaus CNS formavimosi mechanizmų supratimo embriono laikotarpiu.

Šiandien žinome, kad embriono vystymosi metu nervinio vamzdelio kamieninės ląstelės yra trijų ląstelių tipų – neuronų, astrocitų ir oligodendrocitų – šaltinis, t. y. neuronai ir neuroglijos yra kilę iš vienos pirmtakinės ląstelės. Ektodermos diferenciacija į nervinių pirmtakinių ląstelių grupes prasideda veikiant bHLH šeimos proneurinių genų produktams ir yra blokuojama Notch šeimos genų receptorių transmembraninių baltymų darinių raiška, kuri riboja nervinių pirmtakinių ląstelių nustatymą ir ankstyvą diferenciaciją. Savo ruožtu Notch receptorių ligandai yra kaimyninių ląstelių transmembraniniai Delta baltymai, dėl kurių tarpląstelinio domeno vyksta tiesioginiai tarpląsteliniai kontaktai su indukcine sąveika tarp kamieninių ląstelių.

Tolesnis embrioninės neurogenezės programos įgyvendinimas yra ne mažiau sudėtingas ir, regis, turėtų būti specifinis rūšiai. Tačiau neuroksenotransplantacijos tyrimų rezultatai rodo, kad kamieninės ląstelės pasižymi ryškiu evoliuciniu konservatyvumu, dėl kurio žmogaus nervinės kamieninės ląstelės, persodintos į žiurkės smegenis, gali migruoti ir vystytis.

Yra žinoma, kad žinduolių CNS pasižymi itin mažu reparacinės regeneracijos pajėgumu, kuriam būdingas naujų ląstelinių elementų, kurie pakeistų dėl traumos žuvusius neuronus, atsiradimo brandžiose smegenyse požymių nebuvimas. Tačiau neuroblastų transplantacijos atveju pastarieji ne tik prigiję, proliferuoja ir diferencijuojasi, bet ir geba integruotis į smegenų struktūras bei funkciškai pakeisti prarastus neuronus. Persodinus įsipareigojusias neuronų progenitorines ląsteles, terapinis poveikis buvo žymiai silpnesnis. Įrodyta, kad tokios ląstelės turi mažą migracijos pajėgumą. Be to, neuronų progenitorinės ląstelės neatkartoja neuroninių tinklų architektūros ir nėra funkciškai integruotos į recipiento smegenis. Šiuo atžvilgiu aktyviai tiriami reparacinės-plastinės regeneracijos klausimai transplantuojant nesusiformavusias daugiapotentines nervines kamienines ląsteles.

M. Aleksandrovos ir kt. (2001) atliktame tyrime, pirmoje eksperimento versijoje, recipientais buvo lytiškai subrendusios žiurkių patelės, o donorais – 15 dienų embrionai. Iš recipientų buvo pašalinta pakaušio smegenų žievės dalis, o į ertmę persodintas mechaniškai suspenduotas numatomos embriono žievės audinys, kuriame yra skilvelių ir subskilvelių sričių multipotentinės kamieninės ląstelės. Antroje eksperimento versijoje 9 savaičių žmogaus embriono nervinės kamieninės ląstelės buvo persodintos į lytiškai subrendusių žiurkių smegenis. Autoriai išskyrė audinių gabalėlius iš embriono smegenų periventrikulinės srities, įdėjo juos į F-12 maistinę terpę ir pakartotinai pipete gavo ląstelių suspensiją, o po to kultivavo specialioje NPBM terpėje, pridedant augimo faktorių – FGF, EGF ir NGF. Ląstelės buvo auginamos suspensijos kultūroje, kol susidarė neurosferos, kurios buvo išsklaidytos ir vėl pasodintos kultūroje. Po 4 pasažų, kurių bendras kultivavimo laikotarpis buvo 12–16 dienų, ląstelės buvo panaudotos transplantacijai. Recipientai buvo dešimties dienų žiurkių jaunikliai ir lytiškai subrendusios dviejų mėnesių Wistar žiurkės, kurioms į šoninį smegenų skilvelį be imunosupresijos buvo suleista 4 μl žmogaus nervinių kamieninių ląstelių suspensijos. Darbo rezultatai parodė, kad disocijuotos žiurkių smegenų žievės embriono anlagės skilvelių ir subskilvelių zonos ląstelės tęsė savo vystymąsi alotransplantacijos į subrendusias smegenis metu, t. y. diferencijuotų recipientų smegenų mikroaplinkos veiksniai neblokavo embriono nervinių kamieninių ląstelių augimo ir diferenciacijos. Ankstyvosiose stadijose po transplantacijos multipotentinės ląstelės tęsė mitozinį dalijimąsi ir aktyviai migravo iš transplantacijos srities į recipientų smegenų audinį. Transplantuotų embrioninių ląstelių, turinčių didžiulį migracijos potencialą, buvo rasta beveik visuose recipientų smegenų žievės sluoksniuose transplantacijos take ir baltojoje medžiagoje. Nervinių ląstelių migracijos trakto ilgis visada buvo žymiai trumpesnis (iki 680 μm) nei glijos elementų (iki 3 mm). Smegenų kraujagyslės ir skaidulinės struktūros tarnavo kaip struktūriniai astrocitų migracijos vektoriai, kas buvo pastebėta ir kituose tyrimuose.

Anksčiau buvo manoma, kad žymėtų astrocitų kaupimasis recipiento smegenų žievės pažeidimo srityje gali būti susijęs su glijos barjero susidarymu tarp transplantato ir recipiento audinių. Tačiau kompaktiškai išsidėsčiusių ląstelių transplantatų struktūros tyrimas parodė, kad jų citoarchitektūrai būdingas chaosas, be jokio sluoksniuoto transplantuotų ląstelių pasiskirstymo. Transplantuotų neuronų tvarkingumo laipsnis priartėjo prie normalių smegenų žievės ląstelių tik tuo atveju, jei tarp donoro ir recipiento audinių nebuvo glijos barjero. Priešingu atveju transplantuotų ląstelių struktūra buvo netipiška, o patys neuronai buvo linkę hipertrofuotis. Atlikus transplantuotų ląstelių neuroimunocheminį tipizavimą, transplantatuose buvo rasti slopinantys GABA-erginiai neuronai ir nustatyta PARV, CALB ir NPY baltymų raiška. Todėl subrendusios smegenys išlaiko mikroaplinkos veiksnius, galinčius palaikyti nervinių multipotentinių ląstelių proliferaciją, migraciją ir specifinę diferenciaciją.

M. Aleksandrova ir kt. (2001) ketvirtajame pasaže, išskirtų iš 9 savaičių embrionų smegenų periventrikulinės srities, žmogaus kamieninių ląstelių kultūroje rado daug nestiną turinčių multipotentinių ląstelių, iš kurių kai kurios jau buvo diferencijuotos in vitro ir vystėsi pagal neuronų tipą, kas atitiko kitų autorių tyrimų rezultatus. Po transplantacijos į suaugusių žiurkių smegenis kultivuotos žmogaus kamieninės ląstelės mitoziškai dalijosi ir migravo į ksenogeninių recipientų smegenų audinį. Ląstelių transplantacijose autoriai stebėjo dvi ląstelių populiacijas – mažas ir didesnes. Pastarosios migravo tiek parenchimoje, tiek recipientų smegenų skaidulų struktūromis nereikšmingais atstumais – per 300 μm. Didžiausias migracijos kelio ilgis (iki 3 mm) buvo būdingas mažoms ląstelėms, iš kurių kai kurios diferencijuojosi į astrocitus, kas buvo nustatyta naudojant monokloninius antikūnus prieš GFAP. Abu ląstelių tipai buvo rasti šoninio skilvelio sienelėje, o tai rodo, kad transplantuotos ląstelės pateko į rostralinį migracijos taką. Tiek žmonių, tiek žiurkių nervinių kamieninių ląstelių astrocitiniai dariniai daugiausia migravo per recipiento smegenų kraujo kapiliarus ir skaidulų struktūras, kas sutampa su kitų autorių duomenimis.

Žmogaus kamieninių ląstelių diferenciacijos in vivo analizė, naudojant monokloninius antikūnus prieš GFAP, CALB ir VIM, atskleidė ir astrocitų, ir neuronų susidarymą. Skirtingai nuo žiurkių transplantacijos ląstelių, daugelis žmogaus kamieninių ląstelių buvo vimentino teigiamos. Dėl to kai kurios žmogaus multipotentinės ląstelės nediferenciavosi. Tie patys autoriai vėliau parodė, kad žmogaus nervinės kamieninės ląstelės, persodintos be imunosupresijos, žiurkių smegenyse išgyvena 20 dienų po transplantacijos, be jokių subrendusių smegenų glijos elementų imuninės agresijos požymių.

Nustatyta, kad net Drosophila nervinės kamieninės ląstelės prigilina ir diferencijuojasi tokio nuo vabzdžių nutolusio taksono kaip žiurkės smegenyse. Autorių eksperimento teisingumas neabejotinas: transgeninėse Drosophila linijose žmogaus neurotrofinių faktorių NGF, GDNF, BDNF genai buvo įterpti į CaSper vektorių, veikiantį Drosophila šilumos šoko promotoriuje, todėl žinduolių kūno temperatūra automatiškai sukėlė jų ekspresiją. Autoriai identifikavo Drosophila ląsteles pagal bakterinio galaktozidazės geno produktą, naudodami histocheminį X-Gal dažymą. Be to, paaiškėjo, kad Drosophila nervinės kamieninės ląstelės specifiškai reaguoja į žmogaus genų koduojamus neurotrofinius faktorius: ksenotransplantuojant transgeninės Drosophila linijos, turinčios gdnf geną, ląsteles, jos diferencijuotose nervinėse kamieninėse ląstelėse smarkiai padidėjo tirozino hidroksilazės sintezė, o ląstelės su ngf genu aktyviai gamino acetilcholinesterazę. Ksenotransplantacija sukėlė panašias nuo genų priklausomas reakcijas kartu su ja persodinto embriono nervinio audinio alotransplantacijos metu.

Ar tai reiškia, kad specifinę nervinių kamieninių ląstelių diferenciaciją sukelia rūšiai nespecifiniai neurotrofiniai faktoriai? Remiantis autorių rezultatais, ksenotransplantatus gaminantys neurotrofiniai faktoriai turėjo specifinį poveikį alograftų likimui, kurie šiuo atveju vystėsi intensyviau ir buvo 2–3 kartus didesni nei į smegenis be ksenograftų įvestų alograftų. Todėl ksenotransplantatų ląstelės, turinčios neurotrofinų genus, ypač geną, koduojantį žmogaus glijos ląstelių neurotrofinį faktorių (GDNF), turi rūšiai nespecifinį poveikį alograftų vystymuisi, panašų į atitinkamo neurotrofino veikimą. Yra žinoma, kad GDNF padidina dopaminerginių neuronų išgyvenamumą žiurkės embriono vidurinėse smegenyse ir sustiprina dopamino metabolizmą šiose ląstelėse, taip pat indukuoja tirozino hidroksilazę teigiamų ląstelių diferenciaciją, skatindamas aksonų augimą ir didindamas neuronų ląstelių kūno dydį. Panašus poveikis pastebėtas ir kultivuotose žiurkės vidurinių smegenų dopaminerginėse neuronuose.

Po ksenotransplantacijos į subrendusių žiurkių smegenis stebima aktyvi žmogaus nervinių kamieninių ląstelių migracija. Yra žinoma, kad nervinių kamieninių ląstelių migracijos ir diferenciacijos procesą kontroliuoja specialių genų rinkinys. Pradinį migracijos signalą pirmtakinei ląstelei, kad būtų pradėta diferenciacija, duoda c-ret protoonkogeno baltyminis produktas kartu su GDNF. Kitas signalas ateina iš mash-1 geno, kuris kontroliuoja ląstelės vystymosi kelio pasirinkimą. Be to, specifinė besiskiriančių ląstelių reakcija taip pat priklauso nuo blakstieninio neurotrofinio faktoriaus α receptoriaus. Taigi, atsižvelgiant į visiškai skirtingą ksenogeninių žmogaus nervinių kamieninių ląstelių ir recipientų žiurkių smegenų ląstelių genetinę konstituciją, būtina pripažinti ne tik neurotrofinių faktorių rūšinį nespecifiškumą, bet ir didžiausią genų, atsakingų už specifinę nervinių kamieninių elementų diferenciaciją, evoliucinį konservatyvumą.

Ateitis parodys, ar embrioninės neuromedžiagos ksenotransplantacija bus įmanoma neurochirurginėje praktikoje gydant neurodegeneracinius patologinius procesus, kuriuos sukelia mielino sintezės sutrikimas oligodendrocituose. Tuo tarpu intensyviausiai nagrinėjami neurotransplantacijos klausimai yra susiję su alogeninių nervinių kamieninių ląstelių gavimu iš embrioninių arba subrendusių smegenų kultūroje ir vėlesne jų nukreipta diferenciacija į neuroblastus arba specializuotus neuronus.

