Embrioninės kamieninės ląstelės

Embrioninių kamieninių ląstelių atradimas neatsirado atsitiktinai, o atsirado parengtoje mokslinių tyrimų raidos biologijos srityje dirvoje. Terminą „kamieninės ląstelės“ medicinoje 1908 m. Berlyno hematologijos draugijos kongrese vartojo Aleksandras Maksimovas, kalbėdamas apie kraujodaros ląsteles. Dar gerokai prieš išskiriant ir gaminant stabilias pluripotentines embrioninių kamieninių ląstelių linijas, ankstyvųjų vystymosi procesų tyrimuose buvo naudojamos terato- (embrioninės karcinomos) kamieninės ląstelės, kurių pagalba buvo tiriami nežinomi embriogenezės mechanizmai, įskaitant ankstyvųjų genų ir jų aktyvumo baltymų produktų raiškos seką.

Bet ar žmogaus genomo totipotencija evoliucijos procese yra negrįžtamai prarasta? Ne, ir embriogenezė yra to įrodymas. Jei taip yra, tai kada iš principo bus įgyvendintas antrasis evoliucinio vystymosi kelias? Tikriausiai, kai žmogus pateks į kosmosą, kur aplinkos sąlygos pakankamai ilgą laiką bus santykinai pastovios. Kaulinio audinio praradimas (kaulų demineralizacija nesvarumo būsenoje), kuris labai lėtai pertvarkomas ir regeneruojamas, gali būti laikomas pirmuoju žmogaus, kaip rūšies, adaptacijos egzistencijai kosmoso sąlygomis proceso žingsniu. Tačiau antrojo evoliucinio vystymosi kelio kaina bus kitokia – totipotencijos ir absoliutaus plastiškumo grąžinimo visoms ląstelėms kaina bus sterilumas. Taigi, šiame „evoliucinių chameleonų“ pasaulyje turėsime daugintis be mejozės, pumpuruodamiesi. Bet gyvensime ilgai. Telomerazės nemirtingumas yra amebos nemirtingumas. Daugialąsčiuose organizme kamieninės ląstelės yra kiekybinio ir kokybinio ilgaamžiškumo substratas.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Embrioninių kamieninių ląstelių šaltiniai

Šiandien laboratoriniams tyrimams skirtų embrioninių kamieninių ląstelių šaltiniai yra pelių teratokarcinomos linijos (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ir žmogaus teratokarcinomos (NTERA-2, TERA-2, H-9 klonas), taip pat Trauneon ESC linijos. Tačiau išsamaus ląstelių paso, kuriame nurodytas imuninis fenotipas, chromosomų analizės rezultatai, mRNR raiškos profiliai, veikiami receptoriai ir tarpląsteliniai signaliniai baltymai, prieinamumas nekompensuoja reikšmingų teratokarcinomos ESC linijų trūkumų – greito totipotencijos praradimo ir negalėjimo jų naudoti klinikiniuose tyrimuose, o mišri diferenciacija kultūroje labai apsunkina grynos specializuotos linijos išskyrimą iš heterogeninės ląstelių populiacijos. Todėl klinikiniais tikslais sukurtų ESC linijų šaltinis paprastai yra blastocistos vidinė ląstelių masė, atskiri 8 ląstelių stadijos embrionų blastomerai, vėlesnių stadijų morulų ląstelės, taip pat pirmykštės gemalo ląstelės.

Reikėtų pažymėti, kad teratokarcinomos ląstelės, nors ir pasižymi pluripotentiškumo savybe, pasižymi žymiai mažesniu pluripotentiniu potencialu, palyginti su ESC. Jų integracija su embrioninėmis ląstelėmis retai veda prie chimerų susidarymo, kurios, be to, niekada nesudaro gametų su teratokarcinomos ląstelių genotipu. Manoma, kad taip yra dėl dažno chromosomų anomalijų atsiradimo auginant teratokarcinomos ląsteles: Y chromosomos praradimo, įvairių trisomijų, delecijų ar translokacijų.

Ne kartą bandyta išskirti žmogaus ESC liniją, tačiau ši užduotis nebuvo išspręsta, nes normalias žmogaus blastocistas sunku pasiekti. Be to, chromosomų anomalijų dažnis žmonėms yra didesnis nei gyvūnų embriogenezės metu. Didžioji dauguma ankstyvųjų žmogaus embrionų, gautų po apvaisinimo mėgintuvėlyje, pasižymi chaotišku chromosomų mozaicizmu ir dažnai turi skaitinių bei struktūrinių aberacijų. Net ir vėliau, blastocistos stadijoje, tik 20–25 % žmogaus embrionų sudaro ląstelės su normaliu kariotipu. Tokių embrionų naudoti ESC sukūrimui buvo praktiškai neįmanoma, nes zigotos paprastai buvo kultivuojamos iki dviejų ar keturių blastomerų stadijos, o vėliau persodinamos į gimdą. Tik palyginti neseniai buvo sukurta patikima apvaisintų žmogaus kiaušinėlių kultivavimo iki blastocistos stadijos technika. Šios technikos įdiegimas į apvaisinimo mėgintuvėlyje praktiką ne tik padidino sėkmingų implantacijos rezultatų dažnumą, bet ir padarė normalias blastocistas prieinamesne vieta.

