Kraujodaros kamieninės ląstelės iš bambagyslės kraujo

Virkštelės kraujas yra geras kraujodaros kamieninių ląstelių šaltinis, atsižvelgiant į kraujodaros ląstelių proliferacinį potencialą ir repopuliacijos galimybes. Ne kartą įrodyta, kad iki gimimo virkštelės kraujyje yra pakankamai daug silpnai įsipareigojusių kraujodaros kamieninių ląstelių. Kai kurie autoriai mano, kad virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijos privalumas yra tai, kad nereikia ieškoti donoro, suderinamo su HLA antigenais. Jų nuomone, naujagimio imuninės sistemos nesubrendimas lemia sumažėjusį imunokompetenčių ląstelių funkcinį aktyvumą ir atitinkamai mažesnį sunkios transplantato prieš šeimininką ligos dažnį nei po kaulų čiulpų transplantacijos. Tuo pačiu metu virkštelės kraujo ląstelių transplantacijos išgyvenamumas nėra mažesnis nei kaulų čiulpų ląstelių, net ir naudojant mažesnį HSC skaičių, skiriamą 1 kg paciento kūno svorio. Tačiau, mūsų nuomone, optimalaus persodintų virkštelės kraujo ląstelių skaičiaus, reikalingo veiksmingam prigijimui recipiento organizme, jų imunologinio suderinamumo ir daugelio kitų virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijos problemos aspektų klausimai reikalauja rimtesnės analizės.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Hematopoetinių kamieninių ląstelių gavimas iš virkštelės kraujo

Hematopoetinių kamieninių ląstelių gavimo iš virkštelės kraujo procedūra reikalauja, kad jos būtų surinktos iš karto po vaiko gimimo ir atskirtos nuo placentos, kai placenta yra gimdoje arba ex utero, taip pat cezario pjūvio metu, bet taip pat ir ex utero. Įrodyta, kad jei laikas nuo gimimo iki naujagimio atsiskyrimo nuo placentos sutrumpinamas iki 30 sekundžių, gauto virkštelės kraujo tūris padidėja vidutiniškai 25–40 ml. Jei ši procedūra atliekama vėliau, prarandamas toks pat kraujo kiekis. Nustatyta, kad ankstyvas vaiko atsiskyrimas nuo placentos nesukelia jokių neigiamų pasekmių naujagimiui.

Rusijos hematologijos ir transfuziologijos tyrimų institutas sukūrė veiksmingas ir nebrangias virkštelės kraujo gavimo technologijas tiek normalaus gimdymo ((70,2+25,8) ml), tiek cezario pjūvio metu ((73,4+25,1) ml). Pasiūlytas virkštelės kraujo atskyrimo metodas, užtikrinantis pakankamai didelį branduolinių ir mononuklearinių ląstelių išeigą – atitinkamai (83,1+9,6) ir (83,4+14,1) %. Patobulintas virkštelės kraujo kriokonservavimo metodas, užtikrinantis aukštą mononuklearinių ląstelių ir CFU-GM išsaugojimą – atitinkamai (96,8+5,7) ir (89,6+22,6) %. Nustatytas virkštelės kraujo surinkimo drenažo metodo, naudojant „Kompoplast-300“ konteinerį (Rusija), efektyvumas. Autoriai virkštelės kraują surinko iškart po vaiko gimimo ir jo atskyrimo nuo placentos, placentos padėties gimdoje arba ex utero sąlygomis. Prieš bambos venos punkciją bambos virkštelė buvo vieną kartą apdorota 5 % jodo tinktūra, o po to du kartus – 70 % etilo alkoholiu. Kraujas savaime tekėjo per jungiamuosius vamzdelius į indą. Surinkimo procedūra truko ne ilgiau kaip 10 minučių. Vidutinis 66 virkštelės kraujo mėginių, surinktų drenažu, tūris buvo (72 + 28) ml, o leukocitų skaičius vidutiniame bendrame mėginio tūryje buvo (1,1 + 0,6) x 107. Analizuojant virkštelės kraujo sterilumą (bakterinis užterštumas, ŽIV-1, hepatito B ir C virusai, sifilis ir citomegaloviruso infekcija), IgG antikūnai prieš hepatito C virusą buvo aptikti tik viename mėginyje. Kitame tyrime placenta buvo padėta vaisiaus paviršiumi žemyn ant specialaus rėmo iškart po gimimo, bambos virkštelė buvo apdorota 5 % jodo tirpalu ir 75 % etilo alkoholiu. Bambos vena buvo drenuojama naudojant adatą iš transfuzijos sistemos (G16). Kraujas į indą tekėjo savaime. Vidutinis tokiu būdu surinkto kraujo tūris buvo (55 + 25) ml. G. Koglerio ir kt. darbe... (1996) virkštelės kraujas buvo surinktas uždaru metodu ir gauti dideli kraujo kiekiai – vidutiniškai (79+26) ml. Autoriai pažymi, kad iš 574 virkštelės kraujo mėginių apie 7 % buvo mažiau nei 40 ml kraujo, todėl jų negalima naudoti transplantacijai. K. Isoyama ir kt. (1996), surinkę virkštelės kraują aktyvios eksfuzijos būdu naudojant švirkštus, vidutiniškai gavo 69,1 ml kraujo (virkštelės kraujo tūris svyravo nuo 15 iki 135 ml). Galiausiai A. Abdel-Mageed PI ir kt. (1997) per bambos venos kateterizaciją pavyko gauti vidutiniškai 94 ml virkštelės kraujo (nuo 56 iki 143 ml).

Siekiant sumažinti jatrogeninės infekcijos ir užteršimo motinos išskyromis riziką, buvo sukurta uždara kraujo surinkimo sistema, pagrįsta plačiai naudojama „Baxter Healthcare Corp.“, Deerfield, IL (JAV), perpylimo sistema, kurioje yra 62,5 ml CPDA (citrato-fosfato-dekstrozės su adeninu) kaip antikoagulianto. Medžiagos gavimo technologija yra ypač svarbi norint paruošti aukštos kokybės mėginį pagal ląstelių suspensijos tūrį, sudėtį ir grynumą. Iš esamų virkštelės kraujo surinkimo metodų, kurie paprastai skirstomi į uždaras, pusiau atviras ir atviras sistemas, pirmenybė turėtų būti teikiama pirmajam, nes uždara sistema žymiai sumažina medžiagos mikrobinio užteršimo, taip pat ląstelių suspensijos užteršimo motinos ląstelėmis riziką.

A. Nagler ir kt. (1998) atliko visų trijų virkštelės kraujo surinkimo sistemų efektyvumo lyginamąją analizę. Pirmajame variante procedūra buvo atliekama uždaroje sistemoje, kraują nušveičiant tiesiai į indą. Antrajame variante virkštelės kraujas buvo gaunamas aktyviai jį išspaudžiant MP1 švirkštu, po to praplaunant placentos venas ir vienu metu nuleidžiant kraują į indą (atviras metodas). Trečiajame variante kraujas buvo surenkamas pusiau atviroje sistemoje, aktyviai jį ištraukiant švirkštais ir praplaunant per bambos arteriją, vienu metu išspaudžiant į indą. Pirmajame variante autoriai gavo (76,4 + 32,1) ml virkštelės kraujo, kurio leukocitų kiekis buvo (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ 1 ml kraujo. Antrajame variante atitinkami rodikliai buvo (174,4 + 42,8) ml ir (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ /ml; trečiajame - (173,7+41,3) ml ir (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Dažniausia virkštelės kraujo mėginių infekcija pastebėta naudojant atvirą sistemą. Nustatyta tiesioginė koreliacija tarp placentos masės ir ištraukto kraujo tūrio - didėjant placentos masei, didėja surinkto kraujo kiekis.

