Eksperimentiniai osteoartrito modeliai

Kremzliai yra labai specializuoti audiniai, kuriuose yra tik vieno tipo ląstelės (chondrocytai), būdingos kraujo ir limfinės kraujagyslių nebuvimas. Kremzlės mityba daugiausia atliekama absorbcijos iš sinovijos skysčio. Chondrocytų metabolizmą reguliuoja daugelis tirpių faktorių, kuriuos vietiniai sukelia chondrocytai ir aplinkiniai audiniai. Chondrocitų funkcija taip pat priklauso nuo ekstraląstelinės terpės (deguonies įtempio, jonų koncentracijos, pH ir kt.) Sudėties, VCM kompozicijos, ląstelių ir matricos sąveikos, fizinių signalų. Pagrindinis eksperimentinio modeliavimo uždavinys yra kultūrų kūrimas ekstraląstelinėje aplinkoje, nepakeičiant brandžių ląstelių fenotipo. Antrasis uždavinys yra sukurti kultūrą, skirtą ankstyvo, uždelsto, trumpalaikio ar ilgalaikio chondrocitų atsako į cheminius ir (arba) fizinius signalus tyrinėjimui. Tyrimai in vitro taip pat suteikia galimybę studijuoti chondrocitų elgesį osteoartritu. Trečioji užduotis yra bendros gydomosios sistemos kūrimas, leidžiantis tirti įvairių audinių sąveiką. Ketvirta užduotis yra kramtomųjų implantų paruošimas tolesnei transplantacijai. Ir pagaliau penktoji užduotis yra tyrinėti augimo faktorius, citokinus ar terapinius agentus, kurie gali stimuliuoti ir (arba) slopina kremzlės rezorbciją.

Per pastarąjį dešimtmetį, sukūrė įvairių modelių sąnarių kremzlės ląstelių kultūrų, tarp jų - monosluoksnių, sustabdytas kultūros, kultūros hondronov, eksplantuose, coculture, nemirtingas ląstelių kultūroje. Kiekviena kultūra turi savo privalumų ir trūkumų, ir kiekviena iš jų yra tinkama, norint ištirti vieną konkretų chondrocytų metabolizmo aspektą. Taigi, kremzliniai tyrinėjimai yra puikus pavyzdžių matricos elementų apykaitos tyrimas, kuris reikalauja tikrų ląstelių paviršiaus receptorių ir įprastos ląstelės matricos ir matricos-ląstelių sąveikos. Tuo pačiu metu, indukcijų matricoje arba chondrocytų metabolizmo reguliavimo mechanizmams rekomenduojama atlikti izoliuotų ląstelių kultūrą. Ląstelių diferencijavimo proceso tyrimui būtina monolitinė mažo tankio kultūra. Natūralioje arba sintetinėje matricoje suspenduotos kultūros yra modelis, skirtas analizuoti adaptyvų chondrocitų atsaką į mechaninį įtampą.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrocyte kultūros

Renkantis krešėjimo audinius in vitro tyrimams, reikia atsižvelgti į keletą svarbių dalykų. Chondrocitų matricos sudėtis ir metabolinis aktyvumas skiriasi įvairiose jungtyse, o pastarasis priklauso ir nuo audinio kontrakto gelmės. Šie duomenys buvo gauti keliais eksperimentais, kuriuose buvo tiriamos izoliuotos pogrupiai chondrocytams iš skirtingų gylių kremzlių zonų. Pasitaikė daug morfologinių ir biocheminių skirtumų tarp kultivuotų hondrocitų, esančių paviršiuje, ir giliųjų sąnarių kremzlių sluoksniuose. Paviršiaus ląstelės sintezuoja reti, išeikvotos proteoglikano fibrilinės matricos, o gilesnėse ląstelėse gaminama matrica, turinti daug fibrilų ir proteoglikanų. Be to, paviršiaus ląstelės gamina palyginti mažesnius nekonkretizuotus proteoglikanus ir hialurono rūgštį, o santykinai mažiau agregato ir keratano sulfato nei giliau išsidėstę chondrocytai. Kitas svarbus chondrocytų, išskirtų iš skirtingų gylyje esančių kremzlių zonų metabolizmas, skiriamasis bruožas yra atsakas į egzogeninį stimulą. Pasak M. Aydelotte ir jo bendraautorių, blauzdos chondrocytai iš kremzlės paviršiaus zonos buvo jautresni IL-1 nei giliosios zonos ląstelės.

Ląstelių elgesys taip pat priklauso nuo audinio vietos. Chondrocitai kremzlės ir ausų briaunų, paimti iš to paties gyvūno, kad skirtingai reaguoja į augimo faktorių, pavyzdžiui, fibroblastų augimo faktoriaus (FGF), ir TGF-beta. FAF padidėjo timidino, prolino ir leucinas į chondrocitai šonkaulio kultūros, bet ne ausies. TGF-P padidėjo timidino į kremzlės Chondrocitai pilvą ir ausų įtraukimą, tačiau tai neturi įtakos timidino poveikio į chondrocitų ir prolino ausies. Krešulių ląstelės, gaunamos iš zonų, turinčių didžiausią apkrovą, skiriasi nuo tų, kuriose yra mažai apkrova kremzlėse. Pavyzdžiui, brandus chondrocitai dydžio, mažesnio iš kelio sąnario nuo centrinės regione avių sąnario blauzdikaulio kaulo paviršiumi kremzlės neapima menisko, kuris perneša didžiausią apkrovą in vivo, mažesnio susintetintas aggrecan, decorin bet didesnį nei sričių, kurioms taikoma pagal menisko ląstelių. Autoriai taip pat pabrėžia, kad svarbu naudoti kremzlę iš vienodų jungčių zonų, tiriant sąnarių sintetinę funkciją.

Chondrocitų metabolizmą ir atsakas į reguliavimo veiksnių taip pat labai priklauso nuo donoro, jo skeletas ir bendrą sveikatos, kurių imtis ląstelių vystymąsi amžiaus. Žmonių chondrocitų metu pastebimas reikšmingas proliferacinio atsako sumažėjimas su amžiumi. Didžiausias sumažėjimas pastebimas 40-50 metų ir vyresnių kaip 60 metų donorų. Be to, proliferacinio atsako į augimo faktorius (pvz., FGF ir TGF-beta) sunkumas senėjant mažėja. Be kiekybinių chondrocitų paplitimo pokyčių, taip pat yra kokybinių pokyčių. Jaunesni donorų ląstelės (10-20 metų amžiaus) geriau reaguoja į trombocitų augimo faktorių (PDGF) nei TGF-beta, o suaugusių donorų ląstelėse yra priešinga. Norėdami paaiškinti nuo amžiaus priklausomus chondrocytų sintetinės funkcijos pokyčius ir jų atsaką į augimo faktorių poveikį, naudojami keli mechanizmai. Tarp jų, sumažinimas numeris ir giminingumo ląstelės paviršiaus receptoriaus, keičiant sintezę ir bioaktyvumas augimo faktoriais ir citokinais postreceptor modifikavimo signalus.