Kitas pluripotentinių kamieninių ląstelių šaltinis yra pirmykštės gemalo ląstelės, kurios, skirtingai nei labiau išsivysčiusios gemalo epitelio pirmtakų populiacijos, savo paviršiuje neturi beta-integrino, tačiau pasižymi dideliu šarminės fosfatazės aktyvumu. Reikėtų pažymėti, kad iš pirmykščių gemalo ląstelių susiformavusių kamieninių ląstelių populiacijos eksperimentiškai tiriamos nuo devintojo dešimtmečio. Tuo metu buvo sukurta technika, skirta pirmykščių gemalo ląstelių išskyrimui iš pelės embriono lytinės liaukos užuomazgos. Pirmieji nesėkmingi pirmykščių gemalo ląstelių kultivavimo in vitro rezultatai parodė šių bandymų beprasmiškumą, nes ląstelės, nors ir išgyveno, neproliferavo ir žuvo per pirmąją dieną. Vėliau nustatyta, kad pelių pirmykščių gemalo ląstelių dauginimasis in vitro vyksta tik esant tirpiems ir prie membranos surištiems specifiniams polipeptidiniams augimo faktoriams kultūros terpėje. Daugelio tyrimų rezultatai parodė, kad pirminių gemalo ląstelių išgyvenimui ir proliferacijai kultūros terpėje būtinas ne tik LIF, bet ir prie membranos surištų bei tirpių plieno faktorių (SIF) buvimas. Šiuos peptidus gamina somatinės ląstelės embrionuose, homozigotiniuose Steel mutacijos atžvilgiu, ir vienas iš jų yra cKit protoonkogeno ligandas.

Žinduolių ir žmonių pirminės gemalo ląstelės yra ekstragonadinės kilmės ir yra gemalo ląstelių linijos kloninio vystymosi šaltinis. Pirmykštės gemalo ląstelių linijos, kaip ir visų embrioninių audinių bei ekstraembrioninės mezodermos, kilmė yra ankstyvųjų embrionų epiblastas (pirminis ektodermas), turintis mozaikinę struktūrinę organizaciją. Mikrochirurginiu būdu pašalinus įvairias ankstyvojo embriono dalis, buvo nustatyta pirmykštių gemalo ląstelių pirmtakų klono lokalizacijos zona epiblaste. Naudojant rodamino dekstraną, kuris buvo naudojamas kaip ląstelių žymuo, nustatyta, kad pirmykštių gemalo ląstelių pirmtakai yra lokalizuoti proksimalinėje epiblasto srityje, šalia ekstraembrioninės ektodermos. Pirmykštė gemalo ląstelių linija kyla iš 45 ląstelių klono, kurio išsiskyrimas vyksta pačioje gastruliacijos pradžioje. Tada klonas atsiskiria, o gastruliacijos metu pirminės gemalo ląstelės patenka į ekstraembrioninę mezodermą ir randamos alantojo rudimento apačioje, už pirminės juostelės. Iš ten pirminės gemalo ląstelės migruoja link užpakalinės žarnos endodermos ventralinės dalies, o tada aktyviai juda palei žarnas, migracijos pabaigoje užpildydamos lytinius keterus. Migracijos metu, taip pat per pirmąsias 2–3 lokalizacijos dienas lytinės liaukos užuomazgoje, pirminės gemalo ląstelės aktyviai dauginasi ir patiria aštuonis replikacijos ciklus. Jei migracijos pradžioje yra apie 50 pirminių gemalo ląstelių, tai dvylikos dienų vystymosi pelių embrionų lytiniuose keteruose pirminių gemalo ląstelių skaičius viršija 25 000.

ESL ir pirmykščių gemalo ląstelių funkcinį panašumą įrodo visiškas pastarųjų integravimas į blastocistą, pakeičiant vidinę ląstelių masę ir vėlesnį visavertį embriono vystymąsi, kurio audinius sudaro tik pirmykščių gemalo ląstelių palikuonys. Kitomis savybėmis pelių pirmykščių gemalo ląstelės taip pat pasirodė esančios identiškos ESL, demonstruodamos gebėjimą diferencijuotis įvairiomis kryptimis, formuoti embrioninius kūnus in vitro ir formuoti teratomas in vivo, kai jos suleidžiamos po oda imunodeficito turinčioms pelėms, panašias į savaimines sėklidžių teratomas 129/ter pelėms.