Paėmus virkštelės kraują, atliekamas atskyrimo etapas – mononuklearinių ląstelių išskyrimas ir ląstelių suspensijos išgryninimas iš eritrocitų. Eksperimentinėmis sąlygomis branduolinės ląstelės išskiriamos sedimentacijos būdu su metilceliulioze, eritrocitus lizuojant amonio chloridu. Tačiau metilceliuliozė neturėtų būti naudojama klinikiniais tikslais, nes kraujodaros kamieninių ląstelių nuostoliai joje siekia 50–90 %. Eritrocitų lizė klinikoje taip pat beveik niekada neatliekama dėl didelių darbinio tirpalo tūrių, nors branduolinių ląstelių su CD34+ fenotipu, taip pat progenitorinių ląstelių su CFU-GM ir CFU-GEMM funkcijomis išskyrimo procentas tokiu būdu yra žymiai didesnis. Pranešama apie naują būdą mononuklearinėms ląstelėms išskirti tankio gradiente – buiantų tankio tirpale (BDS72). Ši medžiaga pasižymi šiais fiziologiniais parametrais: pH - 7,4, osmoliališkumas - 280 mOsm/kg, tankis - 1,0720 g/ml. Autorių teigimu, juo galima išskirti iki 100 % CD34 teigiamų ląstelių ir pašalinti 98 % eritrocitų. Tačiau BDS72 klinikoje dar nenaudojamas.

Patvirtintuose branduolinių ląstelių išskyrimo iš virkštelės kraujo metoduose paprastai naudojamas 10 % hidroksietilkrakmolo tirpalas arba 3 % želatinos tirpalas. Eritrocitų nusėdimo ir branduolinių ląstelių išskyrimo efektyvumas abiem atvejais yra maždaug vienodas. Tačiau, kai želatina naudojama kaip sedimentacijos medžiaga, galima gauti šiek tiek didesnį KSV-GM kiekį nei naudojant hidroksietilkrakmolą. Daroma prielaida, kad KSV-GM išskyrimo efektyvumo skirtumai atsiranda dėl skirtingo atskirų branduolinių ląstelių frakcijų sedimentacijos greičio arba hidroksietilkrakmolo molekulių gebėjimo absorbuotis ant kraujodaros ląstelių receptorių paviršiaus ir tokiu būdu blokuoti jų jautrumą kolonijas stimuliuojantiems faktoriams, naudojamiems auginant KSV-GM in vitro. Nepaisant to, abu sedimentatoriai gali būti tinkami branduolinėms ląstelėms išskirti kuriant didelio masto virkštelės kraujo bankus.

Virkštelės kraujo atskyrimo ir kriokonservavimo metodai iš esmės nesiskiria nuo tų, kurie naudojami dirbant su suaugusių donorų periferinio kraujo ir kaulų čiulpų kraujodaros kamieninėmis ląstelėmis. Tačiau ruošiant didelį kiekį virkštelės kraujo mėginių savo bankams, atskyrimo metodai, visų pirma, turi būti nebrangūs. Todėl, deja, šiuo metu klinikiniams poreikiams naudojami jau išbandyti įprasti virkštelės kraujo ląstelių išskyrimo ir kriokonservavimo metodai, o efektyvesni, bet brangesni metodai lieka eksperimentuotojų likimui.

Apskritai patvirtinti hematopoetinių ląstelių skaičiaus įvertinimo kriterijai ir virkštelės kraujo mėginių tyrimo reikalavimai infekcinių agentų nustatymui. Siekiant užtikrinti virkštelės kraujo hematopoetinių ląstelių transplantacijos saugumą, visi kraujo mėginiai pirmiausia turi būti tiriami dėl hematogeniniu būdu plintančių infekcijų ir genetinių ligų. Nemažai autorių rekomenduoja papildomus specialius virkštelės kraujo tyrimo metodus, skirtus diagnozuoti genetines ligas, tokias kaip a-talasemija, pjautuvinė anemija, adenozino deaminazės trūkumas, Brutono agamaglobulinemija, Hurlerio ir Ponterio ligos.

Remiantis L. Ticheli ir bendraautorių (1998) rekomendacijomis, kiekvienas virkštelės kraujo mėginys turi būti ištirtas dėl branduolinių ląstelių, CD34 teigiamų ląstelių ir CFU-GM, turi būti atliktas HLA tipavimas ir nustatyta kraujo grupė pagal ABO ir jo Rh faktorių. Be to, turi būti atliktas bakteriologinis pasėlis, serologiniai ŽIV ir citomegaloviruso infekcijos, HBsAg, virusinio hepatito C, HTLY-I ir HTLV-II (žmogaus T ląstelių leukemijos), sifilio ir toksoplazmozės tyrimai. Privaloma atlikti polimerazės grandininę reakciją citomegaloviruso ir ŽIV infekcijai nustatyti.

Virkštelės kraujo paėmimo procedūra turi būti atliekama griežtai laikantis medicininės bioetikos principų. Prieš kraujo paėmimą būtina gauti nėščiosios sutikimą. Preliminarų pokalbį su nėščiąja moterimi, siekiant gauti informuotą sutikimą dėl visų manipuliacijų, pradedant kraujo paėmimu ir baigiant dokumentų pildymu, atlieka tik medicinos darbuotojai. Jokiu būdu neleidžiama, kad šias procedūras atliktų personalas, turintis biologinį, cheminį, farmacinį ar kitą nemedicininį išsilavinimą, nes tai pažeidžia nustatytas bioetikos ir žmogaus teisių normas. Esant teigiamiems HBsAg nešiojimo testams, antikūnų prieš hepatito C, ŽIV infekcijos ir sifilio sukėlėjus buvimui, virkštelės kraujas nėra surenkamas, o jau surinkto kraujo mėginiai atmetami ir sunaikinami. Reikėtų pažymėti, kad latentinių infekcijų nešiojimas naujagimiams yra daug retesnis nei suaugusiesiems, todėl hematogeninio perdavimo ir infekcinių komplikacijų išsivystymo tikimybė virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių infuzijos metu yra žymiai mažesnė nei naudojant suaugusiojo donoro kaulų čiulpus transplantacijai.

Svarbus virkštelės kraujo klinikinio panaudojimo aspektas yra transplantacijos įvertinimas, kuris pagrįstas kraujodaros kamieninių ląstelių kiekio virkštelės kraujo mėginyje ir transplantacijai reikalingų ląstelių dozių nustatymu. Šiuo metu dar nėra sukurti optimalaus virkštelės kraujo ląstelių kiekio, reikalingo transplantacijai, standartai. Nėra visuotinai priimto požiūrio net į tokius įprastus parametrus kaip CD34 teigiamų ląstelių skaičius ir CFU-GM. Kai kurie autoriai vertina kraujodaros ląstelių potencialą analizuodami ilgalaikes kultūras, nustatydami kolonijas sudarančių vienetų, bendrų granulocitams, eritrocitams, monocitams ir megakariocitams – CFU-GEMM – kiekį.

Tačiau klinikinėje aplinkoje standartinis virkštelės kraujo transplantacijos įvertinimas paprastai apima tik branduolinių arba mononuklearinių ląstelių skaičiaus nustatymą.

Virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių saugojimas

Taip pat yra tam tikrų problemų, susijusių su virkštelės kraujo hematopoetinių ląstelių saugojimo technologija. Kriogeniškai užšaldant kraujo kamienines ląsteles, norint pasiekti optimalų užšaldymo režimą, būtina kiek įmanoma sumažinti virkštelės kraujo tūrį, taip pat iš anksto pašalinti eritrocitus, kad būtų išvengta hemolizės ir nesuderinamumo reakcijos su eritrocitų antigenais (ABO, Rh) rizikos. Šiems tikslams tinka įvairūs branduolinių ląstelių išskyrimo metodai. Praėjusio amžiaus dešimtojo dešimtmečio pradžioje plačiausiai naudojamas metodas buvo branduolinių ląstelių išskyrimas tankio gradiente, pagrįstame Ficoll, kurio tankis yra 1,077 g/ml, arba Percoll, kurio tankis yra 1,080 g/ml. Virkštelės kraujo atskyrimas tankio gradiente leidžia išskirti daugiausia mononuklearines ląsteles, tačiau lemia didelius kraujodaros kamieninių ląstelių nuostolius – iki 30–50%.