Neuroninių kamieninių ląstelių transplantacija

Siekiant paskatinti suaugusio organizmo nervinių kamieninių ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją, galima persodinti embrioninį nervinį audinį. Gali būti, kad kartu su alograftu įneštos embrioninio nervinio audinio kamieninės ląstelės pačios gali proliferuoti ir diferenciuotis. Yra žinoma, kad po stuburo traumos nervinių laidininkų regeneracija vyksta pailgėjant pažeistiems aksonams ir išaugant nepažeistų motorinių neuronų ataugų aksonams. Pagrindiniai veiksniai, trukdantys nugaros smegenų regeneracijai, yra jungiamojo audinio rando susidarymas pažeidimo vietoje, distrofiniai ir degeneraciniai centrinių neuronų pokyčiai, NGF trūkumas ir mielino skilimo produktų buvimas pažeidimo vietoje. Įrodyta, kad skirtingų ląstelių tipų – suaugusių gyvūnų sėdimojo nervo fragmentų, embrioninės pakaušio žievės, hipokampo, nugaros smegenų, Švano ląstelių, astrocitų, mikroglijos, makrofagų, fibroblastų – transplantacija į pažeistas nugaros smegenis skatina pažeistų aksonų regeneraciją išaugant ir leidžia naujai susiformavusiems aksonams augti per nugaros smegenų pažeidimo zoną. Eksperimentiškai įrodyta, kad embrioninio nervinio audinio transplantacija į nugaros smegenų pažeidimo vietą, veikiant neurotrofiniams faktoriams, pagreitina pažeistų aksonų augimą, neleidžia susidaryti glijos randui ir vystytis distrofiniams bei degeneraciniams procesams centriniuose neuronuose, o transplantuoto embrioninio nervinio audinio ląstelės išgyvena nugaros smegenyse, integruojasi su gretimais audiniais ir skatina aksonų augimą per pažeidimo vietą, susidarant dendritinėms sinapsėms ant stuburo neuronų.

Ši regeneracinės-plastinės medicinos sritis Ukrainoje labiausiai išsivystė V. I. Cimbaliuko vadovaujamos mokslinės komandos darbo dėka. Visų pirma, tai eksperimentiniai embrioninių nervinių audinių transplantacijos veiksmingumo nugaros smegenų pažeidimų atvejais tyrimai. Periferinio nervo autotransplantacijos metu autoriai pastebėjo ryškiausius destruktyvius pokyčius distalinėje siūlės zonoje, kur 30-tą dieną po operacijos jie buvo derinami su reparaciniais procesais. Alotransplantacijos metu implantuoto nervo morfofunkcinė būsena 30-tą dieną pasižymėjo ryškia destrukcijos forma su riebaline degeneracija ir amiloidoze, židininės uždegiminės limfoidinių ląstelių infiltracijos fone, vyraujant Švano ląstelių atrofijai. Embrioninio nervinio audinio transplantacija labiau prisidėjo prie nugaros smegenų laidumo atkūrimo, ypač gyvūnams, kuriems buvo atlikta operacija per pirmąsias 24 valandas po traumos: sumažėjus uždegiminių ir destruktyvių procesų intensyvumui, buvo pastebėta baltymus sintetinančių ir energiją gaminančių stuburo neuronų ultrastruktūrinių elementų hipertrofija ir hiperplazija, oligodendrocitų hipertrofija ir hiperplazija, raumenų veikimo potencialo amplitudė atsistatė 50%, o impulso laidumo greitis – 90%. Vertinant embrioninio nervinio audinio transplantacijos efektyvumą priklausomai nuo transplantacijos zonos, nustatyta, kad geriausi rezultatai gauti, kai transplantatas buvo įvestas tiesiai į nugaros smegenų pažeidimo zoną. Visiškai perskrodus nugaros smegenis, embrioninio nervinio audinio transplantacija buvo neefektyvi. Dinaminiai tyrimai parodė, kad optimalus laikas embrioninio nervinio audinio transplantacijai atlikti yra pirmosios 24 valandos po nugaros smegenų pažeidimo, o operacijos atlikimas ryškių antrinių išeminių-uždegiminių pokyčių, atsirandančių 2–9 dieną po traumos, laikotarpiu turėtų būti laikomas netinkamu.

Yra žinoma, kad sunkus trauminis smegenų sužalojimas sukelia galingą ir ilgalaikį lipidų peroksidacijos aktyvavimą pradiniame ir tarpiniame potrauminio laikotarpio etapuose tiek pažeistame smegenų audinyje, tiek visame kūne, taip pat sutrikdo energijos apykaitos procesus pažeistose smegenyse. Tokiomis sąlygomis embriono nervinio audinio transplantacija į traumos vietą skatina lipidų peroksidacijos procesų stabilizavimąsi ir padidina smegenų bei viso kūno antioksidacinės sistemos potencialą, sustiprina jos antiradikalinę apsaugą 35–60-ą potrauminio laikotarpio dieną. Tuo pačiu laikotarpiu po embriono nervinio audinio transplantacijos normalizuojasi energijos apykaitos ir oksidacinio fosforilinimo procesai smegenyse. Be to, įrodyta, kad pirmąją dieną po eksperimentinės trauminės smegenų traumos pažeisto pusrutulio audinio varža sumažėja 30–37 %, kontralateralinio – 20 %, o tai rodo generalizuotos smegenų edemos vystymąsi. Gyvūnams, kuriems buvo persodintas embrioninis nervinis audinys, edemos involiucija įvyko žymiai greičiau – jau septintą dieną pažeisto pusrutulio audinių vidutinė impedanso vertė pasiekė 97,8 % kontrolinio lygio. Be to, visiškas impedanso verčių atsistatymas 30-tą dieną pastebėtas tik gyvūnams, kuriems buvo persodintas embrioninis nervinis audinys.

Kai kurių smegenų neuronų žūtis po sunkios kaukolės ir smegenų traumos yra viena pagrindinių potrauminių komplikacijų priežasčių. Ypač jautrūs traumoms yra vidurinių smegenų ir pailgųjų smegenų integruojančių dopaminerginių ir noradrenerginių sistemų neuronai. Dopamino kiekio sumažinimas striopallidiniame komplekse ir smegenų žievėje žymiai padidina motorinių ir psichikos sutrikimų, epileptiforminių būsenų išsivystymo riziką, o dopamino gamybos sumažėjimas pagumburyje gali būti daugelio vegetacinių ir somatinių sutrikimų, stebimų vėlyvuoju potrauminiu laikotarpiu, priežastis. Eksperimentinės kaukolės ir smegenų traumos tyrimų rezultatai rodo, kad embrioninio nervinio audinio transplantacija padeda atkurti dopamino kiekį pažeistame smegenų pusrutulyje, dopamino ir norepinefrino kiekį pagumburyje, o norepinefrino ir dopamino kiekį padidinti vidurinėse smegenyse ir pailgosiose smegenyse. Be to, persodinus embrioninį nervinį audinį į eksperimentinių gyvūnų pažeistą smegenų pusrutulį, normalizuojasi fosfolipidų procentinis santykis ir padidėja riebalų rūgščių kiekis (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Šie duomenys patvirtina regeneracinių-plastinių procesų stimuliavimą persodintu embrioniniu nerviniu audiniu ir rodo reparacinį-trofinį transplantacijos poveikį visoms recipiento smegenims.

Ypatingo dėmesio nusipelno Ukrainos medicinos mokslų akademijos A. P. Romodanovo Neurochirurgijos instituto darbuotojų klinikinė patirtis transplantuojant embrioninius nervinius audinius sergant cerebriniu paralyžiumi – itin sudėtinga patologija, turinčia sunkią motorinę disfunkciją. Klinikinės cerebrinio paralyžiaus formos priklauso nuo integralinių struktūrų, atsakingų už raumenų tonuso reguliavimą ir motorinių stereotipų formavimąsi, pažeidimo lygio. Šiuo metu yra pakankamai įrodymų, patvirtinančių faktą, kad patologiniai striopallidinės-talamokortikalinės motorinės kontrolės sistemos pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį motorinės funkcijos ir raumenų tonuso sutrikimuose. Šios sistemos striopallidinė jungtis atlieka kontrolės funkciją per nigrostriatalinę dopamino gamybą. Tiesioginis talamokortikalinės kontrolės įgyvendinimo kelias prasideda nuo putameno neuronų, jį tarpininkauja gama-aminosviesto rūgštis (GASR) ir medžiaga P, ir jis projektuojamas tiesiai į globus pallidus vidinio segmento ir juodosios medžiagos motorinę zoną. Netiesioginis kelias, kurio poveikis realizuojamas dalyvaujant GABA ir enkefalinui, kyla iš putameno neuronų ir veikia bazinių ganglijų branduolius per jungčių seką, įskaitant išorinį globus pallidus segmentą ir poodinį branduolį. Tiesioginio kelio laidumo sutrikimai sukelia hipokineziją, o netiesioginio kelio struktūrų laidumo sumažėjimas sukelia hiperkineziją su atitinkamais raumenų tonuso pokyčiais. GABAerginio laidumo kelių vientisumas skirtinguose motorinės kontrolės sistemos lygmenyse ir dopaminerginių jungčių integracija putameno lygmenyje yra būtini talamokortikalinės sąveikos reguliavimui. Dažniausias motorinės patologijos pasireiškimas įvairiose cerebrinio paralyžiaus formose yra raumenų tonuso pažeidimas ir glaudžiai susijęs refleksinio raumenų aktyvumo pokytis.

Embrioninio nervinio audinio transplantacijai sergant cerebriniu paralyžiumi reikia atlikti išsamią smegenų struktūrų pažeidimo pobūdžio analizę. Remdamiesi dopamino ir GABA kiekio nustatymu subarachnoidiniame smegenų skystyje, autoriai detalizavo funkcinių smegenų struktūrų integracijos sutrikimo lygį, kuris leido objektyvizuoti chirurginės intervencijos rezultatus ir koreguoti pakartotines neurotransplantacijas. Embrioninis nervinis audinys (9 savaičių embriono aborto medžiaga) buvo persodintas į smegenų pusrutulių priešcentrinių konvoliucijų žievės parenchimą, priklausomai nuo atrofinių pokyčių sunkumo. Pooperaciniu laikotarpiu komplikacijų ar pacientų būklės pablogėjimo nepastebėta. Teigiama dinamika pastebėta 63 % pacientų, sergančių spazminėmis formomis, 82 % vaikų, sergančių atonine-estetine forma, ir tik 24 % pacientų, sergančių mišria ligos forma. Nustatytas neigiamas aukšto neurosensibilizacijos lygio, esant autoantikūnams prieš neurospecifinius baltymus, poveikis operacijos rezultatams. Nustatyta, kad embriono nervinio audinio transplantacija yra neefektyvi 8–10 metų ir vyresniems pacientams, taip pat esant sunkiam hiperkinetiniam sindromui ir epilepsijai. Kliniškai embriono nervinio audinio transplantacijos veiksmingumas pacientams, sergantiems spazminėmis cerebrinio paralyžiaus formomis, pasireiškė naujų statomotorinių įgūdžių ir valingų judesių formavimusi, koreguojant patologinį motorinį stereotipą ir sumažinant spazmiškumo laipsnį, patologines pozas ir laikysenas. Autoriai mano, kad teigiamas embriono nervinio audinio transplantacijos poveikis yra normalizuojančio poveikio supraspinalinių struktūrų, dalyvaujančių laikysenos tonuso ir valingų judesių reguliavime, funkciniam aktyvumui rezultatas. Tuo pačiu metu teigiamą klinikinį embriono nervinio audinio transplantacijos poveikį lydi neurotransmiterių kiekio sumažėjimas subarachnoidiniame smegenų skystyje, o tai rodo, kad atkurta pažeistų smegenų struktūrų integrali sąveika.