Nustatyta, kad į terpę įdėjus LIF, membranoje surišto ir tirpaus SIF, izoliuotos 8 dienų amžiaus pelių embrionų pirminės gemalo ląstelės kultūroje išgyvena ir dauginasi 4 dienas, bet po to žūsta. Be to, laikotarpis, kai kultūroje stebima pirminių gemalo ląstelių žūtis, sutampa su pelių embrionų vystymosi stadija (12,5–13,5 dienos), kai moteriškos pirminės gemalo ląstelės lytinių liaukų užuomazgose patenka į mejozę, o vyriškose pirminėse gemalo ląstelėse blokuojamas mitozinis dalijimasis. Tačiau į terpę įdėjus ne tik augimo faktorius LIF ir SIF, bet ir FGF2, pirminės gemalo ląstelės toliau dauginasi, o subkultūrose susidaro ląstelių kolonijos, galinčios daugintis net ir pašalinus augimo faktorius (SIF ir FGF) iš terpės. Tokias ląsteles ilgą laiką galima kultivuoti embrioninių fibroblastų substrate, nepridedant tirpaus augimo faktoriaus LIF. Buvo pasiūlyta šias stabilias ląstelių linijas, gautas iš pirmykščių gemalo ląstelių, vadinti embrioninėmis gemalo ląstelėmis. Šis terminas visiškai nepasiteisina, nes kultivuojant EG ląsteles neįmanoma gauti embrioninių gemalo ląstelių, galinčių atlikti vėlesnius oogenezės ar spermatogenezės etapus. Taip yra todėl, kad EG ląstelių linijos, nors ir kilusios iš pirmykščių gemalo ląstelių, tačiau kultūroje įgydamos embrioninių pluripotentinių kamieninių ląstelių savybes, praranda gebėjimą įsipareigoti gemalo linijoms. Kitaip tariant, kultivuojamos pirmykščių gemalo ląstelių savybės praranda gametų pirmtakų savybes ir transformuojasi į ESC tipo pluripotentines ląsteles.

Pastebėta, kad teratomos neatsiranda, kai EG ląstelės įvedamos į imunodeficitą turinčias peles. Manoma, kad žmogaus EG ląstelių gebėjimo sukelti teratomas praradimas atsiranda dėl to, kad šios linijos nebuvo sukurtos tiesiogiai iš kultivuotų pirminių gemalo ląstelių, o buvo gautos iš ląstelių, išskirtų iš embrioninių kūnų. Todėl gali būti, kad jos yra pluripotentiškų, bet jau įsitvirtinusių ląstelių palikuonys.

Reikėtų pažymėti, kad yra esminių skirtumų tarp EG ląstelių ir pirminių gemalo ląstelių. Pastarosios neleidžia gauti chimerinių pelių embrionų, o tai rodo, kad pirminės gemalo ląstelės nesugeba integruotis į vidinę ląstelių masę ar trofektodermą. Pirminių gemalo ląstelių populiacijos charakteristikos yra panašesnės į vėlesnių embrionų somatinių ląstelių linijas, kurių įvedimas į blastocistą taip pat nesukelia chimerinių embrionų susidarymo.

Modifikavus embrioninių kūnelių, gautų agreguojant EG ląsteles, kultivavimo techniką, buvo galima gauti kitą pluripotentinių ląstelių populiaciją, vadinamą „iš embrioninių kūnų gautomis ląstelėmis“ (EBD ląstelėmis), naudojant atranką selektyviose terpėse. EBD ląstelių gebėjimas ilgą laiką daugintis kultūroje leido sukurti stabilias atsidavusių ląstelių linijas. Buvo gauti ląstelių klonai, ekspresuojantys platų specializuotų ląstelių mRNR ir baltymų žymenų spektrą. Šis metodas galiausiai įrodė, kad žmogaus pirminės gemalo ląstelės yra pluripotentinės ir in vitro diferencijuojasi į skirtingus ląstelių tipus: neuronus, neurogliją, kraujagyslių endotelį, kraujodaros ląsteles, raumenų ir endodermines ląsteles.

Alternatyvūs embrioninių kamieninių ląstelių šaltiniai

Alternatyvus žmogaus ESC linijų šaltinis gali būti hibridinės ląstelės. Implantuojant į pseudonėščių karvių gimdą heterogeninę konstrukciją, gautą elektroporacijos būdu suliejus žmogaus vaisiaus somatines ląsteles su karvės kiaušinėliu, iš kurio prieš tai pašalintas probranduolis, galima gauti vidinę ląstelių masę iš dirbtinio embriono, turinčio priešimplantacinę vystymosi stadiją. Šiuo tikslu pirmajame etape iš karvės kiaušinėlio su persodintu žmogaus ląstelių branduoliu gaunama blastocista.