Patologinė sąnarių būklė taip pat keičia chondrocytų morfologiją ir metabolinį aktyvumą. Taigi, J. Kouri ir jo bendraautoriai (1996 m.) Nustatė tris hipoglikemijos subproduktus kremzlėje su osteoartritu. Chondrocytai iš viršutinės ir viršutinės kremzlės pusės sudaro klasterius ir sintezuoja daugiau proteoglikanų ir kolageno. TGF-beta ir į insuliną panašaus augimo faktoriaus I (IGF) gali stimuliuoti proteoglikanų sintezę chondrocitų ir iš dalies neutralizuoti IL-1 poveikį ir TNF-a. Kremzlės eksplantai serga osteoartrito, ir chondrocitų, išskirtų iš kremzlės pacientams, sergantiems osteoartritu, yra jautresni stimuliacija TGF-beta nei sveikų kremzlės chondrocitų. Šie skirtumai greičiausiai yra susiję su fenotipiniais chondrocytų pokyčiais sąnarių kremzlių viršutiniuose sluoksniuose.

Atskirų chondrocytų išskyrimas pasiekiamas nuosekliai gydant ECM proteolitinius fermentus. Išleidus ECM, izoliuotos ląstelės idealiai tinka tirti de novo matricos komponentų sintezę . Kai kurie autoriai naudoja tik klostridiumo kolagenazę, kiti iš anksto inkubuoja kremzlę su tripsinu, propanu, DNazu ir / arba hialuronidaze. Išskirtų ląstelių skaičius priklauso nuo naudojamų fermentų. Tokiu būdu, kai perdirbimo vienas iš 1 g kolagenazės audinio galima gauti 1,4T0 ⁶ chondrocitų, kadangi, kai naudojant pronazę, hialuronidazės ir kolagenazės - 4,3-10 ⁶. Į kologenazės kultivuojamose ląstelių gydymo lieka aggrecan, baltymų, IL-6, IL-8 ženkliai didesniais kiekiais negu nuoseklus perdirbimo įvairių fermentų. Šių dviejų ląstelių kultūrų skirtumų yra keletas paaiškinimų:

• Korinio receptoriai pažeisti arba depresija fermentams veiksmų, TGF-beta slopina DNR sintezę proteoglikanų naujai išskirtų chondrocitų (1 diena), o DNR ir proteoglikanų sintezės chondrocitų augintoms monosluoksnio (7 dienos) stimuliuojamais TGF-beta. Tačiau naujo išraiška membranų komponentai reikalauja pakankamai laiko prieš pradedant eksperimentą.
• Išoriniai proteaziai gali pažeisti ląstelių ir matricos sąveiką, kurią sukelia integrinai. Integrininė šeima skatina chondrocitų pritvirtinimą prie VKM molekulių (Shakibaei M. Et al., 1997). Šis plyšimas gali paveikti matricinių genų išraišką.
• Matricos komponentų likučiai gali reguliuoti chondrocytų sintetinę funkciją. Integriniai gali atpažinti ECM degradacijos produktus, todėl jie atlieka svarbų vaidmenį atliekant audinius po proteolitinių fermentų poveikio. T. Larsson et al (1989) pranešė, kad nepakitusio arba suskaidytų proteoglikanų papildymas išaugintų ląstelių stimuliuoja baltymų ir proteoglikanų sintezę. Tačiau, aukšto lygio hialurono rūgštis sukelia žymiai sumažinti sulfato proteoglikanų sintezę įtraukimui Chondrocitai vištų embrionų chondrocitų subrendęs kiaulių ir žiurkės chondrosarkomos ląsteles. Be to, hialurono rūgšties - inhibitorius proteoglikanų išleidimo iš ląstelių net ir IL-lb, TNF-a, FGF buvimą, nurodant, kad pirmasis neutralizuoti biologinį aktyvumą augimo faktoriais ir citokinais. Tikslus mechanizmas, kuriuo grindžiama hialurono rūgšties veikimas, lieka neaiškus; Yra žinoma, kad chondrocitų sudėtyje yra hialurono rūgšties receptorių, susietų su citozolės aktino gijumi. Hialurono rūgšties sujungimas su jo receptoriumi stimuliuoja baltymų fosforilinimą. Tokiu būdu, šie duomenys rodo medžiagų apykaitos moduliavimui funkcijas vietinių chondrocitų arba suskaidytų molekulės matrikso baltymų aktyvuojant ląstelės membranos receptorius.
• Greitai stimuliuojant matricinių baltymų sintezės fermentus chondrocitais gali būti chondrocytų formos pokyčiai ir (arba) citoskeleto reorganizavimas.
• Kai kurios citokinai (pvz., IL-8) ir augimo faktoriai (pvz., IGF-1, TGF-P) yra nustatyti ECM. Geriausias žinomas pavyzdys - TGF-beta sujungimas su dekoriumi, dėl kurio sumažėja pirmųjų sugebėjimas sukelti ląstelių augimą kiaušidžių ląstelėse kinų žiurkėnose. Duomenys, kad kremzlės apdailos turinys didėja su amžiumi, rodo TGF-beta biologinį prieinamumą senėjimo metu. Augimo faktoriai ir citokinai gali būti išskiriami iš matricinių likučių kultūros metu ir vėliau moduliuoja chondrocyto funkciją.

[8], [9], [10], [11],

Vienkartinė chondrocytų kultūra

Diferencijuotas chondrocitų fenotipas visų pirma būdingas II tipo kolageno ir audinių specifinių proteoglikanų sintezei, taip pat mažam mitozinio aktyvumo lygiui. Yra įrodymų, kad ilgalaikis auginti ląsteles monosluoksnio, ir po kelių pakartotinių ištraukas ląstelių, chondrocitai prarasti savo sferinę formą, tampa pailgi, fibroblastų-kaip forma. Su, pavyzdžiui fibroblastų metaplazija sintetinis funkcija taip pat modifikuotos ląstelės, pasižyminčius progresuojantis į kolagenų II sintezės, IX ir XI tipų ir patobulinta sintezė kolageno I, III ir Utipov. Maži, ne agreguoti proteoglikanai sintetinami funkciniu agregaru. Sinthezatepsinas B ir L yra labai mažas diferencijuotose ląstelėse, tačiau diferenciacijos praradimo procesas didėja. Kolagenazės-1 yra išreikšta diferencijuotų iki chondrocitų ilgai, kad įdirbimo metu jos išraiška yra sumažintas kadangi padidėjusios gamybos audinių inhibitorius metaloproteazės (TIMP).

Diferencijuoti chondrocytai pakartotinai išreiškia diferencijuoto fenotipo kolageną, kai jie yra perkelti iš monosluoksnės kultūros į suspenduotą. Diferencijavimo procesas tikriausiai yra susijęs su ląstelių formos. Šį turtą reguliariai naudoja tyrėjai, kurie tiria pažeistą transplantaciją su autologiniais chondrocytais. Mažą skaičių ląstelių, gautų iš biopsijos medžiagos, galima padauginti į monosluoksnės kultūrą, o po to persodinti dar kartą į trimatę matricą. Iš naujo išraiškos su konkrečios fenotipo dediferencijuotų chondrocitų perkeltų į agarozės kultūros, gali būti skatinamas TGF-p-Oseinas hidroksiapatito sudėtingą ir askorbo rūgšties.

Atsižvelgiant į augimo faktorių ir citokinų poveikį, diferencijavimo metu chondrocytai modifikuojami. Ląstelinis atsakas į citokinus ir augimo faktorius skiriasi nuo nediferencijuotų ir diferencijuotų chondrocytų. IL-1 stimuliuoja fibroblastų proliferaciją, o nediferencinių chondrocytų augimą slopina IL-1. DNR sintezė stimuliuoja IGF-1 pailgiuose, bet ne suplaktuose hondrocituose. Diferencijuotose chondrocitose stimuliuojantis IL-1β ir TNF-α poveikis procolagenezės produktams yra ryškesnis nei nediferencijuotiems.