Hidroksietilkrakmolo sedimentacijos efektyvumas virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių izoliavimo procese vertinamas skirtingai. Kai kurie autoriai atkreipia dėmesį į prastą atskyrimo kokybę naudojant šį metodą, o kiti tyrėjai, priešingai, iš visų galimų metodų teikia pirmenybę virkštelės kraujo HSC išskyrimui naudojant 6% hidroksietilkrakmolo tirpalą. Tuo pačiu metu pabrėžiamas didelis kraujodaros ląstelių sedimentacijos efektyvumas, kuris, kai kuriais duomenimis, siekia nuo 84% iki 90%.

Kitokio požiūrio šalininkai mano, kad praktiškai visi frakcionavimo metodai yra susiję su dideliais branduolinių ląstelių nuostoliais, ir siūlo atskyrimą atlikti centrifuguojant, padalinant virkštelės kraują į 3 frakcijas: eritrocitus, leukocitų žiedą ir plazmą. Tokiu būdu išskyrę ląsteles, autoriai nustatė, kad mononuklearinių ląstelių, ankstyvųjų kraujodaros pirmtakų ląstelių ir ląstelių su CD34+ imunofenotipu kiekis galiausiai sudarė atitinkamai 90, 88 ir 100 % pradinio lygio. Panašias šiuo metodu išgrynintų virkštelės kraujo ląstelių padidėjimo vertes gavo ir kiti tyrėjai: po sedimentacijos buvo išskirta 92 % branduolinių ląstelių, 98 % mononuklearinių ląstelių, 96 % CD34 teigiamų ląstelių ir 106 % kolonijas formuojančių vienetų.

Dešimtojo dešimtmečio pabaigoje želatina buvo plačiai naudojama kaip sedimentacijos medžiaga. Klinikinėje praktikoje želatina kraujodaros kamieninėms ląstelėms iš virkštelės kraujo išskirti naudojama nuo 1994 m. Naudojant 3 % želatinos tirpalą, branduolinių ląstelių išskyrimo efektyvumas siekia 88–94 %. Didelio masto želatinos naudojimas kuriant virkštelės kraujo banką patvirtino jos pranašumus, palyginti su kitais sedimentacijos produktais. Lyginamoji visų aukščiau paminėtų branduolinių ląstelių išskyrimo metodų efektyvumo analizė, kai jie nuosekliai naudojami kiekviename iš tirtų virkštelės kraujo mėginių, parodė, kad 3 % želatinos tirpalas yra optimalus sedimentacijos produktas, atsižvelgiant į mononuklearinių ląstelių su CD34+/CD45+ fenotipu išeigą, taip pat į CFU-GM ir CFU-GEMM skaičių. Metodai, naudojant Ficoll tankio gradientą, taip pat hidroksietilkrakmolą ir metilceliuliozę, buvo žymiai mažiau veiksmingi, o kraujodaros ląstelių nuostoliai siekė 60 %.

Virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijos apimčių plėtra susijusi ne tik su jų įsigijimo metodų kūrimu, bet ir su saugojimu. Yra daug problemų, tiesiogiai susijusių su virkštelės kraujo paruošimu ilgalaikiam saugojimui ir optimalios jo mėginių kriokonservavimo technologijos pasirinkimu. Tarp jų yra atskyrimo procedūrų atlikimo, įvairių kriokonservavimo terpių naudojimo ir atšildytų ląstelių paruošimo transplantacijai metodų taikymo klausimai. Natūralių virkštelės kraujo mėginių transportavimas dažnai atliekamas iš regionų, nutolusių nuo hematologijos centrų. Šiuo atžvilgiu iškyla priimtino virkštelės kraujo laikymo laikotarpio nuo jo įsigijimo iki kriokonservavimo pradžios problema, kuri yra ypač svarbi kuriant virkštelės kraujo bankus.

Tyrimas, kurio metu buvo tiriamas virkštelės kraujodaros ląstelių funkcinis aktyvumas po ilgalaikio (iki 12 metų) laikymo skystame azote, parodė, kad apie 95 % kraujodaros ląstelių per šį laikotarpį nepraranda didelio proliferacinio pajėgumo. S. Yurasovo ir bendraautorių darbe (1997) buvo įrodyta, kad virkštelės kraujo laikymas kambario temperatūroje (22 °C) arba 4 °C temperatūroje 24 ir 48 valandas reikšmingai nesumažina kraujodaros ląstelių gyvybingumo, kuris sudaro atitinkamai 92 ir 88 % pradinio lygio. Tačiau, jei laikymo laikotarpis pailginamas iki trijų dienų, gyvybingų branduolinių ląstelių skaičius virkštelės kraujyje reikšmingai sumažėja. Tuo pačiu metu kiti tyrimai parodė, kad laikant 2–3 dienas 22 arba 4 °C temperatūroje, pirmiausia nukenčia subrendusių granulocitų, o ne kraujodaros ląstelių gyvybingumas.

Virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių gyvybingumą gali neigiamai paveikti virkštelės kraujo surinkimo sistemų komponentai. Įvairių antikoaguliantų, kurių veikimo mechanizmas yra susijęs su kalcio jonų prisijungimu (ACD, EDTA, XAPD-1), poveikio kraujodaros progenitorinėms ląstelėms analizė virkštelės kraujo laikymo sąlygomis 24–72 valandas atskleidė jų neigiamą poveikį branduolinių ląstelių gyvybingumui. Šiuo atžvilgiu autoriai rekomenduoja naudoti PBS (fosfato buferinį tirpalą) su natūralaus heparino be konservanto, kurio koncentracija yra 20 U/ml, o tai, jų nuomone, leidžia padidinti nefrakcionuoto virkštelės kraujo laikymo laiką iki 72 valandų ir išsaugo kolonijas formuojančių vienetų funkcinį aktyvumą. Tačiau CFU-GM ir CFU-G saugumo tyrimas parodė, kad virkštelės kraujo laikymo laikas prieš kriokonservavimą neturėtų viršyti devynių valandų. Akivaizdu, kad šiuo atveju turėtų būti taikomas principas, jog esant prieštaringiems duomenims, reikėtų taikyti minimalų rekomenduojamą virkštelės kraujo laikymo laikotarpį ir kuo greičiau pradėti programuojamą izoliuotų ląstelių užšaldymą.

Šaldant virkštelės kraujo kraujodaros kamienines ląsteles, kaip krioprotektantas paprastai naudojamas 10 % DMSO tirpalas. Tačiau be ryškaus krioprotekcinio poveikio, tokios koncentracijos dimetilsulfoksidas turi ir tiesioginį citotoksinį poveikį, net ir minimaliai sąlytyje su virkštelės kraujo kraujodaros ląstelėmis. Siekiant sumažinti DMSO citotoksinį poveikį, naudojama nulinio poveikio temperatūra, padidinamas visų manipuliacijų greitis ir atliekamas daugkartinis plovimas po virkštelės kraujo mėginių atšildymo.

Nuo 1995 m. Ukrainos medicinos mokslų akademijos Hematologijos ir transfuziologijos institutas plėtoja mokslinę kryptį, skirtą išsamiam virkštelės kraujo, kaip alternatyvaus kraujodaros kamieninių ląstelių šaltinio, tyrimui. Visų pirma, buvo sukurtos naujos technologijos, skirtos nefrakcionuoto ir frakcionuoto virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių kriokonservavimui žemoje temperatūroje. Kaip krioprotektantas naudojamas mažos molekulinės masės medicininis polivinilpirolidonas. Nefrakcionuoto virkštelės kraujo kriokonservavimo metodas pagrįstas originalia ląstelių išankstinio paruošimo šaldymui technologija ir specialiu ląstelių suspensijos apdorojimo prieš pat transplantaciją metodu.