Yra dar viena sunki neurologinės patologijos forma – apalinis sindromas, kurio gydymo problema, deja, toli gražu neišspręsta. Apalinis sindromas yra polietiologinė poūmė arba lėtinė būklė, atsirandanti dėl sunkių organinių centrinės nervų sistemos (daugiausia smegenų žievės) pažeidimų ir kuriai būdingas panapraksijos ir panagnosijos išsivystymas su santykinai išsaugota smegenų segmentinių-kamieninių skyrių ir limbinio-retikulinio komplekso darinių funkcija. Tolesni tyrimai (nuo 1 metų iki 3 metų) parodė, kad apalinis sindromas nėra galutinė vaikų nervų sistemos pažeidimo diagnozė, o transformuojasi arba į organinę demenciją, arba į lėtinę vegetacinę būseną. Ukrainos medicinos mokslų akademijos A. P. Romodanovo Neurochirurgijos instituto Atkuriamosios neurochirurgijos skyriuje 21 pacientui, sergančiam apalinio sindromo pasekmėmis, buvo atlikta embrioninio nervinio audinio transplantacija. Taikant bendrąją nejautrą, vainikiniu kerpiu buvo padaryta kerpio skylutė ryškiausių atrofinių pokyčių, nustatytų kompiuterinės tomografijos arba magnetinio rezonanso tomografijos tyrimu, srityje, o esant difuzinei pilkosios arba baltosios medžiagos atrofijai, transplantatas buvo įvestas į smegenų prekentalinę ir centrinę vingius. Atvėrus kietąjį smegenų dangalą, specialaus prietaiso pagalba į smegenų žievę buvo implantuoti 8–9 savaičių embrionų sensomotorinės žievės audinio gabalėliai. Implantuotų audinių mėginių skaičius svyravo nuo 4 iki 10, o tai priklausė nuo kerpio skylutės dydžio ir vietinių smegenų medžiagos pokyčių dydžio. Skirtingai nuo kitų tipų patologijų, apalinio sindromo atveju autoriai siekė implantuoti kuo daugiau embrioninio audinio į labiausiai prieinamas smegenų sritis. Kietasis smegenų dangalas buvo susiūtas ir atlikta kaukolės defekto plastinė operacija. Operacijos metu visiems pacientams pasireiškė reikšmingi tiek žievės (atrofija, susisukimų nebuvimas, smegenų medžiagos spalvos ir pulsacijos pasikeitimas), tiek smegenų dangalų (kietojo dangalo sustorėjimas, reikšmingas voratinklinę membraną sutirštinantis poveikis esant savoms kraujagyslėms, membranų susiliejimas su po ja esančia smegenų medžiaga) pokyčiai. Šie pokyčiai buvo ryškesni pacientams, kuriems anksčiau buvo uždegiminių smegenų pažeidimų. Pacientams, patyrusiems CNS hipoksiją, vyravo difuziniai atrofiniai smegenų medžiagos, ypač žievės, pokyčiai, padidėjus subarachnoidinei erdvei, be reikšmingų smegenų dangalų pokyčių. Pusei pacientų padidėjo minkštųjų audinių, kaulų ir smegenų medžiagos kraujavimas. Po operacijų, per šešis mėnesius–trejus metus, 16 pacientų būklė pagerėjo, o penkių pacientų nepakito. Teigiama dinamika pastebėta tiek motorinėje, tiek psichinėje srityse. Dešimčiai pacientų sumažėjo raumenų tonusas, 11 pacientų padidėjo motorinis aktyvumas (sumažėjo parezė,pagerėjo judesių koordinacija), penkiems vaikams reikšmingai padidėjo viršutinių galūnių manipuliavimo gebėjimai. Keturiems pacientams sumažėjo epilepsijos priepuolių dažnis ir sunkumas, o vienam vaikui per visą stebėjimo laikotarpį po operacijos priepuolių visai nebuvo. Dviem vaikams sumažėjo agresyvumas, dviem pacientams, sergantiems sunkiais bulbariniais sutrikimais, pagerėjo rijimo aktas, du vaikai jau po 2 savaičių po operacijos galėjo savarankiškai kramtyti. Pastebėtas psichikos sutrikimų sunkumo sumažėjimas, devyni vaikai po operacijos tapo ramesni, septyniems pacientams pagerėjo miegas ir dėmesys. Trys pacientai, kuriems pasireiškė apalinio sindromo pasekmės, pradėjo atpažinti savo tėvus, vienas – vykdyti nurodymus, du – tarti žodžius, trims sumažėjo dizartrijos laipsnis. Autoriai pažymi, kad pastebimas pacientų būklės pagerėjimas prasideda praėjus 2 mėnesiams po operacijos, pasiekia maksimumą per 5–6 mėnesius, tada pagerėjimo tempas sulėtėja ir iki metų pabaigos procesas stabilizuojasi 50 % pacientų. Teigiamas neurotransplantacijos poveikis buvo pagrindas pakartotinei operacijai šešiems pacientams, sergantiems apalinio sindromo pasekmėmis, tačiau kitame smegenų pusrutulyje. Antrosios transplantacijos technika ir metodai buvo identiški pirmosios operacijos metu, tačiau antrosios operacijos klinikinis poveikis buvo mažesnis, nors nei po pirmosios, nei po antrosios chirurginės intervencijos rimtų komplikacijų nekilo. Pasak autorių, neurotransplantacijos terapinio poveikio mechanizmas yra susijęs su persodinto embriono nervinio audinio neurotrofiniu poveikiu, kuriame yra daug augimo, hormonų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų, skatinančių pažeistų neuronų atstatymą ir recipiento smegenų audinio plastinę reorganizaciją. Taip pat galimas aktyvuojantis poveikis anksčiau morfologiškai išsaugotų, bet dėl ligos funkcinį aktyvumą praradusių nervinių ląstelių aktyvumui. Būtent greitas neurotrofinis poveikis gali paaiškinti kai kurių vaikų bulbarinių funkcijų pagerėjimą jau pirmosios ar antrosios savaitės pabaigoje po operacijos. Daroma prielaida, kad be to, iki trečio ar ketvirto mėnesio tarp transplantato ir šeimininko smegenų užmezgami morfofunkciniai ryšiai, per kuriuos neurotransplantatas pakeičia negyvų smegenų ląstelių funkcijas, o tai yra substratas, gerinantis tiek pacientų motorines, tiek psichines funkcijas. Du vaikai jau po 2 savaičių po operacijos galėjo savarankiškai kramtyti. Pastebėtas psichikos sutrikimų sunkumo sumažėjimas, devyni vaikai po operacijos tapo ramesni, septynių pacientų miegas ir dėmesys pagerėjo. Trys pacientai, turintys apalinio sindromo pasekmių, pradėjo atpažinti savo tėvus, vienas – vykdyti nurodymus, du – tarti žodžius.trims pacientams dizartrijos laipsnis sumažėjo. Autoriai pažymi, kad pastebimas pacientų būklės pagerėjimas prasideda praėjus 2 mėnesiams po operacijos, pasiekia maksimumą per 5–6 mėnesius, vėliau pagerėjimo tempas sulėtėja ir iki metų pabaigos 50 % pacientų procesas stabilizuojasi. Teigiamas neurotransplantacijos poveikis buvo pagrindas pakartotinei operacijai šešiems pacientams, kuriems pasireiškė apalinio sindromo pasekmės, tačiau kitame smegenų pusrutulyje. Antrosios transplantacijos technika ir metodas buvo identiški pirmosios operacijos metu, tačiau antrosios operacijos klinikinis poveikis buvo mažesnis, nors nei po pirmosios, nei po antrosios chirurginės intervencijos rimtų komplikacijų nebuvo. Pasak autorių, neurotransplantacijos terapinio poveikio mechanizmas yra susijęs su persodinto embriono nervinio audinio neurotrofiniu poveikiu, kuriame yra daug augimo, hormonų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų, kurios stimuliuoja pažeistų neuronų atstatymą ir recipiento smegenų audinio plastinę reorganizaciją. Taip pat galimas aktyvuojantis poveikis anksčiau morfologiškai išsaugotų, bet dėl ligos funkcinį aktyvumą praradusių nervinių ląstelių aktyvumui. Būtent greitas neurotrofinis poveikis gali paaiškinti kai kurių vaikų bulbarinių funkcijų pagerėjimą jau pirmosios ar antrosios savaitės pabaigoje po operacijos. Manoma, kad kartu su tuo, iki trečiojo ar ketvirtojo mėnesio, tarp transplantato ir šeimininko smegenų užsimezga morfofunkciniai ryšiai, per kuriuos neurotransplantatas pakeičia negyvų smegenų ląstelių funkcijas, kurios yra substratas pacientų motorinėms ir psichinėms funkcijoms gerinti. Du vaikai jau po 2 savaičių po operacijos galėjo savarankiškai kramtyti. Pastebėtas psichikos sutrikimų sunkumo sumažėjimas, devyni vaikai po operacijos tapo ramesni, septynių pacientų miegas ir dėmesys pagerėjo. Trys pacientai, kuriems pasireiškė apalinio sindromo pasekmės, pradėjo atpažinti savo tėvus, vienas – vykdyti nurodymus, du – tarti žodžius, trims sumažėjo dizartrijos laipsnis. Autoriai pažymi, kad pastebimas pacientų būklės pagerėjimas prasideda praėjus 2 mėnesiams po operacijos, pasiekia maksimumą per 5–6 mėnesius, tada pagerėjimo tempas sulėtėja ir iki metų pabaigos procesas stabilizuojasi 50 % pacientų. Teigiamas neurotransplantacijos poveikis buvo pagrindas pakartotinei operacijai šešiems pacientams, kuriems pasireiškė apalinio sindromo pasekmės, tačiau kitame smegenų pusrutulyje. Antrosios transplantacijos technika ir metodas buvo identiški pirmosios operacijos metu, tačiau antrosios operacijos klinikinis poveikis buvo mažesnis, nors nei po pirmosios, nei po antrosios chirurginės intervencijos rimtų komplikacijų nebuvo. Pasak autorių,Neurotransplantacijos terapinio poveikio mechanizmas siejamas su persodinto embriono nervinio audinio neurotrofiniu poveikiu, kuriame yra daug augimo, hormonų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų, kurios stimuliuoja pažeistų neuronų atstatymą ir recipiento smegenų audinio plastinę reorganizaciją. Taip pat galimas aktyvuojantis poveikis anksčiau morfologiškai išsaugotų, bet dėl ligos funkcinį aktyvumą praradusių nervinių ląstelių aktyvumui. Būtent greitas neurotrofinis poveikis gali paaiškinti kai kurių vaikų bulbarinių funkcijų pagerėjimą jau pirmąją ar antrąją savaitę po operacijos. Manoma, kad kartu su tuo, iki trečiojo ar ketvirtojo mėnesio, tarp transplantato ir šeimininko smegenų užsimezga morfofunkciniai ryšiai, per kuriuos neurotransplantatas pakeičia negyvų smegenų ląstelių funkcijas, kurios yra substratas pacientų motorinėms ir psichinėms funkcijoms gerinti, nors nei po pirmosios, nei po antrosios chirurginės intervencijos rimtų komplikacijų nekilo. Pasak autorių, neurotransplantacijos terapinio poveikio mechanizmas susijęs su persodinto embriono nervinio audinio neurotrofiniu poveikiu, kuriame yra daug augimo, hormonų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų, kurios stimuliuoja pažeistų neuronų atstatymą ir recipiento smegenų audinio plastinę reorganizaciją. Taip pat galimas aktyvuojantis poveikis anksčiau morfologiškai išsaugotų, bet dėl ligos funkcinį aktyvumą praradusių nervinių ląstelių aktyvumui. Būtent greitas neurotrofinis poveikis gali paaiškinti kai kurių vaikų bulbarinių funkcijų pagerėjimą jau pirmosios ar antrosios savaitės pabaigoje po operacijos. Manoma, kad kartu su tuo, iki trečiojo ar ketvirtojo mėnesio, tarp transplantato ir šeimininko smegenų užsimezga morfofunkciniai ryšiai, per kuriuos neurotransplantatas pakeičia negyvų smegenų ląstelių funkcijas, kurios yra substratas pacientų motorinėms ir psichinėms funkcijoms gerinti, nors nei po pirmosios, nei po antrosios chirurginės intervencijos rimtų komplikacijų nekilo. Autorių teigimu, neurotransplantacijos terapinio poveikio mechanizmas susijęs su persodinto embriono nervinio audinio neurotrofiniu poveikiu, kuriame yra daug augimo, hormonų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų, skatinančių pažeistų neuronų atstatymą ir recipiento smegenų audinio plastinę reorganizaciją. Taip pat galimas aktyvuojantis poveikis anksčiau morfologiškai išsaugotų, bet dėl ligos funkcinį aktyvumą praradusių nervinių ląstelių aktyvumui.Būtent greitas neurotrofinis poveikis gali paaiškinti kai kurių vaikų bulbarinių funkcijų pagerėjimą jau pirmosios ar antrosios savaitės pabaigoje po operacijos. Manoma, kad kartu su tuo, iki trečiojo ar ketvirtojo mėnesio, tarp transplantato ir šeimininko smegenų užsimezga morfofunkciniai ryšiai, per kuriuos neurotransplantatas pakeičia negyvų smegenų ląstelių funkcijas, o tai yra substratas pacientų motorinėms ir psichinėms funkcijoms gerinti.

Eksperimentiškai tirtas embrioninio nervinio audinio transplantacijos poveikis tarpneuroninių jungčių reorganizacijai. Autoriai, naudodami fluorescencinį lipofilinį žymeklį DIL (1,1-dioktadecil-3,3,33'-tetrametilindokarbocianino perchloratą) ir konfokalinį lazerinį skenavimą, tyrė tarpmodulinių aksonų jungčių atsistatymo modelius mechaninio smegenų žievės pažeidimo srityje baltosioms žiurkėms, kurioms buvo atlikta ir neatlikta embrioninio nervinio audinio transplantacija. Nustatyta, kad embrioninio nervinio audinio įvedimas į pažeidimo vietą užtikrina aksonų augimą, kurie, perėję pro transplantatą, jungiasi su greta esančiu smegenų audiniu, o nepersodinus embrioninio nervinio audinio, pažeista vieta yra neįveikiama kliūtis augantiems aksonams. Šiame darbe atlikta embrioninės (15–17 nėštumo dienos) neokortekso transplantacija. Autorių gauti rezultatai yra dar vienas įrodymas, kad embrioninio nervinio audinio transplantacija aktyviai veikia potrauminį kaimyninių smegenų žievės struktūrinių ir funkcinių modulių tarpneuroninių ryšių reorganizavimą. Embrioninio nervinio audinio transplantacija iš dalies atkuria ryšius tarp pažeistų smegenų žievės sričių, sudarydama palankias sąlygas aksonų augimui transplantato neurotrofinių faktorių veikimo zonoje. Toks poveikis įrodytas eksperimentiškai ir literatūroje aptariamas kaip lytiškai subrendusių gyvūnų pažeistų smegenų didelių plastinių galimybių įrodymas. Šiuo atžvilgiu ląstelių transplantacija šiuo metu laikoma optimalia terapine strategija pažeistos žmogaus CNS funkcijai atkurti.

Autorių gauti duomenys apie embrioninio smegenų nervinio audinio, kaip egzogeninės transplantacijos terpės aksonų augimui, naudojimo efektyvumą patvirtina tikslingo komunikacinių ryšių tarp nepažeistų gretimų smegenų sričių kūrimo perspektyvas. Darbas, tiriantis nervinio audinio transplantacijos poveikį centrinės nervų sistemos funkcinių parametrų dinamikai, atrodo aktualus. Darbo užduotis buvo ištirti embrioninio lokuso coeruleus (LC) transplantacijos poveikį LC neuronų morfofunkciniams rodikliams ir recipientų lokomotoriniam aktyvumui. Recipientai buvo Wistar žiurkių patelės, o donorai – 18 dienų amžiaus tos pačios linijos žiurkių embrionai. Embrioninio LC transplantacija atlikta į trečiojo smegenų skilvelio ertmę. Histologiškai transplantato prigijimas nustatytas 75 % recipientų gyvūnų. Prigijimo atvejais transplantatas buvo greta skilvelio sienelės, užpildęs 1/5–2/5 jo spindžio, ir buvo gyvybingas. Praėjus 1 ir 6 mėnesiams po operacijos, persodintas nervinis audinys pagal savo morfologines savybes atspindėjo struktūras, kurios būtų atsiradusios normalios ontogenetinės raidos metu, t. y. LC struktūras. Autorių gauti duomenys rodo, kad gyvūnams, kuriems buvo persodintas embrioninis LC anlage, keičiasi dinaminis aktyvumas ir padidėja LC ląstelių branduolių chromatino matricos aktyvumas. Dėl to sustiprėja jų pačių LC neuronų aktyvumas, tačiau įskiepytas transplantatas taip pat yra funkciškai aktyvus. Yra žinoma, kad vadinamasis vidurinių smegenų lokomotorinis regionas praktiškai sutampa su LC lokalizacija. Autoriai mano, kad recipientų žiurkių motorinio aktyvumo pokyčio pagrindas yra tiek jų pačių, tiek transplantuotų LC ląstelių aktyvacija, išsiskiriant dideliam kiekiui norepinefrino, įskaitant ir nugaros smegenų segmentus. Taigi daroma prielaida, kad motorinio aktyvumo padidėjimas LC transplantacijos į nepažeistas gyvūnų smegenis sąlygomis atsiranda dėl funkciškai aktyvaus transplantato, integruoto su recipiento smegenimis ir prisidedančio prie žiurkių lokomotorinio aktyvumo aktyvavimo.