Kondrocitų kultivavimas

Chondrocitų auginimas suspensijoje skystoje terpėje arba natūralioje arba sintetinėje trimačio matricoje stabilizuoja chondrocyto fenotipą. Ląstelės išlaiko savo sferinę formą, sintezuoja audinių specifinius baltymus. Svertinė chondrocyte kultūra paprastai rekomenduojama tirti naujos perikuliarinės matricos formavimąsi. Chondrocitų kultūros sintetiniuose arba natūraliuose absorbuotais polimerais yra naudojamos implantuoti ląsteles į kremzlių defektus, kad būtų skatinama sąnario kremzlės audinio regeneracija. Sintetinė ar gamtinė aplinka implantuojamoms ląstelėms turi atitikti tam tikrus reikalavimus:

• Implantai turi turėti poringą struktūrą sukibimui ir ląstelių augimui,
• nei pats polimeras, nei jo degradacijos produktai in vivo implantavimui neturėtų sukelti uždegimo ar toksinių reakcijų ,
• transplantacijos laikiklis turėtų sugebėti prisijungti prie gretimų kremzlių ar subchondrinių kaulų,
• natūrali ar sintetinė matrica turi sugebėti sugerti, jos skilimas turi būti subalansuotas audinių regeneracija,
• Kad būtų lengvesnis kremzlių remontas, cheminė struktūra ir matricos matricos architektūra turėtų padėti išlaikyti ląstelių fenotipą, dedamą į chondrocytus, ir audinių specifinių baltymų sintezę,
• implantuojant in vivo, būtina ištirti sintetinių ar natūralių matricų mechanines savybes.

[12], [13], [14], [15], [16]

Chondrocytų suspensija skystoje fazėje

Ląstelių prisirišimas prie plastikinių laivų,, kurioje chondrocitų kultivavimą galima išvengti savo sienos padengtas tirpalas metilo celiuliozės, agarozės, hidrogelio (poli-2-hidroksietilmetakrilatas) arba kolageno-agarozės mišinio. Esant tokioms sąlygoms, chondrocytai formuoja grupes ir sintezuoja daugiausiai agregano ir audinių specifinius kolagenus (II, IX, XI tipai). Paprastai randama dviejų tipų ląstelių. Centre esančios ląstelės išlaiko sferinę formą, kurią supa gerai išvystyta ECM, kurią patvirtina histoheminės ir ultrastruktūrinės studijos. Periferijoje chondrocytai turi diskoidinius kontūrus, yra apsupti retos ECM; Mažai žinoma apie tokių ląstelių funkcines savybes.

Galimas chondrocitų auginimas ant mikroklučių, palaikomų suspensijoje; Kaip mikrokreditai naudojami dekstrano karoliukai (cytodeksas), kolageno dengtos dekstrano granulės (citotoksė III), nevaldomos I tipo kolageno mikrosferos (kolageno). Esant tokioms kultūrinėms sąlygoms, chondrocitai pritvirtina prie mikrokreiso paviršiaus, išlaiko savo sferinę formą ir gamina matricą panašią medžiagą. Be to, kolageno naudojimas skatina chondrocitų paplitimą ir įprasto fenotipo reekspresiją. Todėl chondrocytų augimą kolageno mikrosferose galima panaudoti ląstelių fenotipo atkūrimui prieš transplantaciją.

Kitas būdas, kaip kultivuoti chondrocytų suspensiją skystoje terpėje, yra jų auginimas tankiomis granulėmis, susidedančiomis iš ląstelių (0,5-1 * 10 ^b ), gautų centrifuguojant. Tokie chondrocytai sugeba gaminti matricą, kurioje yra daug proteoglikanų, II tipo kolagenas, bet ne I tipo kolagenas, kuris patvirtintas histologiniais, imunohistocheminiais ir kiekybiniais metodais.

Chondrocitų sustabdymas natūralioje ECM

Chondrocitai gali būti kultivuojamos suspensijoje trimatis matricos (minkštieji agaro, agarozės, skambinti genai gelis arba kempinę, hialurono rūgštis, fibrino klijai, alginatas rutuliukai).

Kultivuoti agarozės chondrocytai išlaiko savo įprastą fenotipą ir sintezuoja II tipo kolageną ir naujas audinių specifinius agregatus. Kai kultivuojama agaroze, ląstelių sintezuoti proteoglikanai išleidžiami į terpę 50 dienų. Palyginimui - monolių kultūroje ląstelių fazė per pirmąsias 5-6 auginimo dienas yra perpildyta glikozaminoglikanais; kai auginamos terpėje po to, kai intensyvėja glikozaminoglikanų sintezė ir atpalaidavimas, per pirmąsias 8-10 dienų pasireiškia laiko priklausomas glikozaminoglikanų sumažėjimas. Nepaisant to, chondrocitų elgesys kultivuojant agarozę skiriasi nuo in vivo sąlygų. Agarozėje daug sintetinių Aggregano agregatų turi mažesnes ir mažesnes molekules nei in vivo. TGF-P stimuliuoja proteoglikanų sintezę į eksantatą, bet sumažina agregato sintezę agarozėje.

Alginas yra linijinis polisacharidas, gautas iš rudųjų jūros dumblių. Esant dvivalentėms katijonoms, tokioms kaip Ca ^{2+ jonai}, šis polimeras tampa geliu. Kiekvienas sugauti alginato chondrocitų, apsuptas neigiamo krūvio polisacharidų matricos, kurio poros yra palyginama su hialininė kremzlė. Matrica kuris yra suformuotas chondrocitų į alginato karoliukų, susidedanti iš dviejų segmentų - plonu sluoksniu ląstele susijusio matricos, atitinkančios pericellular ir teritorinių matricų sąnario kremzlės ir daugiau nuotolinio matricos tarpteritorinius ekvivalento gimtąja audinio. 30 dieną kultūros, santykinė bei absoliuti apimtis užima ląstelių, ir kiekvienas iš dviejų departamentų alginatine karoliukas yra beveik visiškai tapatūs gimtąja kremzlės. Beveik 30 dienų chondrocitai išlaiko savo sferinę formą ir gaminti aggrecan, hidrodinaminius tokių savybių, kurių panašios į aggrecan molekulių kremzlinės ir kolageno molekulės II, IX ir XI tipų matricos. Tuo pačiu metu, kaip ir kiti kultūrų, suspensijų, alginatas granulės dėl plokšti ląstelių paviršiuje yra pateikti, kad generuoti nedidelį kiekį I tipo kolageno molekulių, išleidžiamos tiesiogiai į aplinką, o ne įtrauktos į vaizdo grotuvo. Alginato granulėse stebimas vidutiniškas chondrocytų daugėjimas. Po 8 mėnesių auginimo alginatas gelio brandžių chondrocitų nepraranda medžiagų apykaitos veiklą ir toliau sintetina audinių specifinių kolageno II tipo ir aggrecan.

N. Tanaka ir jo bendraautoriai (1984) ištyrė įvairių alginato natūralių molekulių difuzines savybes ir nustatė, kad per alginatą nesiskiria molekulės didesnės nei 70 kD. Taigi, alginato ląstelių auginimas yra tinkamas matricos biosintezės ir ECM organizmo reguliavimo tyrimui. Algidinuose auginamų ląstelių prieinamumas leidžia ištirti peptidų reguliavimo veiksnių ir farmakologinių agentų poveikį transkripcijos, po transkripcijos ir transliacijos lygmenimis.