Vienas iš svarbiausių veiksnių, turinčių įtakos kriokonservuotų kraujodaros kamieninių ląstelių funkcinio aktyvumo lygiui, yra ląstelių suspensijos aušinimo greitis, ypač kristalizacijos fazės metu. Programinės įrangos taikymas šaldymo greičio ir laiko problemai spręsti suteikia puikias galimybes sukurti paprastus ir labai efektyvius kriokonservavimo metodus, neplaunant ląstelių suspensijos iš krioprotektorių prieš transplantaciją.

Pavojingiausi ląstelių gyvybingumui jų paruošimo metu yra tiesioginio užšaldymo ir atšildymo etapai. Užšaldant kraujodaros ląsteles, nemaža jų dalis gali būti sunaikinta tarpląstelinės terpės perėjimo iš skystos į kietą fazę – kristalizacijos – momentu. Ląstelių žūties procentui sumažinti naudojami krioprotektoriai, kurių veikimo mechanizmai ir krioapsauginis efektyvumas yra pakankamai aprašyti mokslinėje literatūroje.

Perspektyvi kaulų čiulpų ir virkštelės kraujo ląstelių kriokonservavimo metodų optimizavimo kryptis yra kelių krioprotektorių, turinčių skirtingus veikimo mechanizmus, mažų koncentracijų derinys viename tirpale, pavyzdžiui, DMSO, veikiantis ląstelės viduje, ir hidroksietilkrakmolo arba albumino, kurie turi tarpląstelinį apsauginį poveikį.

Virkštelės kraujo ląstelių kriokonservavimui tradiciškai naudojamas 20 % DMSO tirpalas, kuris lėtai pilamas į ląstelių suspensiją nuolat mechaniškai maišant ledo vonelėje, kol pasiekiamas vienodas (1:1) krioprotektanto ir ląstelių suspensijos tūrių santykis. Galutinė dimetilsulfoksido koncentracija yra 10 %. Tada ląstelių suspensija programuojamame kriogeniniame įrenginyje GS/min greičiu aušinama iki -40 °C, po to aušinimo greitis padidinamas iki 10 °C/min. Pasiekus -100 °C, indas su ląstelių suspensija dedamas į skystą azotą (-196 °C). Taikant šią kriokonservavimo techniką, funkciškai aktyvių mononuklearinių ląstelių išsaugojimas po atšildymo pasiekia 85 % pradinio lygio.

Kriokonservavimo metodų modifikacijos skirtos sumažinti DMSO koncentraciją pridedant hidroksietilkrakmolo (galutinės dimetilsulfoksido ir hidroksietilkrakmolo koncentracijos yra atitinkamai 5 ir 6 %). Didelis tokio krioprotektorių derinio efektyvumas stebimas užšaldant mieloidinių ląstelių suspensiją, o citoprotekcija yra ne mažesnė nei naudojant tik 10 % dimetilsulfoksido tirpalą. Gyvybingų branduolinių ląstelių skaičius pasiekė 96,7 % pradinio lygio, o jų funkcinis aktyvumas, įvertintas CFU-GM skaičiumi, buvo 81,8 %.

Naudojant 5–10 % koncentracijos dimetilsulfoksido tirpalą kartu su 4 % hidroksietilkrakmolo (galutinė koncentracija), nustatyta, kad CD34 teigiamų ląstelių saugumas tokiuose dimetilsulfoksido diapazonuose praktiškai nepakito. Tuo pačiu metu, kai dimetilsulfoksido koncentracija sumažėja nuo 5 iki 2,5 %, stebima masinė virkštelės kraujo ląstelių žūtis – gyvybingų ląstelių vienetų skaičius sumažėja nuo 85,4 iki 12,2 %. Kiti autoriai taip pat priėjo prie išvados, kad būtent 5 ir 10 % dimetilsulfoksido tirpalai (autoriaus versijoje – kartu su autologiniu serumu) užtikrina maksimalią citoprotekciją kriokonservuojant virkštelės kraujo HSC. Be to, 5 arba 10 % dimetilsulfoksido ir 4 % hidroksietilkrakmolo tirpalo derinys, ypač kontroliuojant aušinimo greitį GS/min, pasižymi dideliu nuosekliai užšaldytų ir atšildytų ląstelių išsaugojimu. Kitame tyrime buvo naudojamas krioprotekcinis tirpalas, sudarytas iš trijų ingredientų – DMSO, išgryninto žmogaus albumino ir RPMI terpės santykiu 1:4:5, kuris buvo įpiltas į ląstelių suspensiją vienodu tūrio santykiu (galutinė dimetilsulfoksido koncentracija buvo 5%). Atšildžius vandens vonioje +4 GS temperatūroje, CFU-GM išlikimas viršijo 94%.

Kai kurie autoriai siūlo kriokonservavimui naudoti nefrakcionuotą virkštelės kraują, nes raudonųjų kraujo kūnelių pašalinimo proceso metu prarandama daug kraujodaros ląstelių. Šiame variante mononuklearinėms ląstelėms apsaugoti nuo žalingo kriokristalizacijos poveikio naudojamas 10 % dimetilsulfoksido tirpalas. Užšaldymas atliekamas pastoviu GS/min. aušinimo greičiu iki -80 °C, po to virkštelės kraujo ląstelių suspensija nuleidžiama į skystą azotą. Taikant šį užšaldymo metodą, raudonieji kraujo kūneliai iš dalies lizuojami, todėl kraujo mėginių nereikia frakcionuoti. Atšildžius ląstelių suspensija nuplaunama nuo laisvo hemoglobino ir dimetilsulfoksido žmogaus albumino tirpale arba paciento autologiniame kraujo serume ir naudojama transplantacijai.

Atšildžius nefrakcionuotą virkštelės kraują, kraujodaros progenitorinių ląstelių išsilaikymas iš tiesų yra didesnis nei frakcionuoto virkštelės kraujo, tačiau dėl kai kurių eritrocitų kriostabilumo gali kilti rimtų problemų po transfuzijos dėl ABO nesuderinamų eritrocitų perpylimo. Be to, žymiai padidėja saugomo nefrakcionuoto kraujo tūris. Klinikiniu požiūriu vis dar pageidautinas anksčiau išskirtų ir iš kitų ląstelių frakcijų išgrynintų virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių kriokonservavimas.

Visų pirma, buvo sukurtas frakcionuotų virkštelės kraujo ląstelių kriokonservavimo metodas, leidžiantis pašalinti eritrocitus paruošimo užšaldymui etape, kuriame 6% hidroksietilkrakmolo tirpalas naudojamas kaip plazmą pakeičiančio tirpalo „Stabizol“ dalis. Atšildžius tokiu būdu gauta ląstelių suspensija yra paruošta klinikiniam naudojimui be papildomų manipuliacijų.

Taigi, šiuo metu yra daug gana veiksmingų virkštelės kraujo kriokonservavimo metodų. Jų esminis skirtumas yra tas, kad kraujo mėginiai užšaldomi nefrakcionuoti arba paruošimo etape atskiriami į ląstelių frakcijas ir paruošiamos branduolines ląsteles be eritrocitų priemaišų.

Virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacija

Devintojo dešimtmečio pabaigoje ir dešimtojo dešimtmečio pradžioje buvo nustatyta, kad virkštelės kraujyje, kuris nėštumo metu palaiko vaisiaus gyvybę, yra daug kraujodaros kamieninių ląstelių. Santykinis virkštelės kraujo ląstelių gavimo paprastumas ir akivaizdžių etinių problemų nebuvimas prisidėjo prie virkštelės kraujo kamieninių ląstelių panaudojimo praktinėje medicinoje. Pirmoji sėkminga virkštelės kraujo transplantacija vaikui, sergančiam Fanconi anemija, buvo atspirties taškas didinant virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijų apimtį ir kuriant jų banko sistemą. Pasaulinėje virkštelės kraujo bankų sistemoje didžiausias yra Niujorko placentos kraujo centras, esantis JAV Nacionalinio sveikatos instituto balanse. Šiame banke saugomų virkštelės kraujo mėginių skaičius artėja prie 20 000. Taip pat auga recipientų (daugiausia vaikų), kuriems sėkmingai atlikta transplantacija, skaičius. Pasak JAV Sveikatos departamento, virkštelės kraujo transplantacijos recipientų gyvenimo po transplantacijos laikotarpis be recidyvų jau viršija 10 metų.