Be to, buvo įrodyta, kad persodintos neokortekso ir nugaros smegenų embrioninių užuomazgų neuroepitelinės ląstelės išgyvena ir diferencijuojasi į neuroblastus, jaunus ir subrendusius neuronus per 1-2 mėnesius po jų transplantacijos į pažeistą subrendusių žiurkių sėdimojo nervo nervą. Tiriant žiurkių neokortekso ir nugaros smegenų embrioninių užuomazgų NADPH teigiamų neuronų vystymosi dinamiką heterotopiniuose alograftuose (15 dienų žiurkių embrionuose), išilginiuose recipientų žiurkių sėdimojo nervo pjūviuose nustatytas 70–80 % neurotransplantatų įsitvirtinimas, kuris priklausė nuo stebėjimo laikotarpio. Praėjus savaitei po operacijos, transplantatuose pradėjo formuotis vien- ir dvipoliai neuroblastai su apvaliais šviesiais branduoliais ir vienu ar dviem branduolėliais, kuriuos lydėjo klasterių susidarymas. Autoriams nepavyko tarp neuroblastų aptikti ląstelių, kuriose yra NADPH diaforazės (NADPH-d). Po 7 dienų tik ląsteliniai kraujagyslių elementai buvo NADPH teigiami – kapiliarų endotelio ląstelės transplantato storyje, taip pat recipiento sėdimojo nervo kraujagyslių endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelės. Kadangi kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse NO sintazės (NOS) indukcija vyksta veikiant IL-1, autoriai NADPH teigiamų lygiųjų raumenų ląstelių atsiradimą sėdimojo nervo kraujagyslėse sieja su IL-1, sintezuoto pažeistuose nervų kamienuose, buvimu. Yra žinoma, kad neurogenezė embrioninių smegenų užuomazgų transplantacijos sąlygomis vyksta sinchroniškai su neuronų vystymusi in situ. Morfologinių tyrimų rezultatai rodo, kad kai kurių transplantatų nervinių elementų diferenciacija praėjus septynioms dienoms po transplantacijos atitinka ląstelių diferenciaciją panašiose naujagimių žiurkių smegenų dalyse. Taigi, heterotopinės transplantacijos į periferinį nervą sąlygomis persodintos embrioninės nervų ląstelės pasižymi gebėjimu sintetinti NADPH-d. Šiuo atveju nugaros smegenų transplantatuose randama daugiau neuronų, turinčių NADPH-d, nei neokortekso transplantatuose, tačiau azoto oksido sintezė persodintuose neuronuose prasideda vėliau nei vystymosi in situ metu. Stuburinių gyvūnų CNS NOS teigiamos ląstelės atsiranda jau prenataliniu laikotarpiu. Manoma, kad NO skatina sinapsinių jungčių formavimąsi besivystančiose smegenyse, o NOS teigiamų nervų aferentinių skaidulų, kurios užtikrina NO sintezę smegenėlių neuroblastuose, buvimas stimuliuoja neuronų migraciją ir diferenciaciją, dėl kurios susidaro normali smegenų citoarchitektūra. Svarbus NO vaidmuo sinapsogenezėje nustatytas tektume – tik tie neuronai, kurie turėjo sinapsinius ryšius su tinklainės ląstelėmis, pasirodė esą NOS teigiami.

Yra žinoma, kad azoto oksidas yra vienas iš smegenų veiklos reguliatorių, kur jis susidaro iš arginino, veikiant NO sintazei, kuri pasižymi diaforazės aktyvumu. Centrinėje nervų sistemoje NO sintetinamas kraujagyslių endotelio ląstelėse, mikroglijoje, astrocituose ir įvairių smegenų dalių neuronuose. Po trauminio smegenų sužalojimo, taip pat hipoksijos ir išemijos metu stebimas neuronų, kuriuose yra NO, kuris yra vienas iš smegenų kraujotakos reguliatorių, skaičiaus padidėjimas. Atsižvelgiant į NO gebėjimą sukelti sinapsogenezę, ypač įdomu tirti NO turinčių ląstelių susidarymą neurotransplantacijos sąlygomis, esant recipiento nervinio audinio trauminiam pažeidimui.

Ne mažiau svarbus yra neurotransplantacijos poveikio sąlyginio reflekso elgesio stereotipui tyrimas. Eksperimentuose, skirtuose tiriant intracerebrinės ir tolimosios (tarp CII ir CIII) embriono lokuso coeruleus audinio transplantacijos (17–19 nėštumo dienų) poveikį atminties procesams ir katecholaminų kiekiui žiurkėms, sunaikinus frontotemporalinę neokorteksą, buvo įrodyta, kad elektrolitinis smegenų frontotemporalinės žievės pažeidimas sutrikdo sąlyginio reflekso emocinės vengimo reakcijos (atminties) stereotipą, silpnina fiziologinį aktyvumą, sumažina norepinefrino kiekį krešėjusios neokortekso zonoje, tačiau padidina jo lygį pagumburyje, kur stebimas adrenalino koncentracijos sumažėjimas, nors jo kiekis kraujyje ir antinksčiuose padidėja.

Dėl embrioninio lokuso coeruleus audinio intracerebrinės transplantacijos 81,4% gyvūnų atkuriamas sąlyginio reflekso emocinio vengimo reakcijos stereotipas, sutrikdytas dėl elektrolitinio smegenų žievės frontotemporalinių sričių pažeidimo, normalizuojamas adrenalino kiekis vidurinių smegenų, pagumburio ir neokortekso tinklinėje formacijoje, o jo lygis hipokampe netgi padidėja, o tai derinama su adrenalino koncentracijos kraujyje sumažėjimu.

Nuotolinė embrioninio lokuso coeruleus audinio transplantacija ne tik atkuria sutrikusį sąlyginio reflekso emocinio vengimo reakcijos stereotipą žiurkėms, kurioms pažeista frontotemporalinė žievė, bet ir padidina norepinefrino ir adrenalino kiekį, daugiausia pagumburyje, kraujyje, antinksčiuose ir širdyje. Manoma, kad tai lemia transplantato vaskuliarizacija, neurotransmiterių prasiskverbimas į kraują, jų patekimas per hematoencefalinį barjerą ir adrenalino bei norepinefrino reabsorbcijos mechanizmų aktyvacija pagal 1, 2, 3 įsisavinimo tipus. Autoriai mano, kad ilgalaikis norepinefrino lygio stabilizavimas transplantato prigijimo ir funkcionavimo sąlygomis gali būti laikomas jo laipsniško išsiskyrimo minimaliomis dozėmis lokuso coeruleus neuronų reiškiniu.

Teigiamas klinikinis embrioninių nervinių audinių transplantacijos poveikis taip pat gali būti susijęs su pastarųjų gebėjimu paveikti kraujagyslių neoplazmos procesus, kurių reguliavime tiesiogiai dalyvauja augimo faktoriai ir citokinai. Vaskulogenezę aktyvina angiogeniniai augimo faktoriai – kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF), FGF, PDGF ir TGF, kurie sintetinami išemijos metu ir veikia kaip angiogenezės inicijavimo momentas. Įrodyta, kad kraujagyslių augimo potencialo išeikvojimas vyksta organizmo senėjimo proceso metu, o tai vaidina svarbų vaidmenį tokių ligų kaip koronarinė širdies liga ir apatinių galūnių obliteruojanti aterosklerozė patogenezėje. Audinių išemija išsivysto ir sergant daugeliu kitų ligų. Angiogeninių faktorių įvedimas į išemines zonas (terapinė angiogenezė) stimuliuoja kraujagyslių augimą išeminiuose audiniuose ir pagerina mikrocirkuliaciją dėl kolateralinės kraujotakos vystymosi, o tai savo ruožtu padidina pažeisto organo funkcinį aktyvumą.

Klinikiniam naudojimui perspektyviausiais laikomi VEGF ir FGF. Pirmųjų atsitiktinių imčių tyrimų rezultatai buvo daug žadantys, ypač jei buvo teisingai parinktos optimalios angiogeninių faktorių dozės ir vartojimo metodai. Šiuo atžvilgiu buvo atliktas eksperimentinis žmogaus embriono smegenų audinio ekstrakto angiogeninio aktyvumo įvertinimas. Darbe buvo naudojama dvidešimtąją nėštumo savaitę gauta abortuota medžiaga, apdorota pagal I. Maciog ir kt. (1979) metodą, modifikuotą IC ANRF. Šis vaistas yra „Endotelio ląstelių augimo papildas“ („Sigma“) analogas ir yra natūralus žmogaus angiogeninių faktorių, įskaitant VEGF ir FGF, mišinys. Eksperimentai buvo atlikti su žiurkėmis, naudojant užpakalinių galūnių ir miokardo audinių išemijos modelius. Remiantis šarminės fosfatazės aktyvumo tyrimu eksperimentiniuose gyvūnuose, kuriems buvo duotas embriono nervinio audinio ekstraktas, nustatytas kapiliarų skaičiaus padidėjimas miokardo ploto vienete – tiek išilginiame, tiek skersiniame širdies pjūvyje. Preparato angiogeninis aktyvumas pasireiškė tiesiogiai įvedant į išeminę zoną, taip pat sisteminio (į raumenis) vartojimo atveju, dėl ko sumažėjo vidutinis poinfarktinio rando plotas.

Bet kuriame embriono nervinio audinio transplantacijos variante itin svarbu teisingai parinkti persodinamos embrioninės medžiagos gestacinį amžių. Lyginamoji ląstelių preparatų iš 8, 14 ir 16–17 dienų žiurkių embrionų ventralinio tarpsmegeninio smegenų efektyvumo analizė praėjus trims mėnesiams po intrastriatalinės neurotransplantacijos subrendusioms žiurkėms, sergančioms parkinsonizmu, automatizuotame apomorfino sukeltos motorinės asimetrijos teste parodė žymiai didesnį CNS ląstelių preparatų efektyvumą iš 8 dienų embrionų ir mažiausią efektyvumą iš 16–17 dienų embriono nervinio audinio. Gauti duomenys koreliavo su histomorfologinės analizės rezultatais, ypač su transplantatų dydžiu, glijos reakcijos sunkumu ir dopaminerginių neuronų skaičiumi juose.

Embrioninių nervinių audinių ląstelių terapinio poveikio skirtumai gali būti susiję tiek su pačių ląstelių nebrandumo laipsniu ir įsipareigojimu, tiek su skirtinga jų reakcija į augimo faktorius, išskiriamus dopaminerginių neuronų pažeidimo srityje. Visų pirma, EGF ir FGF2 poveikis telencefalinių nervinių kamieninių ląstelių vystymuisi in vivo pasireiškia skirtingais embriogenezės etapais. 8,5 dienos amžiaus pelių embrionų neuroepitelinės ląstelės, kultivuojamos in vitro terpėje be serumo, proliferuoja esant FGF2, bet ne EGF, į kurį reaguoja tik vėlesniuose vystymosi etapuose iš embrionų smegenų išskirtos kamieninių ląstelių populiacijos. Tuo pačiu metu nervinės kamieninės ląstelės proliferuoja reaguodamos į kiekvieną iš šių mitogenų ir papildomai skatina augimą, jei į kultūrą, kurioje ląstelių sėjimo tankis mažas, pridedama EGF ir FGF2. EGF reaguojančios nervinės kamieninės ląstelės iš 14,5 dienos amžiaus pelių embrionų germinalinių zonų laikomos linijiniais FGF reaguojančių nervinių kamieninių ląstelių palikuonimis, kurios pirmą kartą atsiranda po 8,5 nėštumo dienos. Potencialus nervinių kamieninių ir progenitorinių ląstelių fenotipas priklauso nuo sudėtingo jų mikroaplinkos poveikio. Imunofenotipų nustatymas 8-12 ir 17-20 savaičių amžiaus žmogaus embrionų periventrikulinėse ir hipokampinėse zonose srautinės citofluorometrijos metodu atskleidė reikšmingą kintamumą, susijusį tiek su gestaciniu amžiumi, tiek su individualiomis donoro biomedžiagos konstitucinėmis ypatybėmis. Kai šios nervinės progenitorinės ląstelės kultivuojamos selektyvioje terpėje be serumo su EGF, FGF2 ir NGF, neurosferos formuojasi tokiu greičiu, kuris labai priklauso nuo gestacinio amžiaus. Ląstelės iš skirtingų 5-13 savaičių amžiaus žmogaus embrionų smegenų dalių, trumpai kultivuojamos su FGF2 monosluoksninėje kultūroje ant laminino substrato, esant augimo faktorių pėdsakams, 6 savaites išlaiko proliferaciją, turėdamos didelį nestin-teigiamų ląstelių procentą, savaiminio ląstelių, turinčių visų trijų nervinės diferenciacijos linijų žymenis, formavimosi fone. Ląstelės, išskirtos iš žmogaus embriono tarpsmegenėlių, kai nėštumo laikotarpis viršija 13 savaičių, proliferuoja veikiamos EGF ir taip pat sudaro neurosferas. Naudojant EGF ir FGF2 derinį, pasiektas sinergetinis efektas. Intensyviausia nervinių kamieninių ląstelių proliferacija su neurosferų formavimusi stebima kultivuojant 6-8 savaičių amžiaus žmogaus embrionų smegenų žievės audinį, esant EGF2, IGF1 ir 5 % arklio serumo ant substrato su fibronektinu.

