Molekuliniai genetiniai paveldimų ligų diagnostikos metodai

DNR technologijos metodai naudojami norint nustatyti mutantinio geno, atsakingo už tam tikrų paveldimų patologijų formų kilmę, lokalizaciją konkrečioje chromosomoje. Kadangi genas yra DNR dalis, o geno mutacija – pirminės DNR struktūros pažeidimas (mutacija suprantama kaip visi DNR sekos pokyčiai, neatsižvelgiant į jų lokalizaciją ir poveikį individo gyvybingumui), tai, zonduojant paveldima liga sergančio paciento metafazinių chromosomų preparatus, galima nustatyti patologinio geno lokalizaciją. Molekuliniai genetiniai metodai sudaro galimybes diagnozuoti ligas pakitusios DNR struktūros lygmenyje, jie leidžia nustatyti paveldimų sutrikimų lokalizaciją. Molekuliniai genetiniai metodai gali nustatyti mutacijas, susijusias net su vienos bazės pakeitimu.

Svarbiausias geno identifikavimo etapas yra jo išskyrimas. DNR galima išskirti iš bet kokio tipo audinių ir ląstelių, turinčių branduolius. DNR išskyrimo etapai apima: greitą ląstelių lizę, ląstelių organelių ir membranų fragmentų pašalinimą centrifuguojant, fermentinį baltymų sunaikinimą ir jų išskyrimą iš tirpalo naudojant fenolį ir chloroformą, DNR molekulių koncentravimą nusodinant etanolyje.

Genetikos laboratorijose DNR dažniausiai išskiriama iš kraujo leukocitų, tam iš paciento paimama 5–20 ml veninio kraujo į sterilų mėgintuvėlį su antikoagulianto tirpalu (heparinu). Tada leukocitai atskiriami ir apdorojami pagal aukščiau nurodytus veiksmus.

Kitas medžiagos paruošimo tyrimams etapas yra DNR „supjaustymas“ į fragmentus srityse su griežtai specifine bazių seka, kuris atliekamas naudojant bakterijų fermentus – restrikcijos endonukleazes (restrikcijos fermentus). Restrikcijos fermentai atpažįsta specifines 4–6, rečiau 8–12 nukleotidų sekas dvigrandėje DNR molekulėje ir padalija ją į fragmentus šių sekų vietose, vadinamose restrikcijos vietomis. Gautų DNR restrikcijos fragmentų skaičių lemia restrikcijos vietų atsiradimo dažnis, o fragmentų dydį – šių vietų pasiskirstymo pobūdis išilgai pradinės DNR molekulės. Kuo dažniau yra restrikcijos vietos, tuo trumpesni DNR fragmentai po restrikcijos. Šiuo metu žinoma daugiau nei 500 skirtingų bakterinės kilmės restrikcijos fermentų tipų, ir kiekvienas iš šių fermentų atpažįsta savo specifinę nukleotidų seką. Ateityje restrikcijos vietos gali būti naudojamos kaip genetiniai DNR žymenys. Restrikcijos rezultatu susidariusius DNR fragmentus galima surūšiuoti pagal ilgį elektroforezės būdu agarozės arba poliakrilamido gelyje ir tokiu būdu nustatyti jų molekulinę masę. Paprastai DNR gelyje identifikuojama specifiniu dažymu (dažniausiai etidio bromidu) ir apžiūrint gelį praleidžiamoje ultravioletinėje šviesoje. DNR lokalizacijos vietos yra nudažytos raudonai. Tačiau žmonėms, kai DNR apdorojama keliais restrikcijos fermentais, susidaro tiek daug skirtingo ilgio fragmentų, kad jų negalima atskirti elektroforezės būdu, t. y. elektroforezės metu vizualiai identifikuoti atskirų DNR fragmentų neįmanoma (gaunamas vienodas dažymas per visą gelio ilgį). Todėl norint identifikuoti norimus DNR fragmentus tokiame gelyje, naudojamas hibridizacijos metodas su žymėtais DNR zondais.

Bet kuris viengrandis DNR arba RNR segmentas gali jungtis (hibridizuotis) su komplementaria grandine, guaninas visada jungiasi su citozinu, o adeninas – su timinu. Taip susidaro dvigrandė molekulė. Jei klonuoto geno viengrandė kopija pažymėta radioaktyvia žyme, gaunamas zondas. Zondas geba rasti komplementarų DNR segmentą, kuris vėliau lengvai identifikuojamas naudojant autoradiografiją. Į ištemptų chromosomų preparatą pridėtas radioaktyvus zondas leidžia lokalizuoti geną konkrečioje chromosomoje: naudojant DNR zondą, specifines sritis galima identifikuoti Southern blotingo metu. Hibridizacija įvyksta, jei tiriamoje DNR atkarpoje yra normalus genas. Tuo atveju, kai yra nenormali nukleotidų seka, t. y. atitinkamose chromosomų struktūrose yra mutantinis genas, hibridizacija nevyksta, o tai leidžia nustatyti patologinio geno lokalizaciją.

DNR zondams gauti naudojamas genų klonavimo metodas. Metodo esmė ta, kad į klonavimo dalelę, dažniausiai į bakterinę plazmidę (žiedinę ekstrachromosominę DNR, esančią bakterijų ląstelėse ir turinčią atsparumo antibiotikams genus), įterpiamas geną arba geno dalį atitinkantis DNR fragmentas, o tada bakterijos su plazmide, kurioje yra įterptas žmogaus genas, yra dauginamos. Dėl sintezės procesų plazmidėje galima gauti milijardus žmogaus geno arba jo dalies kopijų.

Gautos DNR kopijos, paženklintos radioaktyvia žyme arba fluorochromais, naudojamos kaip zondai, ieškant komplementarių sekų tarp tiriamų DNR molekulių.

Šiuo metu yra daug įvairių metodų, naudojančių DNR zondus genų mutacijoms diagnozuoti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]