Tai nestebina, nes daugybė virkštelės kraujo hematopoetinio potencialo tyrimų parodė, kad pagal ankstyviausių kamieninių ląstelių kiekį ir kokybę jos ne tik nenusileidžia suaugusiojo kaulų čiulpams, bet kai kuriais atžvilgiais jas ir lenkia. Didesnis virkštelės kraujo kamieninių ląstelių proliferacinis potencialas atsiranda dėl ontogenetinių ląstelių signalizacijos ypatybių, specifinių augimo faktorių receptorių buvimo HSC, virkštelės kraujo ląstelių gebėjimo autokriniškai gaminti augimo faktorius bei didelio telomerų dydžio ir ilgio.

Taigi, virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių genominės ir fenotipinės savybės lemia aukštos kokybės transplantato prigijimą ir didelį donoro hematopoezės atkūrimo potencialą recipiento organizme.

Virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių nauda

Tarp realių virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių naudojimo transplantacijai pranašumų, palyginti su kitais kraujodaros ląstelių šaltiniais, verta paminėti praktiškai nulinę riziką donoro sveikatai (jei neskaičiuosime placentos) ir bendrosios anestezijos nebuvimą. Virkštelės kraujo naudojimas išplečia ląstelių transplantacijos galimybes dėl iš dalies HLA suderinamų transplantacijų (nesuderinamumas nuo vieno iki trijų antigenų). Sukurtas ilgalaikio virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių saugojimo užšaldytoje būsenoje metodas, kuris padidina retų HLA tipų gavimo tikimybę ir sutrumpina laiką, reikalingą HLA suderinamos transplantacijos paieškai alogeninei transplantacijai. Tuo pačiu metu žymiai sumažėja tam tikrų latentinių infekcijų, perduodamų užkrečiamuoju būdu, išsivystymo rizika. Be to, atsiranda nebrangi biologinio gyvybės draudimo forma dėl galimybės naudoti virkštelės kraujo ląsteles autologinei transplantacijai.

Tačiau dėl mažo kraujo kiekio, kurį galima surinkti iš placentos (vidutiniškai ne daugiau kaip 100 ml), iškyla problema, kaip gauti kuo didesnį kraujo kiekį iš virkštelės venos, griežtai laikantis minimalios gautų virkštelės kraujo mėginių bakterinio užteršimo rizikos sąlygos.

Primityvios virkštelės kraujo hematopoetinės ląstelės paprastai identifikuojamos pagal CD34 glikofosfoproteino buvimą jų paviršiuje, taip pat remiantis jų funkcinėmis savybėmis, tiriant klonogeniškumą arba kolonijų formavimąsi in vitro. Lyginamoji analizė parodė, kad virkštelės kraujyje ir kaulų čiulpuose didžiausias CD34 teigiamų ląstelių kiekis mononuklearinėje frakcijoje yra atitinkamai 1,6 ir 5,0 %, didžiausias kolonijas formuojančių vienetų lygis CD34+ ląstelių subpopuliacijoje yra 80 ir 25 %, bendras CD34+ ląstelių klonavimo efektyvumas yra 88 ir 58 %, didžiausias kolonijas formuojančių ląstelių, turinčių didelį proliferacijos potencialą (HPP-CFC CD34+ populiacijoje), kiekis yra 50 ir 6,5 %. Reikėtų pridurti, kad CD34+CD38 ląstelių klonavimo efektyvumas ir gebėjimas reaguoti į citokinų stimuliaciją taip pat yra didesni virkštelės kraujo hematopoetinėse kamieninėse ląstelėse.

Fenotipinių antigenų Thy-1, CD34 ir CD45RA derinys patvirtina virkštelės kraujo hematopoetinių ląstelių didelį proliferacinį potencialą, o šių trijų antigenų raiška virkštelės kraujo ląstelių paviršiuje rodo jų priklausymą kamieninėms ląstelėms. Be to, nustatyta, kad virkštelės kraujyje yra ląstelių su CD34+ fenotipu, kurios neturi linijinės diferenciacijos žymenų. Ląstelių subpopuliacijų su fenotipiniu profiliu CD34+/Lin lygis virkštelės kraujyje sudaro apie 1% viso CD34 teigiamų ląstelių skaičiaus. Virkštelės kraujo hematopoetinės kamieninės ląstelės sukelia tiek limfoidinių ląstelių liniją, tiek pluripotentinę mieloidinę linijinės ląstelių diferenciacijos seriją, o tai taip pat rodo jų priklausymą kamieninėms ląstelėms.

Kaip jau minėta, reikšmingi kaulų čiulpų ir virkštelės kraujo skirtumai yra hematopoetinių ląstelių, gautų transplantacijai per vieną surinkimo procedūrą, kiekis. Jei kaulų čiulpų transplantacijos metu ląstelių masės praradimas atskyrimo, kriokonservavimo, atšildymo ir tyrimo metu yra priimtinas 40–50 % ribose, tai virkštelės kraujo atveju tokie ląstelių praradimai yra labai reikšmingi, nes jei naudojamas nepakankamas HSC kiekis, transplantacija gali būti neefektyvi. Pasak G. Kogler ir kt. (1998), ląstelių transplantacijai, kai recipiento kūno svoris yra 10 kg, visi virkštelės kraujo mėginiai gali būti potencialios transplantacijos (bendras surinktų virkštelės kraujo mėginių skaičius yra 2098), kai kūno svoris yra 35 kg – 67 %, o tik 25 % mėginių gali užtikrinti veiksmingą transplantaciją pacientams, kurių kūno svoris yra 50–70 kg. Ši klinikinė situacija rodo, kad reikia optimizuoti ir gerinti esamų virkštelės kraujo ląstelių surinkimo, dauginimo ir saugojimo metodų efektyvumą. Todėl literatūroje šiuo metu plačiai aptariami virkštelės kraujo surinkimo, tyrimo, atskyrimo ir kriokonservavimo metodų standartizavimo klausimai, siekiant sukurti kraujo bankus, jo naudojimas klinikoje, taip pat nustatomos virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių laikymo sąlygos ir terminai.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Virkštelės kraujo hematopoetinių kamieninių ląstelių panaudojimas medicinoje

^{Paprastai iš virkštelės kraujo pavyksta išskirti iki 106} kraujodaros kamieninių ląstelių, retai – daugiau. Šiuo atžvilgiu klausimas, ar toks kraujodaros ląstelių kiekis iš virkštelės kraujo yra pakankamas kraujodarai atkurti suaugusiam recipientui, lieka atviras iki šiol. Nuomonės šiuo klausimu yra skirtingos. Kai kurie tyrėjai mano, kad toks kiekis yra visiškai pakankamas transplantacijai vaikams, bet per mažas transplantacijai suaugusiam žmogui, kuriam optimalus kiekis yra (7-10) x 106 CD34 teigiamų ląstelių įvedimas ¹ kg kūno svorio – vidutiniškai 7 x 108 ^vienai transplantacijai. Iš šių skaičiavimų išplaukia, kad viename virkštelės kraujo mėginyje yra 700 kartų mažiau kraujodaros kamieninių ląstelių nei reikia vienai transplantacijai suaugusiam pacientui. Tačiau toks kiekybinis įvertinimas atliekamas pagal analogiją su perpiltų kaulų čiulpų ląstelių skaičiumi ir visiškai neatsižvelgia į kraujodaros ontogenetines ypatybes.