Reikėtų pažymėti, kad klausimai dėl gestacinio amžiaus ir embrioninės CNS pjūvio, kurio audinį geriau naudoti neurotransplantacijai, lieka atviri. Atsakymų į juos reikėtų ieškoti besivystančių smegenų neurogenezėje, kuri tęsiasi visą prenatalinį laikotarpį – tuo metu, kai nervinio vamzdelio epitelis sudaro daugiasluoksnę struktūrą. Manoma, kad kamieninių ląstelių ir naujų neuronų šaltinis yra radialinė glija, susidedanti iš pailgų ląstelių su ilgomis ataugomis, radialiai nukreiptomis smegenų pūslelių sienelės atžvilgiu ir besiliečiančiomis su skilvelių vidiniu paviršiumi bei išoriniu smegenų sienelės prieangio paviršiumi. Anksčiau radialinė glija atliko tik neuroninio trakto, kuriuo neuroblastai migruoja iš ventralinės srities į paviršines dalis, funkciją, be to, jai buvo priskirtas skeleto vaidmuo formuojant teisingą žievės sluoksniuotą organizaciją. Šiandien nustatyta, kad vystymuisi radialinė glija transdiferencijuojasi į astrocitus. Didelė jo dalis žinduoliams sumažėja iškart po gimimo, tačiau toms gyvūnų rūšims, kuriose radialinė glija išsaugoma iki pilnametystės, neurogenezė aktyviai vyksta pogimdyminiu laikotarpiu.

Kultūroje graužikų embriono neokortekso radialinės glijos ląstelės suformavo neuronus ir glijos ląsteles, neuronams daugiausia formuojantis 14–16 gestacinio embriono vystymosi dieną (maksimalaus neurogenezės intensyvumo laikotarpis pelių ir žiurkių smegenų žievėje). 18-ąją embriogenezės dieną diferenciacija pasislinko astrocitų formavimosi link, žymiai sumažėjus naujai susiformavusių neuronų skaičiui. Radialinių glijos ląstelių žymėjimas in situ GFP leido aptikti asimetrinį žymėtų ląstelių dalijimąsi 15–16 dienų amžiaus žiurkių embrionų smegenų pūslelių ertmėje, atsiradus dukterinėms ląstelėms, turinčioms neuroblastų imunologines ir elektrofiziologines savybes. Pažymėtina, kad, remiantis dinaminių stebėjimų rezultatais, besiformuojantys neuroblastai migracijai į prieangio paviršių naudoja radialinių glijos ląstelių motininę ląstelę.

Endogeninis radialinės glijos žymuo yra tarpinis filamentinis baltymas nestinas. Naudojant ląstelių, pažymėtų su GFP susijusiu retrovirusu ir ekspresuojamų kontroliuojant nestinui, fluorescencinio srauto rūšiavimo metodą, buvo parodyta, kad žmogaus hipokampo dantytojo ir hiluso kamieninės ląstelės (medžiaga gauta epilepsijos operacijų metu) ekspresuoja nestiną. Todėl jos priklauso radialinei glijai, kuri žmonių, kaip ir kitų žinduolių, organizme išsilaiko tik dantytoje vingyje.

Tuo pačiu metu ląstelių transplantacijos efektyvumą lemia ne tik didelis donorinių ląstelių gyvybingumas, jų diferenciacijos potencialas ir gebėjimas pakeisti defektines ląsteles, bet, visų pirma, jų nukreipta migracija. Visapusiška persodintų ląstelių funkcinė integracija priklauso nuo jų migracijos gebėjimo – nepažeidžiant recipiento smegenų citoarchitektūros. Kadangi radialinė glija pogimdyminiu laikotarpiu beveik visiškai redukuojasi, reikėjo išsiaiškinti, kaip donorinės ląstelės gali judėti iš transplantacijos zonos į smegenų pažeidimo vietą suaugusiems recipientams. Yra du ląstelių migracijos į CNS variantai, kurie nepriklauso nuo radialinės glijos: tangentinės migracijos reiškinys arba neuroblastų judėjimas smegenų žievės vystymosi metu statmenai radialinės glijos tinklui, taip pat migracija „iš eilės“ arba „grandine“. Visų pirma, nervinių progenitorinių ląstelių migracija iš rostralinės subventrikulinės zonos į uoslės svogūnėlį vyksta kaip glaudžiai gretimų ląstelių seka, apsupta glijos ląstelių. Manoma, kad šios ląstelės naudoja partnerines ląsteles kaip migracijos substratą, o pagrindinis tokių tarpląstelinių sąveikų reguliatorius yra PSA-NCAM (polisialilinta nervinių ląstelių adhezijos molekulė). Todėl neuronų migracijai nebūtinai reikalingas radialinės glijos ar jau esamų aksonų jungčių dalyvavimas. Ekstraradialinė ląstelių judėjimo forma „styga“ išilgai rostrinio migracijos trakto išlieka visą gyvenimą, o tai rodo realią galimybę persodintas nervines pirmtakines ląsteles tiksliai pristatyti į subrendusią nervų sistemą.

Yra hipotezė apie kamieninių ląstelių linijos buvimą smegenų ontogenezėje, pagal kurią ankstyvosiose smegenų vystymosi stadijose kamieninė ląstelė yra neuroepitelinė ląstelė, kuri, bręsdama, transdiferencijuojasi į radialinę gliją. Suaugusiame amžiuje kamieninių ląstelių vaidmenį atlieka ląstelės, turinčios astrocitų savybių. Nepaisant daugybės prieštaringų punktų (prieštaravimų dėl hipokampo kamieninių ląstelių, taip pat dėl giliųjų smegenų dalių, kurios neturi sluoksniuotos žievės ir išsivysto iš talamo gumbų, kur nėra radialinės glijos), aiški ir paprasta nuoseklaus kamieninių ląstelių fenotipo kitimo ontogenezės metu koncepcija atrodo labai patraukliai.

Mikroaplinkos veiksnių įtaka nervinių diferencijuotų ląstelių nustatymui ir vėlesnei diferenciacijai buvo aiškiai parodyta persodinus subrendusias žiurkės nugaros smegenų kamienines ląsteles į skirtingus brandžios nervų sistemos regionus. Kai kamieninės ląstelės buvo persodintos į dantytąjį vingį arba į neuronų migracijos sritį uoslės svogūnėliuose, buvo pastebėta aktyvi persodintų ląstelių migracija, susidarant daugybei neuronų. Kamieninių ląstelių transplantacija į nugaros smegenis ir Amono rago sritį lėmė astrocitų ir oligodendrocitų susidarymą, o transplantacija į dantytąjį vingį lėmė ne tik glijos ląstelių, bet ir neuronų susidarymą.

Subrendusios žiurkės dantytoje vingyje besidalijančių ląstelių skaičius gali siekti kelis tūkstančius per dieną – mažiau nei 1% viso granuliuotųjų ląstelių skaičiaus. Neuronai sudaro 50–90% ląstelių, astocitai ir kiti glijos elementai – apie 15%. Likusios ląstelės neturi neuronų ir glijos antigeninių savybių, tačiau turi endotelio ląstelių antigenų, o tai rodo glaudų ryšį tarp neurogenezės ir angiogenezės dantytoje vingyje. Endotelio ląstelių diferenciacijos į neuronų pirmtakines ląsteles galimybės šalininkai nurodo endotelio ląstelių gebėjimą in vitro sintetinti BDNF.

Neuroninių grandinių savaiminio surinkimosi greitis yra įspūdingas: diferenciacijos metu granuliuotų ląstelių pirmtakinės ląstelės migruoja į dantytąjį vingį ir formuoja ataugas, augančias link Amono rago SAZ zonos ir sudarančias sinapses su piramidiniais glutamaterginiais ir tarpląsteliniais slopinančiais neuronais. Naujai sukurtos granuliuotos ląstelės per 2 savaites integruojasi į esamas neuronines grandines, o pirmosios sinapsės atsiranda jau po 4–6 dienų nuo naujų ląstelių atsiradimo. Dažnai skiriant BrdU arba 3H-timidiną (vieną iš suaugusių kamieninių ląstelių identifikavimo metodų) subrendusiems gyvūnams, Amono rage buvo rasta daug žymėtų neuronų ir astrocitų, o tai rodo galimybę formuotis naujiems neuronams ne tik dantytoje vingyje, bet ir kitose hipokampo dalyse. Susidomėjimas dalijimosi, diferenciacijos ir ląstelių mirties procesais subrendusių smegenų hipokampo dantytoje vingyje taip pat susijęs su tuo, kad čia susidarantys neuronai yra lokalizuoti vienoje iš pagrindinių hipokampo sričių, atsakingų už mokymosi ir atminties procesus.

Taigi, šiandien nustatyta, kad nervinės pirmtakinės ląstelės kyla iš subrendusių graužikų šoninio skilvelio požeminės zonos ląstelių. Jos migruoja išilgai orientuotų astroglijos ląstelių suformuotu rostraliu migracijos taku iki uoslės svogūnėlio, kur įsitvirtina granuliuotųjų ląstelių sluoksnyje ir diferencijuojasi į šios struktūros neuronus. Suaugusių beždžionių rostraliu migracijos taku aptikta nervinių pirmtakinių ląstelių migracija, rodanti naujų neuronų susidarymo primatų uoslės svogūnėlyje galimybę. Iš suaugusio žmogaus uoslės svogūnėlio išskirtos nervinės kamieninės ląstelės ir perkeltos į linijas, kurių klonuotos ląstelės diferencijuojasi į neuronus, astrocitus ir oligodendrocitus. Kamieninės ląstelės rastos žiurkių, pelių, beždžionių ir žmonių subrendusių smegenų hipokampe. Dantytojo fascijos požeminės zonos nervinės kamieninės ląstelės yra pirmtakinių ląstelių migracijos į medialinę ir šoninę hipokampo dalis, kur jos diferencijuojasi į subrendusias granuliuotas ląsteles ir glijos elementus, šaltinis. De novo susiformavusių dantytoji fascijaus neuronų aksonai siejami su CA3 lauku, o tai rodo naujai susiformavusių neuronų dalyvavimą įgyvendinant hipokampo funkcijas. Suaugusių beždžionių neokortekso asociacijos srityse buvo rastos neuronų pirmtakinės ląstelės, migruojančios iš subventrikulinės zonos. Pelės smegenų neokortekso VI sluoksnyje nauji piramidiniai neuronai aptinkami praėjus 2–28 savaitėms po sukeltos šio sluoksnio natūralių neuronų žalos ir žūties dėl anksčiau ramybės būsenoje esančių subventrikulinės zonos pirmtakinių ląstelių migracijos. Galiausiai, postnatalinės neurogenezės realybę žmogaus smegenyse įrodo dvigubai padidėjęs žievės neuronų skaičius, kuris tęsiasi pirmuosius 6 metus po gimimo.

Ne mažiau svarbus praktinei ląstelių transplantacijai yra nervinių kamieninių ir progenitorinių ląstelių reprodukcijos ir diferenciacijos procesų reguliavimo klausimas. Svarbiausi veiksniai, slopinantys nervinių progenitorinių ląstelių proliferaciją, yra gliukokortikoidai, kurie smarkiai sumažina dalijimųsi skaičių, o antinksčių pašalinimas, priešingai, žymiai padidina mitozių skaičių (Gould, 1996). Pažymėtina, kad graužikų dantytojo vingio morfogenezė yra intensyviausia per pirmąsias dvi postnatalinio vystymosi savaites, kai nėra reakcijos į stresą, kai smarkiai sumažėja antinksčių žievės steroidinių hormonų gamyba ir sekrecija. Kortikosteroidai slopina granuliuotųjų ląstelių migraciją – nauji neuronai neįtvirtinami dantytojo vingio granuliuotame sluoksnyje, o lieka kaule. Daroma prielaida, kad tuo pačiu metu sutrinka sinapsinių jungčių susidarymo procesai. Ląstelės nuo tokios „steroidų agresijos“ yra apsaugomos minimalia mineralokortikoidų ir gliukokortikoidų receptorių ekspresija ant proliferuojančių granuliuotųjų ląstelių ne tik dantytojo vingio vystymosi metu, bet ir subrendusiems gyvūnams. Tačiau iš visų smegenų neuronų būtent hipokampo neuronams būdingas didžiausias gliukokortikoidų receptorių kiekis, dėl kurio hipokampe vyksta streso poveikis. Psichoemocinis stresas ir stresinės situacijos slopina neurogenezę, o lėtinis stresas smarkiai sumažina gyvūnų gebėjimą įgyti naujų įgūdžių ir mokytis. Ryškesnis neigiamas lėtinio streso poveikis neurogenezei yra gana suprantamas, jei atsižvelgsime į vyraujančią nervinių kamieninių ląstelių ramybės būseną. Imobilizuojant nėščias žiurkes (graužikams – itin stiprus streso veiksnys), nustatyta, kad prenatalinis stresas taip pat sumažina dantytojo vingio ląstelių skaičių ir reikšmingai slopina neurogenezę. Yra žinoma, kad gliukokortikoidai dalyvauja depresinių būsenų patogenezėje, kurios morfologinis atitikmuo yra neurogenezės slopinimas, neuronų ir tarpneuroninių jungčių patologinė reorganizacija bei nervinių ląstelių žūtis. Kita vertus, antidepresantai chemoterapiniai vaistai aktyvina neuronų de novo susidarymą, o tai patvirtina ryšį tarp naujų neuronų susidarymo hipokampe procesų ir depresijos išsivystymo. Estrogenai daro reikšmingą poveikį neurogenezei, kurios poveikis yra priešingas gliukokortikosteroidų veikimui ir susideda iš nervinių pirmtakų ląstelių proliferacijos ir gyvybingumo palaikymo. Reikėtų pažymėti, kad estrogenai žymiai padidina gyvūnų mokymosi gebėjimus. Kai kurie autoriai ciklinius granuliuotų ląstelių skaičiaus ir jų pertekliaus pokyčius patelėms sieja su estrogenų įtaka.