Chondrocytai taip pat kultivuojami I ir II tipo kolageno skaidulų matricoje. S. Nehrer ir jo bendraautoriai (1997) palygino šunų chondrocitų funkcionavimą poringuose kolageno-proteoglikanų polimerinėse matricose, kuriose yra įvairių tipų kolagenuose. Jie nustatė, kad kolagenuose matricose, kuriose yra I ir II tipo kolageno, kultivuojamų chondrocytų biosintezės funkcijos morfologija yra svarbi. II tipo kolageno ląstelės suformavo sferinę formą, o I tipo kolagenas turėjo fibroblasto tipo morfologiją. Be to, II tipo kolageno matricoje chondrocytai gamina daugiau glikozaminoglikanų. J. Van Susante ir kt. (1995) palygino alginato ir kolageno (I tipo) gelio hondrocitų savybes. Autoriai nustatė reikšmingą ląstelių skaičiaus padidėjimą kolageno gelyje, tačiau nuo 6-osios auginimo dienos ląstelės prarado būdingą fenotipą, paverčiant fibroblasto tipo ląstelėmis. Alginato gelyje pastebėtas ląstelių skaičiaus sumažėjimas, tačiau chondrocytai išliko normalus fenotipas. Kolageno gelio proteoglikanų vienoje ląstelėje suma buvo žymiai didesnis nei alginato, bet šis sumažėjimas buvo stebimas gelio adatinių elementų sintezės, pradedant nuo 6 dieną auginimą, kadangi alginato sintezės ir toliau augti.

Tvirta trimatis fibrino matrica yra natūrali medžiaga, palaikanti diferencijuotą fenotipą suspenduotus chondrocytus. 3D fibrino matrica taip pat gali būti naudojama kaip chondrocytų transplantacijos nešiklis. Fibrino privalumai yra citotoksiškumo nebuvimas, gebėjimas užpildyti erdvę, klijais. Histologiniais ir biocheminių tyrimų Autoren-diografii, elektronų mikroskopija parodė, kad per fibrino geliai chondrocitai išlaiko savo morfologiją, daugintis ir gaminti matricą net po 2 savaičių auginimo. Tačiau G. Homminga ir kt (1993) pranešė, kad po 3 dienų kultūra, prasideda fibrino dezintegracija progresuoja dedifferentiation chondrocitų.

Chondrocytų suspensija dirbtinėje (sintetinėje) ECM

Kremzlės implantai rekonstrukcinei ar ortopedinei chirurgijai gali būti gaunami auginant izoliuotus chondrocytus in vitro sintetinėje biologiškai suderinančioje matricoje.

Kultūrinės poliglikolio rūgšties chondrocytai proliferuoja ir palaiko normalią morfologiją ir fenotipą per 8 savaites. Chondrocyto-poliglikolio rūgšties kompleksas susideda iš ląstelių, glikozaminoglikanų, kolagenų ir išorinės kolageno kapsulės. Tačiau tokiuose implantuose yra dviejų tipų kolageno molekulės - I ir II. Implantai, dedifferentiuotiems sergančiais kanodrocitų kanalų serijomis, turi daug glikozaminoglikanų ir kolagenų nei implantų, pirmiausia iš nediferencijuotų chondrocytų.

L. Freed et al (1 993b), palyginti su chondrocitų kultūrų žmogaus ir galvijų elgesį pluoštinių poliglikolio rūgšties (EQAP) ir nesantaiką polilaktilovoy rūgšties (PPLC). Po 6-8 savaičių bulvių chondrocytų auginimo HSVG ar PPLC metu autoriai stebėjo ląstelių proliferaciją ir kremzlės matricos regeneraciją. HSBC chondrocytės buvo sferinės, esančios lacunai, apsuptos kramtomosios matricos. Po 8 savaičių auginimo in vitro regeneruotos audinio būti iki 50% kietųjų dalelių (4% ląstelių masės, 15% ir 31% gliukozaminogliukanų kolagenų). PPLK ląstelėse buvo suklio formos, nedidelis glikozaminoglikanų ir kolageno kiekis. HSBC ląstelių augimas buvo 2 kartus intensyvesnis nei PTCA. In vivo sąlygomis, HPVC ir PPLC išauginti chondrocytai nuo 1 iki 6 mėnesių sukėlė audinį, histologiškai panašų į kremzlę. Implantuose buvo glikozaminoglikanų, I tipo ir II tipo kolagenų.

Augalinės bulių chondrocytės buvo auginamos poringu dideliu tankiu hidrofobiniu ir hidrofiliniu polietilenu. Po 7 dienų inkubacijos abiejuose substratuose ląstelės buvo sferinės formos, daugiausia II tipo kolageno. Po 21 dienos auginimo paaiškėjo, kad hidrofilinėje matricoje yra daugiau II tipo kolageno, nei hidrofobinės matricos.

Kremzlės audinius taip pat galima gauti kultivuojant "Millicell-CM" monolitais. Filtruoti iš anksto prieš dengiant kolageną būtina, kad būtų pritvirtinti chondriniai. Histologinis kultūros tyrimas rodo, kad chondrocitai kaupiasi ECM, kuriame yra proteoglikanų ir II tipo kolageno. I tipo kolagenas tokioje kultūroje nėra aptiktas. Susidariusio kremzlinio audinio chondrocitai yra sferinės formos, tačiau audinio paviršiuje jie yra šiek tiek suplakti. Naujai sukurto audinio storis padidėjo laikui bėgant ir priklausė nuo ląstelių monosluoksnio pradinio tankio. Esant optimalioms kultūros sąlygoms, kremzlės audinio storis pasiekė 110 μm, jo ląstelių ir kolageno organizavimas į paviršių ir giliai sluoksniai yra panašus į sąnarių kremzlių struktūrą. VKM yra maždaug 3 kartus daugiau kolageno ir proteoglikanų. Po 2 savaičių auginimo buvo pastebėta matricos-SA kaupimosi, dėl kurios buvo galima išgauti audinį iš filtro ir naudoti jį transplantacijai.

Sims ir kt. (1996) tyrinėjo chondrocitų auginimą polietileno oksido gelyje, įterptų polimerinės matricos, kuri leidžia daugeliui ląstelių transportuoti injekcijomis. Po šešių savaičių po įpurškimo į atmainų pelių poodinį audinį atsirado naujas kremzlės, kuris morfologiškai būdingas baltos opalescencijos, panašios į haliulio kremzlę. Histologinių ir biocheminių tyrimų duomenys parodė aktyvių proliferuojančių chondrocytų, kurie gamina ECM.

Paaiškinimas

Kramtomojo audinio tyrimas naudojamas analizei ir katabolizmo procesams tirti, homeostazei, rezorbcijai ir remontui. Chondrocytai, esantys kramtomosios audiniuose, padeda palaikyti normalų ECM fenotipą ir sudėtį, panašų į sąnarių kremzlių in vivo. Po 5 dienų auginimo, esant serumui, pasiekiamas nuolatinis sintezės ir natūralaus skilimo lygis. Rezorbcija gali paspartinti audinių kultūrą ir pagrindiniame kultūros su serumo Be to, naudojant agentų skaičių, pvz, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, dariniai, retino rūgšties arba aktyvių deguonies radikalų. Mokytis savo remontas kremzlės pažeidimai būtų sukeltas tirpių uždegimo mediatorių (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) arba fizinės plyšimas matricos.