Visų pirma, ignoruojamas faktas, kad virkštelės kraujo hematopoetinės kamieninės ląstelės turi didesnį proliferacinį potencialą, palyginti su kaulų čiulpų hematopoetinėmis progenitorinėmis ląstelėmis. In vitro kolonijas formuojančio potencialo tyrimų rezultatai rodo, kad viena virkštelės kraujo dozė gali atkurti suaugusio recipiento hematopoezę. Kita vertus, nereikėtų pamiršti, kad virkštelės kraujo kamieninių ląstelių skaičius mažėja net embriono vystymosi metu: CD34 teigiamų ląstelių kiekis virkštelės kraujyje tiesiškai sumažėja 5 kartus nuo 20 nėštumo savaitės (kraujas tyrimui buvo gautas priešlaikinio nėštumo nutraukimo metu) iki 40 nėštumo savaitės (fiziologinio gimdymo laikotarpis), o tai lydi lygiagrečiai, nuolat didėjanti linijinių citodiferenciacijos žymenų raiška.

Kadangi nėra standartizuoto metodo kiekybiniam virkštelės kraujo mėginiuose esančių progenitorinių ląstelių nustatymui, diskusijos dėl optimalios virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių dozės tęsiasi. Kai kurie tyrėjai mano, kad branduolinių ir mononuklearinių ląstelių skaičius, perskaičiuotas pagal recipiento kūno svorį, t. y. jų dozė, gali būti naudojamas kaip virkštelės kraujo mėginių atrankos kriterijus. Kai kurie autoriai mano, kad minimali CD34+ ląstelių kiekybinė riba net ir HSC autotransplantacijai yra 2 x 106 ^/ kg. Tuo pačiu metu, padidinus kraujodaros ląstelių dozę iki 5 x 106 ^ląstelių /kg (tik 2,5 karto), jau užtikrinama palankesnė ankstyvojo potransplantacinio laikotarpio eiga, sumažėja infekcinių komplikacijų dažnis ir sutrumpėja profilaktinio antibiotikų gydymo trukmė.

Pasak E. Gluckman ir kt. (1998), onkohematologijoje sėkmingos virkštelės kraujo ląstelių transplantacijos sąlyga yra bent 3,7 x 10 ⁷ branduolinių ląstelių 1 kg recipiento kūno svorio įvedimas. Kai kraujodaros kamieninių ląstelių dozė sumažinama iki 1 x 10 ⁷ ar mažiau branduolinių ląstelių 1 kg paciento kūno svorio, transplantacijos nesėkmės ir kraujo vėžio atsinaujinimo rizika smarkiai padidėja. Reikėtų pripažinti, kad minimalus kamieninių ląstelių skaičius, būtinas greitam kraujodaros atkūrimui po HSC alotransplantacijos, vis dar nežinomas. Teoriškai tai galima pasiekti naudojant vieną ląstelę, tačiau klinikinėje kaulų čiulpų transplantacijos praktikoje greitas ir stabilus prigijimas garantuojamas perpilant bent (1-3) x 10 ⁸ branduolinių ląstelių 1 kg paciento kūno svorio.

Neseniai atliktame išsamiame tyrime, kuriuo siekta nustatyti optimalų HSC skaičių onkohematologijoje, pacientai buvo stebimi trijose grupėse, paskirstytose pagal CD34 teigiamų ląstelių kiekį transplantuotoje medžiagoje. Pirmosios grupės pacientams buvo suleista (3–5) x 106 ^ląstelių /kg. Antrosios grupės pacientams HSC dozė buvo (5–10) x 106 ^ląstelių /kg, o trečiosios grupės pacientams buvo persodinta daugiau nei 10 x 106 ^CD34 + ląstelių/kg. Geriausi rezultatai gauti recipientų grupėje, kuriems atlikta transplantacija su (3–5) x 106 ląstelių/kg CD34+ ląstelių skaičiumi ^. Padidinus persodintų ląstelių dozę virš 5 x 106 ^/ kg, statistiškai reikšmingo pranašumo nenustatyta. Šiuo atveju labai didelis HSC kiekis transplantate (> 10 x 106 ^/ kg) yra susijęs su reikšmingo skaičiaus likusių naviko ląstelių reinfuzija, dėl kurios liga atsinaujina. Tiesioginis ryšys tarp persodintų alogeninių progenitorinių ląstelių skaičiaus ir transplantato prieš šeimininką reakcijos išsivystymo nenustatytas.

Sukaupta pasaulinė virkštelės kraujo transplantacijos patirtis patvirtina didelį jų repopuliacijos potencialą. Virkštelės kraujo transplantato prigijimo greitis koreliuoja su įvestų branduolinių ląstelių skaičiumi. Geriausi rezultatai stebimi transplantuojant 3 x 107 ^/ kg, o kaulų čiulpams ši dozė yra 2 x 108 ^/ kg. Koordinuojančių centrų duomenimis, 2000 m. pabaigoje visame pasaulyje buvo atlikta 1200 virkštelės kraujo ląstelių transplantacijų, daugiausia iš giminingų donorų (83%). Akivaizdu, kad virkštelės kraujas turėtų būti laikomas kaulų čiulpų alternatyva transplantacijai pacientams, sergantiems hemoblastoze.

Tuo pačiu metu, naujagimių virkštelės kraujodaros audinio šaltinio pobūdis įkvepia optimizmo dėl jos HSC funkcinių ypatybių. Tuo pačiu metu tik klinikinė patirtis gali atsakyti į klausimą, ar vieno virkštelės kraujo mėginio pakanka kraujodaros atkūrimui suaugusiam recipientui, sergančiam kraujodaros aplazija. Virkštelės kraujo ląstelių transplantacija naudojama daugelio navikinių ir navikinių ligų gydymo programose: leukemijos ir mielodisplazinių sindromų, ne Hodžkino limfomos ir neuroblastomos, aplazinės anemijos, įgimtų Fanconi ir Diamond-Blackfan anemijų, leukocitų adhezijos deficito, Barro sindromo, Guntherio ligos, Hurlerio sindromo, talasemijos.

Virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių transplantacijos imunologiniai aspektai nusipelno ypatingo dėmesio ir atskiro tyrimo. Įrodyta, kad virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijos iš donorų, kurių HLA suderinamumas yra nepilnas, atveju transplantacijos rezultatai yra gana patenkinami, o tai, anot autorių, rodo mažesnį virkštelės kraujo ląstelių imunoreaktyvumą nei kaulų čiulpų.

Išsamus virkštelės kraujo ląstelinės sudėties tyrimas atskleidė tiek imuninės sistemos efektorinių ląstelių fenotipinio spektro, tiek jų funkcinio aktyvumo ypatybes, kurios leido virkštelės kraują laikyti HSC šaltiniu, turinčiu santykinai mažą „transplantato prieš šeimininką“ reakcijos išsivystymo riziką. Tarp virkštelės kraujo imunokompetenčių ląstelių funkcinio nesubrendimo požymių būtina atkreipti dėmesį į citokinų gamybos disbalansą ir jautrumo citokinų reguliavimui imuniniame atsake sumažėjimą. Dėl to atsirandantis citotoksinių limfocitų aktyvumo slopinimas laikomas veiksniu, prisidedančiu prie imunologinės tolerancijos persodintam kraujodaros audiniui susidarymo. Virkštelės kraujo limfocitų populiacijoje, skirtingai nei suaugusių donorų periferiniame kraujyje ir kaulų čiulpuose, vyrauja neaktyvūs, nesubrendę limfocitai ir slopinamosios ląstelės. Tai rodo sumažėjusį virkštelės kraujo T limfocitų pasirengimą imuniniam atsakui. Svarbi virkštelės kraujo ląstelių monocitinės populiacijos savybė yra mažas funkciškai pilnaverčių ir aktyvių antigeną pateikiančių ląstelių kiekis.