Yra žinoma, kad neurogenezę kontroliuoja EGF, FGF ir BDNF, tačiau išorinių signalų poveikio kamieninėms ląstelėms iš mitogenų ir augimo faktorių mechanizmai nėra pakankamai ištirti. Nustatyta, kad PDGF in vitro palaiko neuroninę progenitorinių ląstelių diferenciacijos kryptį, o blakstieninis neurotrofinis faktorius (CNTF), kaip ir trijodtironinas, stimuliuoja daugiausia glijos elementų – astrocitų ir oligodendrocitų – susidarymą. Hipofizės adenilato ciklazę aktyvuojantis baltymas (PACAP) ir vazoaktyvus žarnyno peptidas (VIP) aktyvina nervinių progenitorinių ląstelių proliferaciją, tačiau tuo pačiu metu slopina dukterinių ląstelių diferenciacijos procesus. Opioidai, ypač ilgalaikio poveikio atveju, reikšmingai slopina neurogenezę. Tačiau opioidų receptorių kamieninėse ląstelėse ir dantytojo vingio nervinėse progenitorinėse ląstelėse nenustatyta (jų yra diferencijuotuose embrioninio periodo neuronuose), todėl negalima įvertinti tiesioginio opioidų poveikio.

Praktinės regeneracinės-plastinės medicinos poreikiai privertė tyrėjus skirti ypatingą dėmesį kamieninių ląstelių pluri- ir multipotentiškumo tyrimams. Šių savybių įgyvendinimas suaugusio organizmo regioninių kamieninių ląstelių lygmenyje ateityje galėtų užtikrinti reikalingos transplantacijos medžiagos gamybą. Aukščiau buvo parodyta, kad epigenetinė nervinių kamieninių ląstelių stimuliacija leidžia gauti proliferuojančias ląsteles, jau suformuotas pagal nervinius fenotipus, o tai riboja jų skaičių. Naudojant embrioninių kamieninių ląstelių totipotentines savybes, proliferacija, kol gaunamas pakankamas ląstelių skaičius, vyksta anksčiau nei neuroninė diferenciacija, o padaugintos ląstelės lengvai paverčiamos nerviniu fenotipu. Norint gauti nervines kamienines ląsteles, ESL išskiriamos iš blastocistos vidinės ląstelių masės ir kultivuojamos privalomai esant LIF, kuris išsaugo jų totipotentiškumą ir gebėjimą neribotai dalytis. Po to, naudojant retinoinę rūgštį, indukuojama ESL neuroninė diferenciacija. Gautų nervinių kamieninių ląstelių transplantacija į chinolino ir 6-hidroksidopamino pažeistą dryžuotąjį kūną vyksta kartu su jų diferenciacija į dopaminerginius ir serotonerginius neuronus. Suleidus į žiurkės embriono smegenų skilvelius, iš ESC gautos nervinės pirmtakinės ląstelės migruoja į įvairius recipiento smegenų regionus, įskaitant žievę, dryžuotąjį kūną, pertvarą, talamą, pagumburį ir smegenėles. Skilvelio ertmėje likusios ląstelės sudaro epitelio struktūras, primenančias nervinį vamzdelį, taip pat atskiras nenervinio audinio salas. Recipiento embriono smegenų parenchimoje persodintos ląstelės gamina tris pagrindinius nervų sistemos ląstelių tipus. Kai kurios iš jų turi pailgus viršūninius dendritus, piramidinius ląstelių kūnus ir bazinius aksonus, išsikišusius į didžiąją smegenų jungties smegenėlę. Donorinės kilmės astrocitai pratęsia ataugas iki netoliese esančių kapiliarų, o oligodendrocitai glaudžiai liečiasi su mielino movomis, dalyvaudami mielino formavime. Taigi, iš ESC in vitro gautos nervinės pirmtakinės ląstelės gali kryptingai migruoti ir regioniniu būdu diferenciuotis, tinkamai reaguojant į mikroaplinkos signalus, aprūpindamos daugelį besivystančių smegenų sričių neuronais ir glija.

Kai kurie autoriai svarsto suaugusio organizmo regioninių kamieninių ląstelių de- ir transdiferenciacijos galimybę. Netiesiogiai ląstelių dediferenciaciją kultūroje, plečiant jų potencialą, patvirtina duomenys apie pelių nervinių kamieninių ląstelių įsitvirtinimą raudonuosiuose kaulų čiulpuose ir vėlesnį jų ląstelių linijų vystymąsi, gaunant funkciškai aktyvias periferinio kraujo ląsteles. Be to, genetiškai paženklintų (LacZ) neurosferos ląstelių, gautų iš subrendusių arba embrioninių smegenų, transplantacija į apšvitintų pelių, kurių kraujodaros funkcija slopinama, smegenis lėmė ne tik nervinių darinių susidarymą iš kamieninių ląstelių, bet ir kraujo ląstelių susidarymą, o tai rodo nervinių kamieninių ląstelių pluripotentiškumą, realizuotą už smegenų ribų. Taigi, nervinė kamieninė ląstelė, veikiama kaulų čiulpų mikroaplinkos signalų, gali diferencijuotis į kraujo ląsteles, prieš tai transformuodamasi į kraujodaros kamienines ląsteles. Kita vertus, persodinant kaulų čiulpų kraujodaros kamienines ląsteles į smegenis, buvo nustatyta jų diferenciacija veikiant smegenų audinio mikroaplinkai į glijos ir nervines ląsteles. Taigi, nervinių ir hematopoetinių kamieninių ląstelių diferenciacijos potencialas nėra ribojamas audinių specifiškumo. Kitaip tariant, vietinės mikroaplinkos veiksniai, kurie skiriasi nuo būdingų smegenų ir kaulų čiulpų audiniams, gali pakeisti šių ląstelių diferenciacijos kryptį. Įrodyta, kad į apšvitintų pelių veninę sistemą įvestos nervinės kamieninės ląstelės sukuria mieloidinių, limfoidinių ir nesubrendusių hematopoetinių ląstelių populiacijas blužnyje ir kaulų čiulpuose. In vitro buvo nustatytas kaulų čiulpų morfogenetinių baltymų (BMP) poveikis nervinių kamieninių ląstelių išgyvenimui ir diferenciacijai, lemiantis, kaip ir ankstyvosiose embriogenezės stadijose, jų vystymąsi nervine arba glijos kryptimi. 16 dienų amžiaus žiurkių embrionų nervinių kamieninių ląstelių kultūrose BMP sukelia neuronų ir astroglijos formavimąsi, o iš perinatalinių smegenų gautų kamieninių ląstelių kultūrose susidaro tik astrocitai. Be to, BMP slopina oligodendrocitų susidarymą, kurie in vitro atsiranda tik pridėjus BMP antagonisto noggino.

Transdiferenciacijos procesai nėra specifiniai rūšiai: žmogaus kaulų čiulpų kraujodaros kamieninės ląstelės, persodintos į subrendusių žiurkių dryžuotąjį kūną, migruoja į išorinės kapsulės baltąją medžiagą, ipsi- ir kontralateralinę neokorteksą, kur sudaro astrocitų tipo ląstelinius elementus (Azizi ir kt., 1998). Kai kaulų čiulpų kamieninės ląstelės alotransplantuojamos į naujagimių pelių šoninį skilvelį, kraujodaros kamieninių ląstelių migraciją galima atsekti iki priekinių smegenų ir smegenėlių struktūrų. Hipokampo dryžuotajame kūnelyje ir molekuliniame sluoksnyje migruotos ląstelės transformuojasi į astrocitus, o uoslės svogūnėlyje, smegenėlių vidiniame granuliuotųjų ląstelių sluoksnyje ir smegenų kamieno tinkliniame darinyje jos sudaro neuronų tipo ląsteles, teigiamai reaguojančias į neurofilamentus. Suleidus kraujodaros ląstelių į veną suaugusioms pelėms, GFP žymėti mikro- ir astrocitai buvo aptikti neokortekse, talame, smegenų kamiene ir smegenėlėse.

Be to, kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės, iš kurių atsiranda visų tipų jungiamojo audinio ląstelės, tam tikromis sąlygomis taip pat gali patirti neuroninę transdiferenciaciją (prisiminkite, kad embrioninis mezenchimo šaltinis yra nervinės keteros ląstelės). Įrodyta, kad žmogaus ir pelės kaulų čiulpų stromos ląstelės, kultivuojamos in vitro, esant EGF arba BDNF, ekspresuoja nervinių pirmtakų ląstelių nestino žymeklį, o pridėjus įvairių augimo faktorių derinių, susidaro ląstelės su glijos (GFAP) ir neuronų (branduolio baltymo, NeuN) žymenimis. Pažymėtos singeninės mezenchiminės kamieninės ląstelės, persodintos į naujagimių pelių smegenų šoninį skilvelį, migruoja ir lokalizuojasi priekinėse smegenyse ir smegenėlėse, nepažeisdamos recipiento smegenų citoarchitektūros. Kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės diferencijuojasi į subrendusius astrocitus hipokampo dryžuotajame kūnelyje ir molekuliniame sluoksnyje, taip pat užpildo uoslės svogūnėlį, smegenėlių granuliarinius sluoksnius ir tinklinį darinį, kur jos transformuojasi į neuronus. Žmogaus kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės in vitro geba diferencijuotis į makrogliją ir po transplantacijos integruotis į žiurkių smegenų struktūras. Tiesioginė kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacija į suaugusių žiurkių hipokampą taip pat lydima jų migracijos į smegenų parenchimą ir neuroglijos diferenciacijos.

Daroma prielaida, kad kaulų čiulpų kamieninių ląstelių transplantacija gali išplėsti ląstelių terapijos galimybes gydant CNS ligas, kurioms būdinga per didelė neuronų patologinė žūtis. Tačiau reikėtų pažymėti, kad ne visi tyrėjai pripažįsta nervinių ir hematopoetinių kamieninių ląstelių abipusės transformacijos faktą, ypač in vivo, o tai vėlgi lemia patikimo žymens, skirto įvertinti jų transdiferenciaciją ir tolesnę raidą, trūkumas.

Kamieninių ląstelių transplantacija atveria naujus horizontus paveldimos neurologinės patologijos ląstelinės genų terapijos srityje. Genetinė nervinių kamieninių ląstelių modifikacija apima genetinių reguliavimo konstrukcijų įterpimą, kurių produktai sąveikauja su ląstelės ciklo baltymais automatinio reguliavimo režimu. Tokių genų transdukcija į embrionines progenitorines ląsteles naudojama nervinėms kamieninėms ląstelėms dauginti. Dauguma genetiškai modifikuotų ląstelių klonų elgiasi kaip stabilios ląstelių linijos, nerodydami jokių transformacijos požymių in vivo ar in vitro, tačiau pasižymi ryškiu gebėjimu kontaktiškai slopinti proliferaciją. Transplantacijos metu padaugintos transfekuotos ląstelės integruojasi į recipiento audinį, nepažeidžiant citoarchitektūros ir nepatiriant naviko transformacijos. Donoro nervinės kamieninės ląstelės nedeformuoja integracijos zonos ir vienodai konkuruoja dėl vietos su šeimininko progenitorinėmis ląstelėmis. Tačiau 2–3 dieną transfektantų ląstelių dalijimosi intensyvumas smarkiai sumažėja, o tai atitinka jų proliferacijos kontaktinį slopinimą in vitro. Nervinių kamieninių ląstelių recipientai neturi centrinės nervų sistemos vystymosi sutrikimų, visos su transplantatu kontaktuojančios smegenų sritys vystosi normaliai. Po transplantacijos nervinių kamieninių ląstelių klonai greitai migruoja iš injekcijos zonos ir dažnai išeina už atitinkamų embrioninių zonų rostralinio trakto ribos, tinkamai integruodamiesi su kitomis smegenų sritimis. Genetiškai modifikuotų neuroninių kamieninių ląstelių klonų ir transfekuotų ląstelių linijų integracija į šeimininko organizmo smegenis būdinga ne tik embrioniniam laikotarpiui: šios ląstelės implantuojamos į daugybę vaisiaus, naujagimio, suaugusiojo ir net senstančio recipiento organizmo centrinės nervų sistemos sričių ir demonstruoja gebėjimą tinkamai integruotis ir diferenciuotis. Visų pirma, po transplantacijos į smegenų skilvelių ertmę transfekuotos ląstelės migruoja nepažeisdamos hematoencefalinio barjero ir tampa neatsiejama funkcine smegenų audinio ląstelių dalimi. Donoro neuronai sudaro tinkamas sinapses ir ekspresuoja specifinius jonų kanalus. Išsaugojus hematoencefalinio barjero vientisumą, astroglija, transfektantų nervinių kamieninių ląstelių darinys, pratęsia ataugas iki smegenų kraujagyslių, o donoro kilmės oligodendrocitai ekspresuoja mielino bazinį baltymą ir mielinatinius neuroninius ataugas.