Antrajame etape iš blastocistos išskiriamas embrioblastas, o iš jo Thomsono metodu išskiriamos ESL. Pažymėtina, kad geriausi ESL linijų išskyrimo šiuo metodu rezultatai gauti naudojant folikulinių ląstelių arba pirminių gemalo ląstelių, kurios žmogaus organizme lieka žiemos miego būsenoje, branduolius. Taip yra todėl, kad į karvės kiaušinėlį persodintų žmogaus ląstelių branduoliai turi turėti nesutrumpintas telomeras ir didelį telomeazės aktyvumą, kuris padeda išvengti priešlaikinio iš hibridinio kiaušinėlio gautų ESL klonų senėjimo (Repin, 2001). Yra žinoma, kad svarbiausi ESL tarpląsteliniai žymenų baltymai yra Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, kurie priklauso vadinamiesiems chromatino duslintuvų baltymams. Duslintuvai suteikia ypač kompaktišką heterochromatino paketą, kuris neleidžia susidaryti euchromatino kilpoms. Šių baltymų tarpininkaujamas chromatino pakavimas koreliuoja su ESL genomo totipotencija. Iki šiol nustatyta, kad subrendę galvijų ir žmogaus oocitai yra vienintelė specializuotų ląstelių rūšis, kurioje citoplazmoje yra didelė duslintuvų baltymų koncentracija. Remiantis tuo, buvo sukurtas hibridinių ESC gavimo metodas, perkeliant somatinių ląstelių branduolius į enukleuotus galvijų oocitus. Preliminarūs in vitro tyrimai parodė, kad galvijų oocitų citoplazma atkuria žmogaus somatinių ląstelių branduolių genomo totipotenciją po 12–24 valandų kultivavimo.

Ypač įdomūs yra duomenys apie žmogaus embrionų preimplantacinio vystymosi ypatumus, rodančius vėlesnį totipotentinių ląstelių pakeitimą pluripotentinių ląstelių populiacija nei pelėse. Ląstelių transformacijų tyrimas parodė, kad trofoblastų ląstelės, be ESC, taip pat atsiranda iš žmogaus blastocistų vidinės ląstelių masės ląstelių, o tai rodo jų bendrą potencialą.

Yra žinoma, kad blastocistos stadijoje susidaro dvi skirtingai išsidėsčiusios ląstelių populiacijos. Viena iš jų sudaro išorinį blastocistos sluoksnį – trofektodermą, kurios dariniai yra trofoblastų ląstelės ir kiti embrioniniai placentos komponentai. Antroji ląstelių populiacija susigrupuoja į tankią masę, besiliečiančią su vidiniu trofektodermos paviršiumi. Vidinės ląstelių masės ląstelių populiacijos dariniai yra visi embriono organų audiniai ir užuomazgos. Vėlyvosios blastocistos stadijoje iš vidinės ląstelių masės susidaro ekstraembrioninė endoderma ir susidaro epiblastas (pirminė ektoderma). Šiuo atveju epiblasto ląstelės išlaiko pluripotenciją, o gebėjimas diferencijuoti ekstraembrioninės endodermos ląsteles yra ribotas.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių gavimas

Iki šiol buvo manoma, kad ESC gauti iš trofoblastų neįmanoma. Tačiau iš blastocistos išskirta diploidinių trofektodermos kamieninių ląstelių linija terpėje, kurioje yra FGF2 ir heparino vietoj LIF, dauginasi ir transformuojasi į kamienines ląsteles. Jei FGF2 pašalinamas iš terpės, trofektodermos ląstelės nustoja daugintis, jose prasideda chromosomų endoreduplikacija, o trofektodermos ląsteliniai elementai palaipsniui transformuojasi į milžiniškas trofoblastų ląsteles. Tikriausiai LIF nestimuliuoja trofektodermos ląstelių proliferacijos dėl to, kad FGF2 sukelia kitokį transsignalizacijos mechanizmą, nes FGF2, prisijungdamas prie plazmos receptoriaus (FGFR2), citoplazmoje aktyvuoja MAP kinazes – ERK1 ir ERK2. Taigi, blastocistos ląstelėse įjungus vieną signalizacijos kelią (LIF - gpl30 - JAK kinazė - STAT3), vidinės ląstelių masės ląstelės transformuojamos į pluripotentines ESC, o aktyvavus antrąjį transmembraninio signalo perdavimo mechanizmą (FGF2 - FGFR2 - MAP kinazė ERK1/ERK2), blastocistoje susidaro trofektodermos kamieninės ląstelės. Signalizacijos kelio pasirinkimas, savo ruožtu, priklauso nuo oct4 geno aktyvumo. Šis genas, priklausantis POU domenui, yra 17 autosomos t lokuse ir yra ekspresuojamas oogenezės metu, skilimo laikotarpiu, taip pat blastocistos vidinės ląstelių masės ląstelėse ir pirminėse gemalo ląstelėse. Funkcinis oct4 geno vaidmuo yra koduoti transkripcijos faktorių, būtiną pluripotentinėms ląstelėms atsirasti, jų diferenciacijai ir dediferenciacijai.