Organotypic kultūrų metodas yra modelis, skirtas izoliuotų išorinių veiksnių in vitro tyrimui ant chondrocytų ir aplinkinių matricų. In vivo chondrocitai retai yra ECM ir nesusieja vienas su kitu. Eksplantuotų sąnarių kremzlių kultūra išlaiko šią struktūrinę organizaciją, taip pat konkrečią sąveiką tarp chondrocytų ir jų aplinkinių neakultūrinės aplinkos. Šis modelis taip pat naudojamas mechaninio streso, farmakologinių agentų, augimo faktorių, citokinų, hormonų poveikiui kremzlių metabolizmui ištirti.

Dar vienas kiaušidžių audinio paaiškinimo privalumas yra tai, kad proteolitiniai fermentai nepažeidžia chondrocitų arba mechaninis faktorius, kuris yra neišvengiamas, kai ląstelės yra izoliuotos. Receptoriai ir kiti membraniniai baltymai ir glikoproteinai yra apsaugoti nuo žalingų veiksnių.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kondrūnų kultūra

Hondron - struktūrinių, funkcinių ir medžiagų apykaitos kremzlės junginys, susidedantis iš chondrocitų pericellular matricos ir savo kompaktiško gijų kapsulė, ir yra atsakingas už matricos homeostazės. Chondratai mechaniškai ekstrahuojami iš kremzlės ir surenkami keliais nuosekliais mažo greičio homogenizavimais. Išskirtas iš įvairių gylių hondrony kremzlės gali būti suskirstyti į keturias kategorijas zonas: vieną hondron, dviejų hondrony, kartotinio (tris ar daugiau) linija išdėstytu hondrony (stulpelis hondronov) hondronov perkrovos.

Vienvietis hondrony paprastai randama per vidurį sluoksnių nepaliestas kremzlės, Twin - nuo viduryje ir gilių sluoksnių sienos tiesiškai surengė kelis hondrony tipiškas iš gilių sluoksnių sveika kremzlės. Galiausiai chondrūnų grupes sudaro atsitiktinai sugrupuotos vienos ir poros chondrūnų grupės, kurios po homogenizacijos išlaiko agregaciją. Kondrūnų kaupimasis yra dideli kremzlės fragmentai, dažniausiai turintys kelis chondronus ir radialiai esančius kolageno fibrilius, ty būdingą giliųjų matricos sluoksnių charakteristiką. Chondrūnai imobilizuojami skaidraus agaroze, kuri leidžia tirti jų struktūrą, molekulinę sudėtį ir metabolinį aktyvumą. Hondron sistema - agarozės laikomas mikro modelio kremzlės, kuri skiriasi nuo tradicinio sistemos chondrocitų - agarozės, kad išsaugo natūralią mikroaplinka, nereikia atlikti savo sintezę ir surinkimas. Chondrūnų kultūra yra modelis ląstelių ir matricos sąveikai tirti sąnarių kremzlių normaliomis ir patologinėmis sąlygomis.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Nemirtingų chondrocytų kultūra

Norint sukurti nuolatines ląstelių linijas, naudojama rekombinantinė DNR arba onkogeno virusų, kurie gali padaryti ląstelę "nemirtingą". Nemirtingi chondrocytai turi galimybę begaliniam proliferacijos procesui išlaikyti stabilų fenotipą. F. Mallein-Gerin et al (1995) parodė, kad onkogeno yra SV40T sukelta proliferacija pelės chondrocitų, kuri taip toliau stabiliai išreikšti kolagenai II, IX ir XI rūšis, taip pat kaip ir su bendra ir aggrecan surišantis baltymas. Tačiau, šis ląstelių linija įgyja gebėjimą sintetinti I tipo kolageno, kultivuojant jį vienasluoksnę kultūroje arba agarozės gelyje.

W. Horton ir jo bendraautoriai (1988 m.) Apibūdino nemirtingų ląstelių liniją, kurios molekulinės raiškos II tipo kolagenas yra žemas. Šios ląstelės buvo gautos transformuojant jas su pelės retrovirusu, turinčiu I-myc- ir y-ra-onkogenus. Šis ląstelių tipas yra unikalus modelis, skirtas sąnario matricos sąveikai tyrinėti, jei nėra II tipo kolageno, taip pat II tipo kolageno sintezės reguliavimas.

Chondropitų, turinčių mutavus arba išbrauktus genus, kultūra yra patogus jų fiziologinės funkcijos tyrimo modelis. Šis modelis ypač tinka mokytis konkrečių molekulių vaidmenį kremzlės matrikso organizacijų arba studijuoti įvairių reguliavimo veiksnių kremzlės metabolizmą poveikio. Chondrocitai nuotolinio genų susintetintas tipo kolageno IX kolageno fibrilės platesnė nei įprasta, nurodant, kad IX tipo kolageno reguliuoja plaušelių skersmens. Kaip nurodyta 1 skyriuje, neseniai buvo aptikta II tipo kolageno koduojančio COLAI geno mutacija šeimose, kuriose yra pirminis generalizuotas osteoartritas. Ištirti mutantas kolageno II tipo poveikį sąnario matricos R. Dharmrvaram et al (1997) atliktas transfekciją ( "užteršimo" užsienio nukleino rūgšties) su defektais COL, ₂ GR (arginino 519 padėtyje yra pakeičiama cisteino) koncentracijos nustatymui žmogaus vaisiaus chondrocitų in vitro.

Cokulturo sistema. Jungtyje kremzlės sąveikauja su kitų tipų ląstelėmis, kurių sudėtyje yra sinovijos membranos, sinovijos skysčio, raiščių, subchondrinių kaulų. Chondrocitų metabolizmą gali įtakoti įvairūs šių ląstelių sintezę tirpūs veiksniai. Taigi, artrito sąnarių kremzlę sunaikina proteolitiniai fermentai ir laisvieji radikalai, kuriuos gamina sinovinės ląstelės. Todėl modeliai buvo sukurti siekiant ištirti sudėtingą sąveiką tarp kremzlės ir aplinkinių audinių, kurie vadinami kultūra.

S. Lacombe-keliø et al (1995) buvo auginamos triušio chondrocitai ir osteoblastus in the coculture sistemos (Costar), kuriame ląstelės buvo atskirtos mikroporėtą membraną (0,4 mikronų) leidžia tarp dviejų tipų ląstelių keitimąsi be jokio tiesioginio kontakto. Šis tyrimas parodė osteoblastų gebėjimą stimuliuoti chondrocytų augimą tirpiais tarpininkais.

A.M. Malfaitas ir jo bendraautoriai (1994) ištyrė periferinio kraujo monocitų ir chondrocytų santykį. Šis modelis yra naudinga tiriant procesų, kuriuose mediatorius citokinų prie uždegiminių, artropatijos (reumatoidinis artritas, seronegatyvios spondilitas ir kt.). Modelio autoriai atskiria ląsteles nuo baltymų surišančios membranos su poromis, kurių skersmuo yra 0,4 μm. Tyrimas nustatė, kad lipopolisacharidų stimuliuojama monocitai dirbo iFNO IL-1-a medžiaga, kuri slopina chondrocitų aggrecan sintezę ir prisidėjo prie jau susintetintų aggrecan agregatų degradacijos.