Be to, neuroninės kamieninės ląstelės yra transfekuojamos, kad būtų naudojamos kaip ląstelių vektoriai. Tokios vektorinės-genetinės konstrukcijos užtikrina stabilią svetimų genų, dalyvaujančių nervų sistemos vystymesi, ekspresiją in vivo arba yra naudojamos esamiems genetiniams defektams ištaisyti, nes šių genų produktai geba kompensuoti įvairius centrinės nervų sistemos biocheminius sutrikimus. Didelis transfekuotų kamieninių ląstelių migracijos aktyvumas ir tinkama implantacija į įvairių besivystančių smegenų sričių germinacines zonas leidžia tikėtis visiško paveldimo ląstelių fermentų trūkumo atstatymo. Modeliuojant ataksijos-telangiektazijos sindromą (mutantines pelių linijas pg ir pcd), Purkinje ląstelės iš eksperimentinių gyvūnų smegenėlių išnyksta per pirmąsias postnatalinio vystymosi savaites. Įrodyta, kad neuroninių kamieninių ląstelių įvedimas į tokių gyvūnų smegenis lydi jų diferenciaciją į Purkinje ląsteles ir granuliuotus neuronus. pcd mutantams iš dalies koreguojami judesių koordinacijos sutrikimai ir sumažėja tremoro intensyvumas. Panašūs rezultatai gauti persodinant klonuotas žmogaus neuronines kamienines ląsteles primatams, kuriems Purkinje ląstelių degeneracija buvo sukelta naudojant onkonazę. Po transplantacijos donoro nervinės kamieninės ląstelės buvo rastos smegenėlių parenchimos granuliuotame, molekuliniame ir Purkinje ląstelių sluoksniuose. Todėl genetinė nervinių pirmtakų ląstelių modifikacija gali užtikrinti stabilią, įsipareigojusią fenotipo modifikaciją, atsparią išoriniams poveikiams. Tai ypač svarbu patologiniuose procesuose, susijusiuose su recipiento veiksnių, trukdančių donoro ląstelėms išgyventi ir diferenciuotis (pvz., imuninės agresijos metu), vystymusi.

Žmonių VII tipo mukopolisacharidozei būdinga neurodegeneracija ir progresuojanti intelekto negalia, kurią pelėse modeliuoja beta-gliukuronidazės geno delecijos mutacija. Po transfekuotų nervinių kamieninių ląstelių, išskiriančių beta-gliukuronidazę, transplantacijos į naujagimių defektinių pelių recipientų smegenų skilvelius, donorinės ląstelės pirmiausia randamos galinėje zonoje, o paskui pasklinda po visą smegenų parenchimą, stabiliai koreguodamos lizosomų vientisumą mutantų pelių smegenyse. Tay-Sachs ligos modelyje retrovirusu transdukuotos nervinės kamieninės ląstelės, kai jos gimdoje suleidžiamos pelių vaisiams ir persodinamos į naujagimius peles, užtikrina efektyvią beta-heksozaminidazės beta subvieneto ekspresiją recipientuose, kurių mutacija sukelia patologinį beta2-gangliozido kaupimąsi.

Kita regeneracinės medicinos kryptis – paciento nervinių kamieninių ląstelių proliferacinio ir diferenciacinio potencialo stimuliavimas. Visų pirma, nervinės kamieninės ląstelės išskiria NT-3 nugaros smegenų hemisekcijos ir smegenų asfiksijos metu žiurkėms, ekspresuoja NGF ir BDNF pertvaroje ir baziniuose ganglijose, tirozino hidroksilazes dryžuotajame kūne, taip pat reiliną smegenėlėse ir mielino bazinį baltymą smegenyse.

Tačiau neurogenezės stimuliavimo klausimams akivaizdžiai neskiriama pakankamai dėmesio. Keletas tyrimų rodo, kad funkcinis krūvis nervų centrams, atsakingiems už kvapų skyrimą, atsispindi naujų neuronų formavimesi. Transgeninėms pelėms, kurioms trūksta neuronų adhezijos molekulių, neurogenezės intensyvumo sumažėjimas ir į uoslės svogūnėlius migruojančių neuronų skaičiaus sumažėjimas buvo derinamas su gebėjimo skirti kvapus sutrikimu, nors kvapų suvokimo slenkstis ir trumpalaikė uoslės atmintis nebuvo sutrikę. Svarbų vaidmenį reguliuojant neurogenezę vaidina dantytojo vingio ląstelių funkcinė būsena: susilpnėjęs glutamato poveikis granuliuotoms ląstelėms po entorinalinės žievės sunaikinimo skatina neuronų proliferaciją ir diferenciaciją, o perforacinio kelio (pagrindinio aferentinio įėjimo į hipokampą) skaidulų stimuliavimas slopina neurogenezę. NMDA receptorių antagonistai aktyvuoja naujų neuronų formavimosi procesus, o agonistai, priešingai, sumažina neurogenezės intensyvumą, o tai savo ruožtu primena gliukokortikosteroidų veikimą. Literatūroje randami prieštaringi tyrimų rezultatai: informacija apie eksperimentiškai įrodytą sužadinamojo neurotransmiterio glutamato slopinamąjį poveikį neurogenezei neatitinka duomenų apie progenitorinių ląstelių proliferacijos stimuliavimą ir naujų neuronų atsiradimą, padidėjusį traukulių aktyvumą gyvūnų hipokampe, naudojant eksperimentinius kaino ir pilokarpino epilepsijos modelius. Tuo pačiu metu, tradiciniame epilepsijos modelyje, kurį sukelia daugybinė tam tikros smegenų srities poslenkstinė stimuliacija (užsidegimas) ir kuriam būdinga mažiau ryški neuronų žūtis, neurogenezės intensyvumas padidėja tik vėlyvoje užsidegimo fazėje, kai hipokampe stebimas neuronų pažeidimas ir žūtis. Įrodyta, kad sergant epilepsija, traukulių aktyvumas stimuliuoja neurogenezę, kai atsiranda nenormali naujų granuliuotų neuronų lokalizacija, kurių daugelis atsiranda ne tik dantytoje vingyje, bet ir hilus. Tokie neuronai yra labai svarbūs samaninių skaidulų ataugų vystymuisi, nes jų aksonai sudaro normaliai nebūnančias atvirkštines kolaterales, kurios sudaro daugybę sinapsių su kaimyninėmis granuliuotomis ląstelėmis.

Regioninių nervinių kamieninių ląstelių panaudojimas atveria naujas ląstelių transplantacijos taikymo perspektyvas gydant metabolines ir genetines neurodegeneracines ligas, demielinizuojančias ligas ir centrinės nervų sistemos potrauminius sutrikimus. Prieš atliekant pakaitinę ląstelių transplantaciją pagal vieną iš metodų, ex vivo atliekama reikiamo tipo nervinių pirmtakų ląstelių atranka ir išplėtimas, siekiant jas vėliau tiesiogiai įvesti į pažeistą smegenų sritį. Terapinis poveikis šiuo atveju pasiekiamas pakeitus pažeistas ląsteles arba vietiniu augimo faktorių ir citokinų išsiskyrimu. Šis regeneracinės-plastinės terapijos metodas reikalauja pakankamai didelio skaičiaus ląstelių, turinčių iš anksto nustatytas funkcines savybes, transplantacijos.

Taip pat reikėtų laikyti tikslingais tolesnius subrendusių smegenų kamieninių ląstelių molekulinių savybių ir regeneracinio-plastinio potencialo, taip pat skirtingos audinių kilmės regioninių kamieninių ląstelių gebėjimo transdiferencijuoti tyrimus. Šiandien jau atliktas kaulų čiulpų kraujodaros kamieninių ląstelių antigenų patikrinimas, nustatant ląstelių, galinčių transdiferencijuotis į nervines kamienines pirmtakines ląsteles, žymenų derinį (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Gautos ląstelės, kurios in vitro sudaro neurosferas ir, persodinus į naujagimių imunodeficito pelių smegenis, sudaro neuronus. Ląstelių ksenotransplantologijai įdomūs tyrimų rezultatai apie kamieninių ląstelių kryžminės transplantacijos galimybę evoliuciškai tolimų taksonų individams. Nervinių kamieninių ląstelių implantacijos į smegenų naviko sritį rezultatai lieka be tinkamos interpretacijos: persodintos ląstelės aktyviai migruoja per visą naviko tūrį, neperžengdamos jo ribų, o kai ląstelės įvedamos į nepažeistą smegenų dalį, stebima jų aktyvi migracija naviko link. Klausimas apie tokios migracijos biologinę reikšmę lieka atviras.

Reikėtų pažymėti, kad sėkminga nervinių kamieninių ląstelių, kaip ir kitų iš ESL gautų nervinių progenitorinių ląstelių, transplantacija įmanoma tik naudojant labai išgrynintas nervines progenitorines ląsteles, nes nediferencijuotos embrioninės kamieninės ląstelės, persodinus jas suaugusiam imunokompetentiniam recipientui, neišvengiamai transformuojasi į teratomas ir teratokarcinomas. Net minimalus blogai diferencijuotų ląstelių kiekis donoro ląstelių suspensijoje smarkiai padidina transplantato naviko atsiradimo riziką ir nepriimtinai padidina naviko išsivystymo ar nenervinio audinio susidarymo riziką. Homogeninių nervinių progenitorinių ląstelių populiacijų gavimas yra įmanomas, kai kaip alternatyvų donoro audinio šaltinį naudojamos ląstelės, atsirandančios tam tikruose normalios embriogenezės etapuose. Kitas metodas apima kruopštų nepageidaujamų ląstelių populiacijų pašalinimą taikant linijai būdingą atranką. ESL naudojimas neurotransplantacijai po nepakankamo jų poveikio augimo faktoriams in vitro taip pat yra pavojingas. Tokiu atveju negalima atmesti nervinės diferenciacijos programos nesėkmės ir nerviniam vamzdeliui būdingų struktūrų susidarymo.

Šiandien visiškai akivaizdu, kad nervinės kamieninės ląstelės pasižymi tropizmu patologiškai pakitusioms centrinės nervų sistemos sritims ir turi ryškų regeneracinį-plastinį poveikį. Nervinio audinio ląstelių mirties vietos mikroaplinka modeliuoja persodintų ląstelių diferenciacijos kryptį, taip papildydama specifinių nervinių elementų trūkumą CNS pažeidimo zonoje. Kai kuriuose neurodegeneraciniuose procesuose atsiranda neurogeniniai signalai neurogenezės pakartojimui, o subrendusių smegenų nervinės kamieninės ląstelės geba reaguoti į šią pamokančią informaciją. Daugybė eksperimentinių duomenų aiškiai iliustruoja nervinių kamieninių ląstelių terapinį potencialą. Nervinių kamieninių ląstelių klono intracisterninis įvedimas gyvūnams, perrišant vidurinę smegenų arteriją (išeminio insulto modelis), padeda sumažinti destruktyviai pakitusios smegenų srities plotą ir tūrį, ypač nervinių kamieninių ląstelių transplantacijos kartu su FGF2 atveju. Imunocitochemiškai stebima donorinių ląstelių migracija į išeminę zoną ir vėlesnė jų integracija su sveikomis recipientinėmis smegenų ląstelėmis. Nesubrendusių pelių neuroepitelinės linijos MHP36 ląstelių transplantacija į žiurkių, patyrusių eksperimentinį insultą, smegenis pagerina sensomotorinę funkciją, o šių ląstelių įvedimas į smegenų skilvelius – kognityvinę funkciją. Neuroniškai iš anksto suformuotų žmogaus kaulų čiulpų hematopoetinių ląstelių transplantacija žiurkėms pašalina išeminio pažeidimo sukeltą smegenų žievės disfunkciją. Šiuo atveju ksenogeninės nervinės progenitorinės ląstelės migruoja iš injekcijos vietos į smegenų audinio destruktyvių pokyčių zoną. Homologiškų kaulų čiulpų ląstelių intrakranijinė transplantacija trauminio smegenų žievės pažeidimo atveju žiurkėms iš dalies atkuria motorinę funkciją. Donoro ląstelės prigyja, proliferuoja, patiria neuroninę diferenciaciją į neuronus ir astrocitus ir migruoja pažeidimo link. Sušvirkštos į suaugusių žiurkių, patyrusių eksperimentinį insultą, dryžuotąjį kūną, klonuotos žmogaus nervinės kamieninės ląstelės pakeičia pažeistas CNS ląsteles ir iš dalies atkuria sutrikusią smegenų funkciją.

Žmogaus nervinės kamieninės ląstelės daugiausia išskiriamos iš embriono telencephalono, kuris išsivysto daug vėliau nei labiau uodeginėje pusėje esančios nervinio kamieno dalys. Įrodyta galimybė išskirti nervines kamienines ląsteles iš 43–137 dienų amžiaus žmogaus vaisiaus nugaros smegenų, nes, esant EGF ir FGF2, šios ląstelės sudaro neurosferas ir ankstyvosiose pasažuose pasižymi multipotencija, diferencijuodamosi į neuronus ir astrocitus. Tačiau ilgalaikis nervinių progenitorinių ląstelių kultivavimas (ilgiau nei 1 metus) atima iš jų multipotenciją – tokios ląstelės geba diferencijuotis tik į astrocitus, t. y. tampa unipotentėmis. Regioninės nervinės kamieninės ląstelės gali būti gautos atlikus dalinę bulbektomiją ir, po dauginimo kultūroje esant LIF, persodintos tam pačiam pacientui, kuriam yra neurodegeneracinių pokyčių kitose centrinės nervų sistemos dalyse. Klinikoje pakaitinė ląstelių terapija, naudojant nervines kamienines ląsteles, pirmą kartą buvo atlikta gydant pacientus, patyrusius insultą, lydimą smegenų bazinių ganglijų pažeidimo. Dėl donorinių ląstelių transplantacijos pastebėtas daugumos pacientų klinikinės būklės pagerėjimas.