Oct4 geno raiška ESC kinta priklausomai nuo šio transkripcijos faktoriaus sąveikos su kofaktoriais. Kryptingas oct4 raiškos reguliavimas blastocistose parodė, kad sumažėjus jo aktyvumui, pusė ląstelių suformuoja trofektodermą, o padidėjus indukuotai oct4 raiškai, daugiausia susidaro ESC.

Eksperimento metu ESL negalima perkelti į liniją kultivuojant totipotentines blastomeras skilimo stadijoje, taip pat gastruliacijos stadijoje ir vėlesniuose embriono vystymosi etapuose. Pelių ESL paprastai išskiriamos 3,5–4,5 nėštumo dieną, kuri atitinka šeštąją (vienasluoksnė blastocista) ir septintąją (dvisluoksnė blastocista – ankstyvasis kiaušinėlio cilindras) normalios embriogenezės stadijas. Akivaizdu, kad tik preimplantaciniu laikotarpiu pelių embrionuose yra ląstelių populiacijų, galinčių transformuotis į ESL. Todėl ESL linijų išskyrimas įmanomas tik tam tikruose embriogenezės etapuose. Skilimo metu atsirandančios zigotos ir blastomeros yra totipotentinės, atsižvelgiant į galimybę išsivystyti gyvybingam embrionui su embrioninėmis membranomis ir placenta. Bendras gemalo ląstelių potencialo praradimas prasideda vėlyvojoje morulos stadijoje, kai tolesnis blastomerų įsipareigojimas priklauso nuo jų vietos. Ankstyvieji morulos blastomerai išlaiko totipotenciją, nes eksperimentinės manipuliacijos su jų lokalizacijos pokyčiais, pavyzdžiui, jų vietos inversija, netrukdo vystytis visaverčiam embrionui.

Nustatyta, kad ESL išskyrimo į liniją efektyvumą įtakoja blastocistų būklė jų eksplantacijos metu. Blastocistų panaudojimas sumodeliavus septynių dienų diapauzę pelių, kurioms 3,5 nėštumo dienos buvo atlikta ovariektomija ir duotas progesteronas, reprodukciniame trakte, palengvina sėkmingesnį embrioninių kamieninių ląstelių linijų išskyrimą. Daroma prielaida, kad tokiomis sąlygomis padidėja vidinę ląstelių masę sudarančių blastomerų skaičius. Taip pat gali būti, kad pailgėja ląstelių ciklas ir dauguma blastomerų pereina į G0 fazę.

Be to, stabilių pluripotentinių ESC linijų sukūrimas priklauso nuo embrionų genotipo: ESC gana lengvai išskiriamos iš 129 pelių linijos blastocistų, jas daug sunkiau gauti naudojant CS7BL/6 peles, o praktiškai neįmanoma išskirti ESC linijos iš CBA/Ca pelių blastocistų. Akivaizdu, kad ankstyvieji embrionai turi tam tikrų genetinių savybių, kurios turi įtakos pluripotentinės ESC linijos vystymuisi. Nepaisant to, kultivuojant izoliuotus epiblastus, taip pat selektyviai atrenkant diferencijuotas ląsteles, ESC linijos vis tiek buvo išskirtos iš ankstyvųjų CBA/Ca pelių embrionų.

Patikrintas standartinis ESC linijų gavimo iš blastocistų metodas pateiktas laboratoriniuose vadovuose apie eksperimentų su ankstyvaisiais embrionais techniką. Eksperimentines ESC linijas taip pat galima gauti kultivuojant izoliuotą 4,5 dienos amžiaus pelių embrionų epiblastą (pirminę ektodermą), naudojant gana sudėtingą mikrochirurginę techniką ir modifikuotas kultivavimo sąlygas. Šios procedūros darbo intensyvumas yra pateisinamas, nes ESC linijų formavimosi dažnis šiuo atveju pasirodė esąs žymiai didesnis nei darbuose su blastocistos vidine ląstelių mase.

Norint išskirti ESC linijas, kiekvienas klonas perkeliamas į mikrošulinėlį, auginamas 40–60 ląstelių agregatas, o po to vėl disperguojamas. Daugkartiniai šios procedūros pakartojimai leidžia gauti nemirtingą ESC liniją su maksimaliu prie plastiko pritvirtintų normokariotipinių ląstelių proliferacijos greičiu, kurios išlaiko totipotenciją ir aukštą telomerazės aktyvumą po 50–100 pasažų. ESC linijų priežiūros procese didžiausias pavojus yra terpės ar serumo užterštumas bakteriniais endotoksinais – net ir maža endotoksino koncentracija kultūros terpėje sukelia masinę nesubrendusių gemalo ląstelių žūtį. Atidžiai stebint linijinį augimą ir laiku disperguojant, ESC kultūroje geba simetriškai dalytis, kai abi dukterinės ląstelės išlieka pluripotentiškos ir gali atlikti neribotą skaičių ląstelių ciklų, išlaikydamos diploidinį kariotipą ir bendrą potencialą.