K. Tāda et al (1994) sukūrė coculture modelį, kurioje endotelio ląstelių kolageno (I tipo) gelis buvo išvesti į vidinį kameroje nuo išorinio kameroje nuo jo atskirtas chondrocitų patalpinami į filtrą, kurio akučių dydis 0,4 mikronų. Per visą izoliacijos būklę nuo išorinio kameroje žmogaus endotelio ląstelių vamzdžio suformuota kolageno gelį EGF arba TGF-a buvimą. Su tuo pačiu metu abu TGF ląstelių auginimu buvo slopinamas priklausomas vamzdelių formavimasis endotelio ląstelėmis. Šio proceso chondrocitų slopinimas buvo iš dalies pašalintas anti-TGF-beta antikūnų. Galima daryti prielaidą, kad chondrocytų gaminama TGF-beta slopina pačią kraujagyslę.

S. Groot ir jo bendraautoriai (1994) vienu metu kultivavo chondrocitus iš 16 dienų piktybinės vaisiaus pelės ir smegenų audinio gabalėlių hipertrofinių ir proliferacinių zonų. Po 4 dienų kultūroje buvo stebėta chondrocytų transdiferenciacija į osteoblastą ir osteoidų susidarymo pradžia. Po 11 dienų auginimo dalis kremzlės buvo pakeista kaulų audiniu ir kaulų matrica iš dalies buvo kalcifiuota. Kai kurie neuropeptidai ir neurotransmiteriai, kuriuos gamina smegenų audinys, veikia osteoblastų metabolizmą arba juose yra receptorių. Tarp jų norepinefrinas, vazaktyvus žarnyno peptidas, peptidas, susietas su kalcitonino genu, medžiaga P ir somatostatinu, gali būti izoliuoti . Kultūrinis su chondrocytais, smegenų audinio gabalais gali sukelti kai kuriuos iš šių veiksnių, kurie gali paskatinti chondrocitų transdiferenciacijos procesą į osteoblastus.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Išorinių veiksnių įtaka chondrocytų kultūrai

Deguonies įtampų poveikis chondrocytų metabolizmui

Daugeliu atvejų chondrocitų kultūros vystosi atmosferos deguonies įtempimo sąlygomis. Nepaisant to, gerai žinoma, kad in vivo hondrocitai egzistuoja esant hipoksikinėms sąlygoms, o deguonies įtampa priklauso nuo skirtingų patologinių būklių. Brandinimo metu pastebimi reikšmingi epifizių kraujo pasiūlos pokyčiai. Kadangi vaskulizacija skiriasi į skirtingas augimo plokštės sritis, deguonies įtampa jose taip pat skiriasi. C. Brighton ir R. Heppenstall (1971) parodė, kad triušių plokštelėje blauzdikaulio įtempimas hipertrofinėje zonoje yra mažesnis nei aplinkinių kremzlių. Kai kurių metabolinių parametrų matavimai parodė, kad chondrocytai sugeba greitai reaguoti į vietinius deguonies koncentracijos pokyčius. Pirmiausia, esant mažai deguonies įtemptai, jo chondrocytų suvartojimas mažėja. Padidėjus deguonies įtempimui nuo 21 iki 0,04%, padidėja gliukozės utilizavimas, padidėja glikolizės fermentų aktyvumas ir pieno rūgščių sintezė. Net esant mažai deguonies įtampai absoliutus ATP, ADP ir AMP kiekis išlieka stabilus. Šie duomenys rodo chondrocitų metabolizmo kryptingumą, siekiant maksimaliai padidinti energijos taupymą. Nepaisant to, sintetinis aktyvumas, taigi ir reparacijos procesas, pasikeičia hipoksijos sąlygomis.

Didelis deguonies įtempimas taip pat daro įtaką chondrocytų metabolizmui, dėl kurio mažėja proteoglikanų ir DNR sintezė, kremzlės matricos skilimas. Paprastai toks poveikis yra laisvųjų deguonies radikalų gamyba.

Jonų koncentracijos ir aplinkos osmosinio slėgio įtaka chondrocitų veikimui

Gimtąja kremzlės jonų koncentracijos yra žymiai skiriasi nuo kitų audinių: natrio kiekis ekstratąsteĮinėje terpėje yra 250 - 350 mmol, ir jo osmosinis slėgis - 350-450 mOsm. Kai izoliuoti chondrocitų iš VCR ir inkubacijai juos standartiniu žiniasklaidos (DMEM (Dulbecco Minimalus pagrindinė terpė - Dulbecco Minimali pagrindinė terpė) osmosinis slėgis - 250-280,7 mOsm) keičiasi staigiai supanti aplinka ląstelę. Be to, kalcio ir kalio koncentracija standartinėje terpėje yra daug mažesnė nei natūraliame audinyje, o anijonų koncentracija yra daug didesnė.

Sacharozės pridėjimas į terpę padidina jo osmoliaciją ir sukelia trumpalaikį intracellular padidėjimą H ⁺ ir kalcio anijonų koncentraciją citozolyje. Tokie intraceluliniai pokyčiai gali paveikti chondrocitų diferenciacijos procesus ir jų metabolinį aktyvumą. J. Miesto et al (1993) nustatė, kad įtraukimas ³⁵ 8-sulfato ir ³ H-prolino izoliuotų chondrocitų inkubuoti DMEM standartinio terpėje 2-4 valandas, buvo tik 10%, kad gimtąja audinio. Sintezė intensyvumas pasiekė kai tarpląstelinio laikmenoje 350-400 mOsm naujai išskirtų chondrocitų ir kremzlių eksplantuose į osmosinis slėgis. Be to, chondrocyto tūris padidėjo 30-40% po to, kai buvo dedama izoliuota ląstelė į standartinę DMEM terpę, minėtą osmosinį kiekį. Tačiau, kai išauginti chondrocitų pagal ne fiziologinio osmoliariškumas 12-16 valandų, ląstelės pritaikyti prie naujos aplinkos, mažinant šlyties stipris yra proporcingas biosintezė osmosinis slėgis iš tarpląstelinio terpėje.

P Borgetti et al (1995) tyrė osmoliariškumas ekstraląstelinės terpės augimo, morfologija poveikį, ir kiaulių chondrocitų biosintezę. Autoriai parodė panašius biocheminių ir morfologinių charakteristikų chondrocitų išaugintų žiniasklaidoje su osmoliariškumas mOsm 0,28 ir 0,38. Kai buvo pastebėta, 0,48 mOsm osmosinis slėgis terpės per pirmąsias 4-6 valandas kultūros sumažėjimą ląstelių proliferaciją ir baltymų sintezę, o vėliau įvyko atkurti šių parametrų, kad galiausiai pasiekė kontrolės vertes. Kai kultivuojant chondrocitų terpėje su 0,58 mosm osmolingumas ląstelių praranda gebėjimą palaikyti fiziologinę intensyvumo antiproliferacinės procesus ir po 6 dienų chondrocitų skaičius yra gerokai sumažintas. Su vidutine osmosine verte, 0,58 mosmol, stebimas gilus baltymų sintezės slopinimas. Be to, kai kultivuojamos terpėje su osmoliariškumas mOsm 0,28-0,38 chondrocitai išlaikyti fiziologinį fenotipą kurių didesnis osmoliariškumas (mOsm 0,48-0,58) žymaus ląstelių morfologijos pokyčiais, kaip pasireiškia nuostoliai būdinga fenotipas Chondrocitai konversiją į fibroblasto tipo ląsteles, taip pat ląstelių praradimą, sugebėjimą surinkti matricos proteoglikanus. Šio tyrimo rezultatai rodo, chondrocitų reagavimą į svyravimų ribotas osmoliariškumas iš tarpląstelinio aplinkoje.