Kai kurie autoriai mano, kad nervinių kamieninių ląstelių gebėjimas įsitvirtinti, migruoti ir integruotis į įvairias nervinio audinio sritis, pažeidus CNS, atveria neribotas galimybes ląstelių terapijai ne tik lokalių, bet ir ekstensyvių (insultas ar asfiksija), daugiažidininių (išsėtinė sklerozė) ir net globalių (dauguma paveldimų medžiagų apykaitos sutrikimų ar neurodegeneracinių demencijų) patologinių procesų atveju. Iš tiesų, kai klonuotos pelės ir žmogaus nervinės kamieninės ląstelės persodinamos recipientams gyvūnams (atitinkamai pelėms ir primatams), kuriems mezostriatalinėje sistemoje yra degeneravusi dopaminerginių neuronų, įvedus metilfeniltetrapiridiną (Parkinsono ligos modelis) 8 mėnesius prieš transplantaciją, donoro nervinės kamieninės ląstelės integruojasi į recipiento CNS. Po mėnesio persodintos ląstelės lokalizuojasi abiejose vidurinių smegenų srityse. Kai kurie gauti donoro kilmės neuronai ekspresuoja tirozino hidrolazę, nes nėra imuninės reakcijos į transplantaciją požymių. Žiurkėms, kurioms buvo skirtas 6-hidroksidopaminas (kitas eksperimentinis Parkinsono ligos modelis), persodintų ląstelių adaptaciją prie šeimininko smegenų mikroaplinkos lėmė nervinių kamieninių ląstelių kultivavimo sąlygos prieš jų transplantaciją. Neuroninės kamieninės ląstelės, in vitro sparčiai daugindamosi veikiant EGF, efektyviau kompensavo pažeisto dryžuotojo kūno dopaminerginių neuronų trūkumą nei 28 dienų kultūrų ląstelės. Autoriai mano, kad taip yra dėl to, kad in vitro neuroninių pirmtakų ląstelių dalijimosi proceso metu prarandama gebėjimas suvokti atitinkamus diferenciacijos signalus.

Kai kuriuose tyrimuose buvo bandoma padidinti poveikio pažeisto striatumo reinnervacijos procesams efektyvumą, persodinant embrionines striatumo ląsteles į šią sritį kaip neurotrofinių faktorių šaltinį ir tuo pačiu metu persodant ventralinio tarpsmegeninio smegenų dopaminerginius neuronus. Paaiškėjo, kad neurotransplantacijos efektyvumas labai priklauso nuo embrioninio nervinio audinio įvedimo metodo. Atlikus embrioninių nervinių audinių preparatų transplantacijos į smegenų skilvelių sistemą tyrimus (siekiant išvengti striatumo parenchimos pažeidimo), gauta informacijos apie jų teigiamą poveikį motoriniam defektui sergant parkinsonizmu.

Tačiau kituose tyrimuose eksperimentiniai stebėjimai parodė, kad embrioninių nervinių audinių preparatų, kuriuose yra dopaminerginių neuronų, transplantacija iš ventralinio tarpsmegeninio kūno į smegenų skilvelį, taip pat GABA-erginių embrioninių nervinių elementų transplantacija į žiurkių, sergančių hemiparkinsonizmu, dryžuotąjį kūną neskatina sutrikusių dopaminerginės sistemos funkcijų atkūrimo. Priešingai, imunocitocheminė analizė patvirtino duomenis apie mažą ventralinio tarpsmegeninio kūno dopaminerginių neuronų, persodintų į žiurkių dryžuotąjį kūną, išgyvenamumą. Terapinis ventralinio tarpsmegeninio kūno embrioninio nervinio audinio intraventrikulinės transplantacijos poveikis buvo pasiektas tik tuo atveju, jei į denervuotą dryžuotąjį kūną vienu metu buvo implantuotas embrioninių dryžuotojo kūno ląstelių preparatas. Autoriai mano, kad šio poveikio mechanizmas yra susijęs su teigiamu trofiniu GABA-erginių embrioninio dryžuotojo kūno elementų poveikiu specifiniam intraventrikulinių ventralinio tarpsmegeninio kūno transplantatų dopaminerginiam aktyvumui. Ryškią glijos reakciją transplantatuose lydėjo nedidelis apomorfino testo parametrų sumažėjimas. Pastarasis, savo ruožtu, koreliavo su GFAP kiekiu kraujo serume, kuris tiesiogiai rodė kraujo ir smegenų barjero pralaidumo pažeidimą. Remdamiesi šiais duomenimis, autoriai padarė išvadą, kad GFAP lygis kraujo serume gali būti naudojamas kaip tinkamas kriterijus transplantato funkcinei būklei įvertinti, o padidėjęs kraujo ir smegenų barjero pralaidumas neurospecifiniams antigenams, tokiems kaip GFAP, yra patogenezinis ryšys, lemiantis transplantacijos nepakankamumą dėl autoimuninių recipiento nervinio audinio pažeidimų.

Kitų tyrėjų požiūriu, nervinių kamieninių ląstelių prigijimas ir integracija po transplantacijos yra stabili ir trunka visą gyvenimą, nes donorinės ląstelės recipientų organizme randamos mažiausiai dvejus metus po transplantacijos ir jų skaičius reikšmingai nesumažėja. Bandymai tai paaiškinti tuo, kad nediferencijuotoje būsenoje nervinės kamieninės ląstelės neekspresuoja I ir II klasės MHC molekulių tokiu lygiu, kad sukeltų imuninę atmetimo reakciją, gali būti laikomi teisingais tik mažai diferencijuotų nervinių pirmtakų atveju. Tačiau ne visos nervinės kamieninės ląstelės recipiento smegenyse yra išsaugotos nesubrendusioje ramybės būsenoje. Dauguma jų patiria diferenciaciją, kurios metu MHC molekulės yra ekspresuojamos pilnai.

Visų pirma, nepakankamas embrioninių ventralinių tarpsmegeninių preparatų, turinčių dopaminerginių neuronų, intrastriatalinės transplantacijos efektyvumas eksperimentinio parkinsonizmo gydymui yra susijęs su mažu persodintų dopaminerginių neuronų išgyvenamumu (tik 5–20 %), kurį sukelia reaktyvioji gliozė, lydinti vietinę smegenų parenchimos traumą transplantacijos metu. Yra žinoma, kad vietinė smegenų parenchimos trauma ir kartu esanti gliozė sutrikdo kraujo ir smegenų barjero vientisumą, dėl ko į periferinį kraują išsiskiria nervinio audinio antigenai, ypač OCAR ir neuronui specifinis antigenas. Šių antigenų buvimas kraujyje gali sukelti specifinių citotoksinių antikūnų prieš juos gamybą ir autoimuninės agresijos vystymąsi.

V. Tsymbalyuk ir bendraautoriai (2001) teigia, kad vis dar galioja tradicinis požiūris, pagal kurį centrinė nervų sistema yra imunologiškai privilegijuota zona, izoliuota nuo imuninės sistemos hematoencefaliniu barjeru. Savo literatūros apžvalgoje autoriai cituoja keletą darbų, rodančių, kad šis požiūris nevisiškai atitinka imuninių procesų esmę žinduolių smegenyse. Nustatyta, kad į smegenų parenchimą įvestos žymėtos medžiagos gali pasiekti giliuosius kaklo limfmazgius, o po antigenų injekcijos į smegenis organizme susidaro specifiniai antikūnai. Kaklo limfmazgių ląstelės į tokius antigenus reaguoja proliferacija, pradedant 5 dieną po injekcijos. Specifinių antikūnų susidarymas taip pat nustatytas odos transplantacijos į smegenų parenchimą metu. Apžvalgos autoriai pateikia kelis hipotetinius antigenų pernašos iš smegenų į limfinę sistemą kelius. Vienas iš jų yra antigenų perėjimas iš perivaskulinių erdvių į subarachnoidinę erdvę. Daroma prielaida, kad perivaskulinės erdvės, esančios palei stambiuosius smegenų indus, yra smegenų limfinės sistemos atitikmuo. Antrasis kelias eina palei baltuosius pluoštus – per sielkaulį į nosies gleivinės limfagysles. Be to, kietajame smegenų dangale yra platus limfagyslių tinklas. Kraujo ir smegenų barjero nepralaidumas limfocitams taip pat yra gana santykinis. Įrodyta, kad aktyvuoti limfocitai geba gaminti fermentus, kurie veikia smegenų „imuninio filtro“ struktūrų pralaidumą. Postkapiliarinių venulių lygmenyje aktyvuoti T pagalbininkai prasiskverbia pro nepažeistą kraujo ir smegenų barjerą. Tezė apie ląstelių, kurios reprezentuoja antigenus, nebuvimą smegenyse neatlaiko kritikos. Šiuo metu įtikinamai įrodyta galimybė, kad antigenus CNS reprezentuoja bent trijų tipų ląstelės. Pirma, tai yra kaulų čiulpų kilmės dendritinės ląstelės, kurios yra lokalizuotos smegenyse palei stambiuosius kraujagysles ir baltojoje medžiagoje. Antra, antigenai geba pateikti smegenų kraujagyslių endotelio ląsteles, o kartu su MHC antigenais tai palaiko šiems antigenams būdingų T ląstelių kloninį augimą. Trečia, mikro- ir astroglijos ląstelės veikia kaip antigenus pateikiantys agentai. Dalyvaudami imuninio atsako formavime centrinėje nervų sistemoje, astrocitai įgyja imuninės efektorinės ląstelės savybes ir ekspresuoja daugybę antigenų, citokinų ir imunomoduliatorių. Inkubuojant su γ-interferonu (γ-INF), astroglijos ląstelės in vitro ekspresuoja I ir II klasės MHC antigenus, o stimuliuojami astrocitai geba pateikti antigenus ir palaikyti limfocitų kloninę proliferaciją.

Smegenų audinio trauma, pooperacinis uždegimas, edema ir fibrino sankaupos, lydinčios embriono nervinio audinio transplantaciją, sudaro sąlygas padidėjusiam hematoencefalinio barjero pralaidumui, sutrikus autotolerancijai, jautrumui ir CD3+CD4+ limfocitų aktyvacijai. Auto- ir alloantigenų pateikimą atlieka astrocitai ir mikroglijos ląstelės, kurios reaguoja į y-INF ekspresuodamos MHC molekules, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimuliacines molekules B7-1 (CD80) ir B7-2 (CD86), taip pat sekretuodamos IL-la, IL-ip ir y-INF.

Todėl ilgesnis embriono nervinio audinio išgyvenamumas po intracerebrinės transplantacijos, palyginti su jo periferiniu suleidimu, vargu ar gali būti siejamas su transplantacijos imuniteto neprasidėjimu. Be to, svarbų vaidmenį atmetimo procese vaidina monocitai, aktyvuoti limfocitai (citotoksinės CD3+CD8+ ir T pagalbinės ląstelės) ir jų gaminami citokinai, taip pat antikūnai prieš periferinio embriono nervinio audinio transplantato antigenus. Žemas MHC molekulių ekspresijos lygis embriono nerviniame audinyje yra labai svarbus sudarant sąlygas ilgesniam neurotransplantacijos atsparumui T ląstelių imuniniams procesams. Štai kodėl eksperimento metu imuninis uždegimas po embriono nervinio audinio transplantacijos į smegenis vystosi lėčiau nei po odos persodinimo. Nepaisant to, po 6 mėnesių stebimas visiškas atskirų nervinio audinio transplantatų sunaikinimas. Šiuo atveju MHC II klasės antigenų apriboti T limfocitai daugiausia lokalizuojasi transplantacijos zonoje (Nicholas ir kt., 1988). Eksperimentiškai nustatyta, kad ksenologinės neurotransplantacijos metu T pagalbininkų (L3T4+), bet ne citotoksinių T limfocitų (Lyt-2), išeikvojimas pailgina žiurkės nervinio audinio išgyvenamumą recipientų pelių smegenyse. Neurotransplantato atmetimą lydi šeimininko makrofagų ir T limfocitų infiltracija į jį. Dėl to šeimininko makrofagai ir aktyvuotos mikroglijos ląstelės veikia in situ kaip antigeną pateikiančios imunostimuliuojančios ląstelės, o padidėjusi donoro MHC I klasės antigenų raiška sustiprina recipientų citotoksinių T limfocitų žudikišką aktyvumą.

Nėra prasmės analizuoti daugybės spekuliatyvių bandymų paaiškinti neurotransplanto atmetimo faktą recipiento imuninės sistemos reakcija į donoro endotelio ląsteles arba glijos elementus, nes net grynos nervinių pirmtakų ląstelių linijos yra linkusios į imuninę ataką. Pažymėtina, kad Fas ligandų raiška smegenų ląstelėse, kurios jungiasi prie apoptozės receptorių (Fas molekulių) ant smegenis infiltruojančių T limfocitų ir sukelia jų apoptozę, vaidina svarbų vaidmenį ilgesnio transplantato išgyvenamumo CNS mechanizmuose, kuris yra tipiškas transbarjerinių autoimunogeninių audinių apsauginis mechanizmas.

Kaip teisingai pastebi V. Tsymbalyuk ir bendraautoriai (2001), embriono nervinio audinio transplantacijai būdingas uždegimo vystymasis, kuriame dalyvauja ląstelės, jautrios smegenų antigenams, ir aktyvuotos ląstelės, antikūnai, taip pat dėl vietinės citokinų gamybos. Svarbų vaidmenį čia atlieka jau esama organizmo jautrinimas smegenų antigenams, kuris atsiranda vystantis CNS ligoms ir gali būti nukreiptas į transplantacijos antigenus. Štai kodėl tikrai ilgalaikis histoinkompatibilis neurotransplantacijų išgyvenimas pasiekiamas tik slopinant imuninę sistemą ciklosporinu A arba įvedant monokloninius antikūnus prieš recipiento CD4+ limfocitus.

Taigi, daugelis neurotransplantacijos problemų lieka neišspręstos, įskaitant ir susijusias su audinių imunologiniu suderinamumu, kurias galima išspręsti tik atlikus tikslinius fundamentinius ir klinikinius tyrimus.