Grynos žmogaus ESC populiacijos atranka gali būti atliekama transfekavus jų genomą rekombinantinėmis DNR molekulėmis, turinčiomis geną, koduojantį žaliai fluorescencinio baltymo (GFP) sintezę. GFP ekspresija padidėja, kai ESC auginamos sąlygomis, kurios skatina jų proliferaciją, o prasidėjus diferenciacijai šio geno ekspresijos lygis sumažėja, o tai leidžia atrinkti grynas, stabilias pluripotentines ląstelių linijas selektyvioje terpėje. Kultivuojant ESC, išskirtas naudojant GFP atranką, kolonijų susidarymo dažnis daug kartų padidėja, nes atrankos kultūrų sąlygomis eliminuojamas galingas diferencijuotų ląstelių antiproliferacinis poveikis.

Žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių transliacija į liniją atliekama jų išskyrimo iš preimplantacinių embrionų (80–120 ląstelių stadijoje), likusių po apvaisinimo mėgintuvėlyje procedūros, metodu. Šiuo tikslu dirbtinai gauti „pertekliniai“ embrionai mechaniškai disperguojami Delbecco-Eagle terpėje. Pažymėjus ląsteles selektyviais monokloniniais antikūnais su fluorescenciniu žymekliu, izoliuojamos embriono blastų ląstelės. Embrioblastai disperguojami į atskiras ląsteles naudojant dispazės-kolagenazės mišinį. Išskaidytos ląstelės auginamos specialioje terpėje (80 % Delbecco terpės + 20 % vaisiaus veršelio serumo, esant 500 μg/ml IL-6, LIF ir SCF) ant pirmųjų 3 pasažų embrioninių fibroblastų maitinamojo monosluoksnio. Šiuo atveju kamieninių ir progenitorinių ląstelių išgyvenimas ir proliferacija palaikoma dėl IL-6, LIF ir SCF poveikio. Tokioje terpėje ESC auga kaip neprisijungusių kamuoliukų formos ląstelių suspensijos klonai, kuriuos reikia atskirti minkštu, pakartotiniu pipete. Nauji klonai suspenduotoje kultūroje atsiranda 5–7 dieną. Didžiausias ESC augimo greitis pasiekiamas pakartotinai disociuojant klonus 10–15 ląstelių stadijoje. Tada kiekvienas klonas perkeliamas į mikroduobutę ir auginamas iki 40–50 ląstelių agregato. Procedūra kartojama daug kartų persėjant, didinant kultūros tūrį iki 5–10 milijonų ląstelių tankio 6 cm lėkštelėje. Naudodamas tokį persavimą, Thomson išskyrė 10 nemirtingų žmogaus ESC klonų, kurie po 100 persėjimų išlaikė aukštą telomerazės aktyvumą, gebėjimą energingai proliferuoti, minimalias fenotipines savybes ir bendrą potencialą su gebėjimu diferenciuotis į bet kurią iš 350 specializuotų ląstelių linijų, gautų iš ekto-, mezo- ir endodermos. Žmogaus ESC diferenciacija prasidėjo (pakeitus terpę, pridėjus serumo ir pašalinus LIF) ląstelėms prisijungus prie substrato, o tai rodo citoskeleto vystymąsi ir adhezijos receptorių ekspresiją. Svarbu tai, kad esant neribotai proliferacijai, žmogaus ESC išlaikė normalų kariotipą.

Antrasis žmogaus ESC linijų išskyrimo metodas pagrįstas pirminių gemalo ląstelių naudojimu. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad E ląstelių linijas galima gauti iš 12,5 dienos amžiaus pelių embrionų lytinių raukšlių. Tačiau šiais atvejais progenitorinių ląstelių linijų susidarymo dažnis buvo žymiai mažesnis nei eksperimentuose su ankstesniais embrionais. Tuo pačiu metu pirminės gemalo ląstelės iš 13,5 nėštumo dienos amžiaus pelių embrionų lytinių liaukų visiškai nesugeba transformuotis į linijas.

Pirmosios stabilios pluripotentinių žmogaus EG ląstelių linijos buvo gautos iš pirminių gonocitų, išskirtų iš 5–9 savaičių amžiaus embrionų lytinių liaukų. Izoliuotos ląstelės buvo kultivuojamos inaktyvuotų pelių embrioninių fibroblastų substrate DMEM terpėje su vaisiaus serumu, papildytu merkaptoetanoliu, forskolinu ir rekombinantiniais žmogaus augimo faktoriais (FGF ir LIF). Po 7–12 dienų kultūroje atsirado daugialąsčių kolonijų, kurios pagal morfologinius požymius ir molekulinius žymenis atitiko žmogaus EG ląsteles. Po agregacijos šios ląstelės suformavo embrioninius kūnus, kuriems toliau vystantis atsirado specializuotos ląstelės, būdingos visų trijų gemalo sluoksnių dariniams. Per 10–20 pasažų EG ląstelių linijos išlaikė normalų kariotipą ir neprarado pluripotentiškumo.