Kitų jonų koncentracijos kitimai taip pat gali paveikti chondrocytų biosintezės procesus. Tokiu būdu, įregistravimo laipsnis ³⁵ S (sulfato) yra padidėjo pusę su padidinti kalio jonų koncentracija 5 mM (į standartinę aplinkos DM EM koncentracijos) iki 10 mM (in ECM koncentracijos in vivo). Kalcio koncentracija yra mažesnė nei 0,5 mmol, todėl kolageną gamina subrendę bulių chondrocytai, o 1-2 mmol koncentracija (atitinkanti standartinę DM DM terpę) sukėlė reikšmingą kolageno sintezės sumažėjimą. Didelis kalcio kiekis (2-10 mmol) stebėtas vidutiniškai padidėjus biosintezei. VKM baltymuose dalyvauja įvairūs katijonai. Taigi magnio ir mangano jonai pritvirtinami prie fibronektino ir II tipo kolageno, o kalcio jonai nedalyvauja chondrocitų pritvirtinimui prie baltymų. Taigi apibendrintų tyrimų rezultatai rodo, kad terpėje esančių kalio, natrio, kalcio ir vidurių osmosinio ekstraląstelinio jono pasikeitimo įtaka standartizuotoje terpėje inkubuotų chondrocytų biosintezės funkcijai.

Mechaninės įtakos poveikis chondrocytų metabolizmui

Susilpnėjęs sąnarys sukelia grįžtamą kremzlės atrofiją, kuri rodo mechaninių stimulų, reikalingų normaliam apykaitos procesų eigai ECM, poreikį. Daugeliu atvejų naudojami ląstelių kultūros modeliai egzistuoja esant normalioms atmosferos slėgio sąlygoms. M. Wright ir jo bendraautoriai (1996) parodė, kad mechaninė aplinka daro įtaką chondrocytų metabolizmui, o ląstelių atsakas priklauso nuo suspaudimo apkrovos intensyvumo ir dažnumo. Eksperimentai su apkrova sveikq eksplantų sąnario kremzlės in vitro parodė sintezės baltymų ir proteoglikanų sumažėjimą veikiant statinei apkrovai, dinaminės apkrovos, o skatinti šiuos procesus. Tiksliai mechanizmai įgyvendinimo mechaninėms apkrovoms poveikį kremzlės komplekso, ir tikriausiai susijęs su padermė ląstelių, hidrostatinį slėgį, osmosinį slėgį, elektrinis potencialas ir ląstelės paviršiaus receptorių adatinių molekulių. Norėdami ištirti kiekvieno iš šių parametrų poveikį, būtina sukurti sistemą, kurioje vienas parametras gali būti nepriklausomai įvairus. Pavyzdžiui, tirpiklio kultūra nėra tinkama tyrinėti ląstelių deformaciją, tačiau ją galima naudoti norint ištirti bendrą slėgio poveikį chondrocytų metaboliniam aktyvumui. Suspaudimo kremzlės veda prie ląstelių deformaciją, ir taip pat kartu su hidrostatinio slėgio gradientui, elektros potencialo, ir skysčio srauto kaitos fizikinius tokius veiksnius, kaip vandens kiekio matricą, elektros krūvio tankio, į osmosinį slėgį lygiu atsiradimo. Ląstelių deformaciją galima ištirti naudojant izoliuotus hondrocitus, panardintus į agarozę arba kolageno gelį.

Sukurta keletas sistemų, skirtų mechaninio stimuliavimo poveikiui chondrocytų kultūrai tirti. Kai kurie tyrėjai naudoja šiam tikslui skirtas sistemas, kuriose spaudžiamas ląstelių kultūra per dujinę fazę. Pavyzdžiui, JP Veldhuijzen et al (1979), naudojant slėgį virš atmosferos 13 kPa metu 15 minučių žemo dažnio (0,3 Hz), pastebėta, cAMP sintezės ir proteoglikanų ir nuleidimo DNR sintezę padidėjimą. R. Smith et al (1996) parodė, kad protarpinis veikimas pirminių kultūrų chondrocitai jautis hidrostatinis slėgis (10 MPa) esant 1 Hz iki 4 valandų sukėlė į aggrecan ir kolageno II tipo sintezės padidėjimą, kadangi pastovaus slėgio neturėjo šių procesų poveikį. Naudojant panašią sistemą M. Wright et al (1996) pranešė, kad ciklinis slėgis į ląstelių kultūroje yra susijęs su hiperpoliarizaciją ląstelės membranos chondrocitų ir aktyvavimo Ca ²⁺ -dependent kalio kanalų. Tokiu būdu, cikliniai slėgio poveikis medijuojamas joninių kanalų aktyvuojamos tempimas, membranos chondrocitų. Chondrocitų atsakas į hidrostatinį slėgį priklauso nuo ląstelių kultivavimo sąlygos ir dažnumas apkrovos. Tokiu būdu, ciklinis hidrostatinis slėgis (5 MPa) sumažina sulfatu įtraukimą į chondrocitų monosluoksnio esant 0,05, 0,25 ir 0,5 Hz dažnio, tuo tarpu dažniais, aukštesniais 0,5 Hz Įtraukimo sulfato kremzlės eksplantantų didėja.

Bushmann M. Et al (1992) pranešė, kad chondrocitai į agarozės gelyje p pakeisti biosintezę reaguojant į statinius ir dinaminius mechaninių apkrovų, taip pat dirbamos sveika organo. Autoriai nustatė, kad mechaninė apkrova generuoja hiperosmozinį stimulą, o po jo sumažėja hondrocitų pH.

Mechaninio tempimo įtaka gali būti ištirta ląstelių, panardintų į gelį, kultūra. Ištempimo jėga gali būti sukurta naudojant kompiuteriu valdomą vakuumą. Kai sistema yra tam tikro laipsnio vakuumui iš Petri lėkštelės su ląstelių kultūros apačioje yra pratęstas žinomu kiekiu, maksimali deformacija puodelio apačioje ir mažiausiai prie centro kraštų. Ištempimas perduodamas ir kultivuojamas chondrocytų petri lėkšte. Su šiuo metodu, Holm-Vall K. Et al (1995) parodė, kad augintoms kolageno (II tipo) gelis chondrosarkomos ląstelės padidėjo mRNR ir išraišką ₂ -integrina. ₂ p _r integrino yra pajėgus prisijungti prie kolageno II tipo. Jis laikomas mechanoreceptoriumi, nes jis sąveikauja su aktiną surišančiais baltomais, todėl jungia ECM ir citoskeletą.

PH poveikis Chondrocyte metabolizmui

ECMI intersticinio skysčio pH yra labiau rūgštingesnis nei kituose audiniuose. A. Maroudas (1980) nustatė sąnarių kremzlių pH 6,9. W. Diamantas ir jo bendraautoriai (1966) nustatė pH 5,5 patologinėse sąlygose. Yra žinoma, kad chondrocytai gyvena su maža PO2, o tai rodo svarbų glikolizės (95% viso gliukozės metabolizmo) vaidmenį šių ląstelių metabolizme; Glikolizė lydima daug pieno rūgšties.