Viena vertus, mažas imuninės sistemos efektorinių ląstelių brandumas virkštelės kraujyje išplečia jų naudojimo klinikoje indikacijas, nes šios savybės sumažina imuninio konflikto tarp donoro ir recipiento ląstelių intensyvumą. Tačiau, kita vertus, žinoma apie koreliaciją tarp „transplantato prieš šeimininką“ reakcijos išsivystymo laipsnio ir transplantacijos priešnavikinio poveikio, t. y. „transplantato prieš leukemiją“ poveikio, išsivystymo. Šiuo atžvilgiu buvo atliktas virkštelės kraujo ląstelių priešnavikinio citotoksiškumo tyrimas. Gauti rezultatai rodo, kad nepaisant išties susilpnėjusio imunokompetentinių virkštelės kraujo ląstelių atsako į antigeno stimuliaciją, pirmiausia aktyvuojami limfocitai yra natūralūs žudikai ir į žudikus panašios ląstelės, kurios aktyviai dalyvauja priešnavikinio citotoksiškumo įgyvendinimo mechanizmuose. Be to, virkštelės kraujyje buvo aptiktos limfocitų subpopuliacijos su CD16+CD56+ ir CD16"TCRa/p+ fenotipais. Manoma, kad šios ląstelės aktyvuotoje formoje įgyvendina „transplantato prieš leukemiją“ reakciją.

Ukrainos medicinos mokslų akademijos Onkologijos institute kriokonservuotos virkštelės kraujo kraujodaros ląstelės buvo skirtos vėžiu sergantiems pacientams, kuriems buvo nuolatinė kraujodaros hipoplazija dėl chemoterapijos ir radioterapijos. Tokiems pacientams virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacija gana efektyviai atkūrė slopinamą kraujodarą, ką rodo nuolatinis subrendusių susiformavusių elementų kiekio padidėjimas periferiniame kraujyje, taip pat ląstelinio ir humoralinio imuniteto būklę apibūdinančių rodiklių padidėjimas. Repopuliacijos efekto stabilumas po virkštelės kraujo kraujo kraujodaros ląstelių transplantacijos leidžia tęsti spindulinį gydymą ir chemoterapiją nenutraukiant gydymo kurso. Yra informacijos apie didesnį virkštelės kraujo kamieninių ląstelių alotransplantacijos efektyvumą onkohematologiniams pacientams: metinė naviko ligos atsinaujinimo rizika jas naudojant buvo 25%, palyginti su 40% pacientams, kuriems buvo persodinti alogeniniai kaulų čiulpai.

Kriokonservuotų virkštelės kraujo kamieninių ląstelių veikimo mechanizmas turėtų būti laikomas humoralinės recipiento hematopoezės stimuliacijos rezultatu, kurį sukelia unikalus naujagimių ląstelių gebėjimas autokriniškai gaminti hematopoetinius augimo faktorius, taip pat laikino donorinių ląstelių prigijimo pasekme (tai įrodo patikimas vaisiaus hemoglobino kiekio padidėjimas recipientų periferiniame kraujyje 7–15 dieną po transfuzijos, palyginti su pradiniais duomenimis). Po transfuzijos reakcijų nebuvimas virkštelės kraujo recipientams yra santykinio imunokompetenčių ląstelių tolerancijos rezultatas, taip pat pasitikėjimo kriterijus krioprezervuotos medžiagos biologiniam tinkamumui.

Virkštelės kraujo T limfocitų žudikės progenitorinės ląstelės gali būti aktyvuojamos veikiant egzogeniniams citokinams, o tai naudojama kuriant naujus ex vivo ir in vivo metodus, skirtus transplantuotų limfoidinių elementų priešnavikiniam citotoksiškumui sukelti vėlesnei imunoterapijai. Be to, virkštelės kraujo imunokompetentinių ląstelių genomo „nesubrendimas“ leidžia jas naudoti priešnavikiniam aktyvumui sustiprinti naudojant molekulinio modeliavimo metodus.

Šiandien virkštelės kraujas plačiai taikomas, pirmiausia vaikų hematologijoje. Vaikams, sergantiems ūmine leukemija, virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių alotransplantacija, palyginti su kaulų čiulpų alotransplantacija, žymiai sumažina transplantato prieš šeimininką ligos dažnį. Tačiau tai lydi ilgesnis neutrofilų ir trombocitopenijos laikotarpis ir, deja, didesnis 100 dienų po transplantacijos mirtingumas. Ilgesnis granulocitų ir trombocitų kiekio atsistatymo laikotarpis periferiniame kraujyje gali būti dėl nepakankamos atskirų CD34 teigiamų virkštelės kraujo ląstelių subpopuliacijų diferenciacijos, kurią rodo mažas radioaktyvaus rodamino absorbcijos lygis ir maža CD38 antigenų raiška jų paviršiuje.

Tuo pačiu metu, transplantuojant suaugusiems pacientams virkštelės kraujo kraujodaros kamienines ląsteles, nesant suderinamo negiminingo kaulų čiulpų donoro ir nesant galimybės mobilizuoti autologines HSC, pacientų grupėje iki 30 metų nustatytas didelis vienerių metų išgyvenamumas be recidyvų (73 %). Išplėtus recipientų amžiaus diapazoną (18–46 metai), išgyvenamumas sumažėjo iki 53 %.

Kiekybinė ląstelių, turinčių CD34+ fenotipą, analizė kaulų čiulpuose ir virkštelės kraujyje parodė didesnį (3,5 karto) jų kiekį kaulų čiulpuose, tačiau virkštelės kraujyje pastebėtas reikšmingas ląstelių, turinčių fenotipinį profilį CD34+HLA-DR, dominavimas. Yra žinoma, kad kraujo ląstelės su imunologiniais žymenimis CD34+HLA-DR proliferuoja aktyviau nei ląstelės, kurių imunofenotipas CD34+HLA-DR+, tai buvo patvirtinta eksperimentiniais ilgalaikės kraujodaros ląstelių kultūros augimo in vitro tyrimais. Primityvūs ląstelių pirmtakai su CD34+CD38 fenotipu yra ir virkštelės kraujyje, ir kaulų čiulpuose, tačiau virkštelės kraujo ląstelės su žymenų rinkiniu CD34+CD38 pasižymi didesniu klonogeniniu aktyvumu nei to paties fenotipo kraujodaros ląstelės, išskirtos iš suaugusių donorų kaulų čiulpų. Be to, virkštelės kraujo ląstelės, turinčios CD34+CD38 imunofenotipą, proliferuoja greičiau reaguodamos į citokinų stimuliaciją (IL-3, IL-6, G-CSF) ir ilgalaikėse kultūrose sudaro 7 kartus daugiau kolonijų nei kaulų čiulpų ląstelės.

Virkštelės kraujo kamieninių ląstelių bankai

Norint tinkamai plėtoti naują praktinės medicinos sritį – virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantaciją, taip pat įgyvendinti kaulų čiulpų kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijas, būtina turėti platų kraujo bankų tinklą, kuris jau sukurtas JAV ir Europoje. Vietinius virkštelės kraujo bankų tinklus vienija „Netcord Bank Association“. Tarptautinės virkštelės kraujo bankų asociacijos kūrimo tikslingumą lemia tai, kad norint atlikti nesusijusias transplantacijas, reikia daug sugrupuotų virkštelės kraujo mėginių, o tai leidžia pasirinkti HLA identišką donorą. Tik bankų sistemos, kurioje saugomi įvairių HLA tipų kraujo mėginiai, sukūrimas gali iš tikrųjų išspręsti reikiamo donoro paieškos problemą. Tokios virkštelės kraujo banko sistemos organizavimui reikalingas preliminarus etinių ir teisinių normų, kurios šiuo metu svarstomos tarptautiniu lygmeniu, parengimas.

Norint Ukrainoje įkurti virkštelės kraujo bankus, reikia parengti visą eilę taisyklių ir dokumentų.