Taip pat įrodyta, kad LIF, membranoje surištų ir tirpių Steel faktorių bei TGF-b bendras veikimas keičia pirminių gemalo ląstelių vystymosi programą. Užuot nutraukusios mitozinį dalijimąsi ir pradėjusios diferenciuotis oogenezės arba spermatogenezės link, pirminės gemalo ląstelės toliau dauginasi. Po kelių papildomų mitozinių ciklų jos tampa panašios į epiblastines ląsteles ir, prarasdamos gemalo ląstelių pirmtakų savybes, transformuojasi į pluripotentines embrionines kamienines EG ląsteles.

Taigi, 1998 m. iš žmogaus vaisiaus autopsijos audinio lytinių organų rudimento pirmą kartą buvo išskirtos įamžintos pirminių gemalo ląstelių linijos. Žmogaus embriogenezės metu pirminės gemalo ląstelės atsiranda trynio maišelyje 3-iąją vystymosi savaitę, o 4–5-ąją savaitę šios ląstelės migruoja į lytinių organų gumburėlio zoną, kur sudaro ramybės būsenos pirminių gonocitų populiacijas. Neaktyvioje būsenoje pirminės gemalo ląstelės embrione išsaugomos iki gimimo. Pirminių gemalo ląstelių linijos išskiriamos iš 5–9 savaičių embrionų vaisiaus lytinių organų gumburėlio, kurio išskirtas audinys ex tempore apdorojamas IV–V tipų kolagenazių, hialuronidazės ir DNazės mišiniu, siekiant padidinti kiekybinį ir kokybinį ląstelių derlių. Vaisiaus lytinių organų gumburėlio audinyje esančias pirmines gemalo ląsteles supa stromos (mezenchiminės) Sertoli ląstelės. Sertoli ląstelių funkcinė paskirtis – gaminti antiapoptotinius faktorius (Fas ligandas), mitogenus ir imunosupresantus, kurie apsaugo gemalo ląsteles nuo organizmo imuninio atakos. Be to, lytinių ląstelių brendimui svarbų vaidmenį atlieka lytinių organų gumburėlio stromos mikroaplinka. Izoliuotos pirminės gemalo ląstelės į kultūrą sodinamos ant maitinamojo stromos sluoksnio, kurį sudaro pirmųjų trijų pasažų vaisiaus fibroblastai. Veiksmingiausias mitogenų derinys yra kompleksas, susidedantis iš LIF, FGF ir forskolino (cAMP susidarymo stimuliatoriaus). Pirminių gemalo ląstelių proliferacijai in vitro reikia pridėti vaisiaus serumo, kurio metu pirminių gonocitų dauginimasis kultūroje lydimas sferinių ląstelių, neprisijungusių prie substrato, klonų susidarymo.

JAV Nacionaliniuose sveikatos institutuose, remiantis esamų duomenų apie žmogaus ESC linijų išskyrimo iš blastocistų metodus santrauka, buvo padaryta preliminari išvada, kad sėkmingas ESC išskyrimas greičiausiai pasiekiamas kultivuojant blastocistas su gerai susiformavusia vidine ląstelių mase (Kamieninės ląstelės: mokslinė pažanga ir būsimos tyrimų kryptys. Nat. Inst, of Health USA). Šiuo požiūriu optimalus ESC šaltinis linijoms kurti yra žmogaus blastocistos 5-ąją vystymosi dieną, iš kurių, izoliuojant vidinę ląstelių masę, trofektoderma turėtų būti atsargiai pašalinta. Izoliuota vidinė ląstelių masė, šiame etape sudaryta iš 30–35 ląstelių, turėtų būti kultivuojama embrioninių pelių fibroblastų substrate, o tai yra lemiama ESC kolonijų susidarymo kultūroje sąlyga.