Be aplinkos rūgštėjimo glikolizės produktais, patys matricos komponentai yra labai svarbūs. Daug fiksuoto neigiamu krūviu ant neląstelinių proteoglikanų keičia joninės sudėties: yra didelės koncentracijos laisvųjų katijonų (pvz H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) ir mažos koncentracijos anijonų (pvz, O2, NPHS). Be to, mechaninės apkrovos metu iš ECM išsiskiria vanduo, dėl kurio padidėja fiksuotų neigiamų įkrovų koncentracija ir daugiau katijonų pritraukimas į matricą. Tai lydina ekstlevingos terpės pH mažėjimas, kuris paveikia intracellular pH, taip modifikuojant chondrocytes metabolizmą. R. Wilkin ir A. Hall (1995) tyrė ekstraląstelinės ir vidinės ląstelės terpės pH poveikį matricos biosintezei izoliuotų bulių chondrocytuose. Jie pastebėjo dvejopą matricos sintezės modifikaciją, kai pH sumažėjo. Tiek sumažėjo pH (7,4 35 S0 ₄ ir ³ H-prolino į chondrocitų, kadangi giliau parūgštinant (pH <7,1) slopina sintezę 75%, palyginti su kontrolė. To paties mažo pH (6.65) sukūrimas amonio jonais sumažino matricos sintezę tik 20%. Gauti rezultatai rodo, kad ekstracelulinės matricos sintezės terpės pH modifikavimą negalima paaiškinti tik esant intracellulinės terpės pH pokyčiams. Be to, chondrocitai turėti gebėjimą reguliuoti ląstelėje pH Na ⁺, H ⁺ šilumokaičio, Ca ⁺ -dependent C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS ir H ⁺ / ATP-azės.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Kultūrinės terpės sudėties poveikis chondrocytų metabolizmui

Chondrocytų kultivavimo terpė turi atitikti eksperimentines sąlygas. Pastaraisiais metais kultivavimo sąlygų optimizavimui buvo naudojamas veršelių serumas. Tačiau, naudojant serumą, reikėtų atsižvelgti į keletą svarbių dalykų:

• išorinis ląstelių augimas iš audinių periferijos organų kultūrose,
• įvairių serijos serumų sudėties kintamumas,
• juose esančių nežinomų komponentų buvimas
• padidėjusi trukdžių rizika, artefaktai, tiriant įvairių biologinių veiksnių įtaką ląstelių metabolinei veiklai.

Pastarojo pavyzdys yra EGF poveikio žarnų kremzlių chondrocytams tyrimas. EGF stimuliuoja ³ H-timidino įvedimą ir DNR kiekio augimą kultūroje. Šis poveikis buvo ryškesnis, esant mažesnei koncentracijai serume (<1%), tačiau esant didelėms koncentracijoms (> 7,5%) poveikis išnyko.

Gerai žinoma, kad DMEM, kurio sudėtyje yra veršelių serumo, sintezės ir skilimo lygis gerokai padidėja, palyginti su in vivo sąlygomis. Skirtumai tarp in vivo ir metabolizmo in vitro gali būti susiję su skirtumu tarp sinovijos skysčio ir aplinkos, kurioje ląstelės yra auginamos. D. Lee et al (1997) buvo auginamos Chondrocitai jaunus bulių agarozės naudojant maistinių medžiagų terpę, turinčią DMEM, praturtintą 20% veršiuko serumu ir daug alogeninių įprastinę sinovinio skysčio. Sinovialinio skysčio buvimas terpėje padidino proteoglikanų skaičių iki 80% viso sinovijos skysčio kiekio. Šie rezultatai rodo, kad sinovijos skysčio kultūros skatina medžiagų apykaitą, panašus į in vivo, su aukšto lygio sintezės glikozaminoglikanų ir mažas ląstelių dalijimąsi.

G. Verbruggen et al (1995) parodė, kad sintezė ³⁵ S-arrpeKaHa žmogaus Chondrocitai augintoms agarozės DMEM be serumo buvo 20-30% sintezės stebėtas DMEM lygiu, papildytoje 10% veršiuko serumo. Autoriai nustatyti, kiek, kuriame IGF-1, IGF-2, TGF-P, arba sumažinti insulino gamybos aggrecan esančios terpėje, serumo. Autoriai išvada, kad 100 ng / ml insulino, IGF-1 arba IGF-2 dalies sumažinamos sintezė aggrecan į 39-53% kontrolės laipsnio. Su šių veiksnių deriniu nebuvo nustatyta jokių sinergetinių ar kaupiamųjų reiškinių. Tuo pačiu metu, kaip 10 ng / ml TGF-P nuo 100 ng / ml insulino buvimo stimuliuojama sintezę aggrecan iki 90% ar daugiau to atskaitos lygio. Galiausiai, transferrin serumas, atskirai arba kartu su insulinu, nepaveikė agregano sintezės. Jaučio serumo albuminas turinys aggrecan užpildų, kai pakeičiant serumas iš veršiuko žymiai sumažėjo. Sodrinimo kultūros terpė su insulinu, IGF, arba TGF-P yra dalinai atstatyti ląstelių gebėjimą gaminti aggrecan agregatus. Tokiu atveju IGF-1 ir insulinas gali išlaikyti homeostazę ląstelių kultūrose. Po to, kai 40 dienų nuo kultūros terpėje, papildomai su 10-20 ng / ml IGF-1, proteoglikanų sintezę buvo išlaikyta tame pačiame lygyje ar net didesnis, palyginti su terpę, turinčią 20% veršiuko serumo. Katabolinių procesai vyksta lėtai terpėje, papildytoje IGF-1 nei terpe, papildyta 0,1% albumino tirpalas, bet šiek tiek greičiau terpėje, papildytoje 20% serumo. Ilgaamžėse kultūrose 20 ng / ml IGF-1 palaiko stabilų ląstelių būklę.

D. Lee et al (1993), lyginant su iš mitybinės terpės sudėties poveikį (DMEM, DMEM + 20% veršiuko serumo, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) DNR sintezė iš eksplanto kremzlių, vienasluoksnėje kultūroje kultūros ir suspensijoje agarozės . Kai kultivuojamos agarozės serumo autorių buvimo pastebėtas tendenciją grupavimo chondrocitų dideliais koncentracijos. Ląstelių, be serumo ir su IGF1, išlaikyti apskritos formos agarozės, buvo surinkti mažomis grupėmis, bet ne sudaro dideles agregatus. Į monosluoksnio DNR sintezė buvo žymiai didesnis terpėje yra serumo, nei terpe, papildyta su IGF-1; DNR sintezė pastarajame buvo daug didesnė negu nepakankama aplinka. Kai kultivavimą chondrocitų suspensiją agarozės nekoncentruotus terpėje ir terpėje su IGF-1, be skirtumo DNR sintezę. Tuo pačiu metu, kai srutų kultivavimą chondrocitų agarozės terpėje, papildytoje su serumu, buvo papildo didėjantis įtraukimo radionucleotide ³ H-timidino, palyginti su kitais aplinkoje.

Vitaminas C yra būtinas aktyvinti fermentus, dalyvaujančius formuojant stabilią kolageno fibrilų spiralinę struktūrą. Chondrocytai, kurių trūkumas yra susijęs su askorbo rūgštimi, sintezuoja nehidroksilintus neheryzinius kolageno pirmtakus, kurie lėtai išskiriami. Askorbo rūgšties (50 μg / ml) įvedimas sukelia II ir IX tipo kolageno hidroksilinimą ir jų sekreciją normaliomis sumomis. Vitamino C papildymas neturėjo įtakos proteoglikanų sintezės lygiui. Vadinasi, kolageno sekrecija reguliuojama nepriklausomai nuo proteoglikanų sekrecijos.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]