Visų pirma, tai virkštelės kraujo surinkimo, frakcionavimo ir užšaldymo metodų standartizavimo klausimai. Būtina reglamentuoti virkštelės kraujo surinkimo gimdymo ligoninėse taisykles pagal medicinos etikos reikalavimus, nustatyti minimalų virkštelės kraujo tūrį, užtikrinantį sėkmingą transplantaciją. Būtina palyginti ir standartizuoti įvairius kraujodaros progenitorinių ląstelių kokybės ir kiekio vertinimo kriterijus, taip pat HLA tipavimo metodus ir genetinių bei infekcinių ligų, kurios gali būti perduodamos virkštelės kraujo ląstelių infuzijos metu, diagnostikos metodus, nustatyti bendrus sveikų donorų atrankos kriterijus. Taip pat verta aptarti atskirų serumo, ląstelių ir DNR, gautų iš virkštelės kraujo, saugyklų sukūrimo klausimus.

Būtina organizuoti virkštelės kraujo duomenų kompiuterinį tinklą, kuris būtų susietas su kaulų čiulpų donorų registrais. Siekiant toliau plėtoti ląstelių transplantologiją, būtina sukurti specialius protokolus, skirtus palyginti virkštelės kraujo ir kaulų čiulpų transplantacijos rezultatus iš HLA identiškų giminaičių ir nesusijusių donorų. Dokumentacijos standartizavimas, įskaitant informuotą tėvų sutikimą, taip pat motinos ar giminaičių pranešimą apie vaikui nustatytas genetines ir (arba) infekcines ligas, gali padėti išspręsti etines ir teisines virkštelės kraujo ląstelių klinikinio naudojimo problemas.

Lemiamoji ląstelių transplantologijos plėtros Ukrainoje sąlyga bus Nacionalinės kamieninių ląstelių donorystės programos priėmimas ir tarptautinio bendradarbiavimo su kitomis šalimis plėtra per Pasaulio čiulpų donorų asociaciją (WMDA), JAV Nacionalinę čiulpų donorų programą (NMDP) ir kitus registrus.

Apibendrinant vis dar trumpą virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijos istoriją, pastebime, kad pirmosios prielaidos apie virkštelės kraujo panaudojimo klinikoje galimybę, išsakytos dar aštuntojo dešimtmečio pradžioje, buvo patvirtintos devintajame dešimtmetyje atlikus eksperimentinius tyrimus su gyvūnais, o 1988 m. buvo atlikta pirmoji pasaulyje virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių transplantacija žmogui, po kurios pradėtas kurti pasaulinis virkštelės kraujo bankų tinklas. Per 10 metų pacientų, kuriems buvo persodintos virkštelės kraujo kraujodaros ląstelės, skaičius priartėjo prie 800. Tarp jų buvo pacientų, sergančių įvairiomis navikinėmis (leukemija, limfoma, solidiniai navikai) ir navikinėmis (įgimtais imunodeficitais, anemija, ligomis, susijusiomis su medžiagų apykaitos sutrikimais) ligomis.

Ankstyvųjų ir įsipareigojusių ląstelių pirmtakų kiekis virkštelės kraujyje yra didesnis nei suaugusiojo periferiniame kraujyje. Kalbant apie granulocitų-makrofagų kolonijas formuojančių vienetų skaičių ir jų proliferacinį potencialą, virkštelės kraujas žymiai viršija suaugusiųjų periferinį kraują net ir įvedus augimo faktorius. Ilgalaikėse ląstelių kultūrose in vitro pastebėtas didesnis virkštelės kraujo ląstelių proliferacinis aktyvumas ir gyvybingumas nei kaulų čiulpų ląstelėse. Svarbiausi virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijos momentai yra branduolinių ląstelių skaičius ir hematopoetinis potencialas, citomegalovirusinės infekcijos buvimas, donoro ir recipiento HLA suderinamumas, paciento kūno svoris ir amžius.

Vis dėlto virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacija turėtų būti laikoma alternatyva kaulų čiulpų transplantacijai gydant sunkias kraujo ligas, pirmiausia vaikams. Klinikinės virkštelės kraujo ląstelių transplantacijos problemos pamažu sprendžiamos – jau yra gana veiksmingų virkštelės kraujo ląstelių rinkimo, atskyrimo ir kriokonservavimo metodų, sudaromos sąlygos virkštelės kraujo bankams formuoti, tobulinami branduolinių ląstelių tyrimo metodai. Kuriant bankus didelio masto virkštelės kraujo kraujodaros kamieninių ląstelių įsigijimo metu optimaliais atskyrimo metodais turėtų būti laikomas 3 % želatinos tirpalas ir 6 % hidroksietilkrakmolo tirpalas.

P. Perekhrestenko ir bendraautoriai (2001) teisingai pažymi, kad virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacija turėtų užimti deramą vietą terapinių priemonių, skirtų įveikti įvairios genezės kraujodaros slopinimus, komplekse, nes virkštelės kraujo kamieninės ląstelės turi daug reikšmingų privalumų, tarp kurių svarbiausi yra santykinis jų gavimo paprastumas, donoro rizikos nebuvimas, mažas naujagimių ląstelių užterštumas virusais ir palyginti maža transplantacijos kaina. Kai kurie autoriai nurodo, kad virkštelės kraujo ląstelių transplantacija rečiau lydima komplikacijų, susijusių su transplantato prieš šeimininką reakcija, nei kaulų čiulpų ląstelių transplantacija, o tai, jų nuomone, lemia silpna HLA-DR antigenų raiška virkštelės kraujo ląstelėse ir jų nesubrendimas. Tačiau pagrindinė branduolinių ląstelių populiacija virkštelės kraujyje yra T limfocitai (CD3 teigiamos ląstelės), kurių kiekis sudaro apie 50 %, tai yra 20 % mažiau nei suaugusiojo periferiniame kraujyje, tačiau fenotipiniai skirtumai T ląstelių subpopuliacijose iš šių šaltinių yra nereikšmingi.

Tarp veiksnių, tiesiogiai įtakojančių virkštelės kraujo kamieninių ląstelių transplantacijos išgyvenamumą, verta atkreipti dėmesį į pacientų amžių (geriausi rezultatai stebimi recipientams nuo vienerių iki penkerių metų), ankstyvą ligos diagnozę ir leukemijos formą (ūminės leukemijos atveju veiksmingumas yra žymiai didesnis). Didelę reikšmę turi branduolinių virkštelės kraujo ląstelių dozė, taip pat jų HLA suderinamumas su recipientu. Neatsitiktinai virkštelės kraujo HSC transplantacijos klinikinio veiksmingumo analizė onkohematologijoje rodo, kad geriausi gydymo rezultatai pasiekiami naudojant giminingas transplantacijas: vienerių metų išgyvenamumas be recidyvo šiuo atveju siekia 63 %, o po giminingų transplantacijų – tik 29 %.

Taigi, didelis kamieninių ląstelių skaičius virkštelės kraujyje ir didelis naujagimių kraujodaros kamieninių ląstelių repopuliacijos pajėgumas leidžia jas naudoti alogeninei transplantacijai onkohematologiniams pacientams. Tačiau reikia pažymėti, kad kraujodaros atsistatymas po virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių transplantacijos yra „ištemptas laike“: neutrofilų kiekio periferiniame kraujyje atkūrimas paprastai stebimas iki 6 savaitės pabaigos, o trombocitopenija paprastai išnyksta po 6 mėnesių. Be to, virkštelės kraujo kraujodaros ląstelių nesubrendimas neatmeta imunologinių konfliktų: sunki ūminė ir lėtinė transplantato prieš šeimininką liga stebima atitinkamai 23 ir 25 % recipientų. Ūminės leukemijos recidyvas pirmųjų metų pabaigoje po virkštelės kraujo ląstelių transplantacijos pastebimas 26 % atvejų.

[ 10 ], [ 11 ]