Embrioninių kamieninių ląstelių fenotipinių savybių analizė

Ypač įdomi yra tarprūšinė ESL fenotipinių savybių lyginamoji analizė. Nustatyta, kad žmogaus ESL kolonijos yra tankios suplokštėjusių, epitelio tipo ląstelių sankaupos, o pelių embrionų kūnai sudaryti iš laisvo apvalių ląstelių konglomerato. Žmogaus ESL branduolio ir plazmos santykio indeksas yra mažesnis nei pelių ESL. Beždžionių embrioninės kamieninės ląstelės sudaro plokštesnes ląstelių kolonijas su nelygiais kraštais. Atskiros ląstelės yra lengvai matomos ankstyvuosiuose primatų ESL klonuose. Visų tirtų gyvūnų rūšių proliferuojančios ESL neekspresuoja I ir II klasės MHC molekulių. Tuo pačiu metu žmogaus ESL teigiamai reaguoja į TERA 1-60 ir GCTM-2 antikūnus, o tai rodo keratino/chondroitino sulfato proteoglikanų buvimą jų paviršiuje, būdingą embriono(terato)karcinomos kamieninėms ląstelėms. Oct4 geno ekspresija visų gyvūnų rūšių ESL rodo, kad, nepaisant fenotipinių skirtumų, žmogaus ir pelių ESL, matyt, aktyvuojamas tas pats genų rinkinys, atsakingas už pluripotentiškumo palaikymą (Peru, 2001). Be to, iš žiurkių, kiaulių, triušių, primatų ir galvijų embrionų išskirtos ESC linijos pasižymi panašiomis morfologinėmis savybėmis, panašiu molekulinių identifikavimo žymenų rinkiniu ir beveik identišku molekuliniu embriogenezės programų įgyvendinimo mechanizmu, o tai leidžia mums naujai pažvelgti į ksenotransplantacijos problemą.

Skirtingai nuo įprastos embriogenezės in vivo, ESL proliferacija in vitro nėra lydima gemalinių sluoksnių formavimosi ir vyksta blokuojant homeotinius Hoxgenus, t. y. be organogenezės. Kadangi segmentacijos genai neveikia, ESL kultūroje neįmanoma atkurti tokių embriogenezės laikotarpių kaip somitų padėjimas, embriono segmentacija, trynio maišelio, alantoiso ir kitų laikinųjų organų bei audinių formavimasis. Kultūrinės ESL, atrodo, užšalo 350 specializuotų ląstelių restrikcijos linijų formavimosi proceso pradžioje. Taigi, dukterinių progenitorinių ląstelių klonas ir centre lokalizuota ESL yra tik embriono modelis, kurio vystymosi metu skirtinguose audinių regionuose vienu metu formuojasi skirtingos specializuotų ląstelių linijos, kurios, tačiau, kyla iš bendrų pirmtakų. Nepaisant minimalaus receptorių lygio ESL paviršiuje, jos išlaiko gebėjimą vykdyti primityvius morfogenetinius procesus, imituodamos ankstyvojo embriono tūrines struktūras: ESL suspensija kultūros agregatuose sudaro struktūras, primenančias blastocistas ar net vėlesnius embrionus (kiaušinių cilindrus). Tokie suspensijos agregatai atitinkamai vadinami paprastais ir sudėtingais embriono kūnais.

Mišrios diferenciacijos metu ankstyvieji ektodermos (oct3, fgf-5, nodal), endodermos (gata-4), mezodermos (brachyury), kardiogeninės mezodermos (pkh-2.5), nervinio vamzdelio (msx3) ir hematopoezės (elkf) genai vienu metu ekspresuojami skirtingose vieno embriono kūno ląstelėse. Naudojant įvairius augimo faktorių ir citokinų derinius tiksliniam poveikiui gemalo sluoksnio ląstelių formavimuisi in vitro, daugeliu atvejų buvo įmanoma gauti embriono kūnus, kuriuose pirmenybę teikė ektodermos arba mezodermos genai, o tai atveria kelią gastruliacijos ir pradinių organogenezės fazių modeliavimui.

ESL kloninis augimas yra asimetrinio ląstelių dalijimosi požymis, kai tik viena ESL klono centre išlaiko neribotą proliferacijos potencialą, o antroji dukterinė ląstelė generuoja pirmtakinių ląstelių, kurios jau diferencijuojasi, kartą. Todėl klono proliferacijos greitis embriono kūno periferijoje yra didesnis nei centre. Augančio klono kraštinės ląstelės patiria savaiminę netvarkingą diferenciaciją, migruoja arba žūsta dėl apoptozės mechanizmų. Šie įvykiai lemia klono likimą: jei proliferacijos greitis viršija migracijos ir apoptozės ląstelių mirties greitį, klonas toliau didėja, stabilizacija įvyksta, kai apoptozės greitis ir naujų ląstelių susidarymo greitis yra vienodi, o regresija įvyksta, kai šių procesų santykis yra atvirkštinis. Progenitorinės ląstelės dalijasi simetriškai, t. y. abi dukterinės ląstelės vėliau diferencijuojasi į subrendusias specializuotas ląstelių linijas. ESL ir progenitorinių ląstelių santykis kinta, tačiau ESL skaičius visada sudaro tik nedidelę procento dalį progenitorinių ląstelių populiacijos. Todėl tik kruopštus pipetavimas ir savalaikis klonų išardymas gali padidinti ESL skaičių kultūroje. Klonų dezagregacija 10–12 ląstelių stadijoje pasirodė esanti efektyviausia siekiant gauti maksimalų ESC derlių. Embrioidinio kūno ląstelių diferenciacijos kryptis ir laipsnis priklauso nuo jų vietos. Išorinės embriono kūno ląstelės neekspresuoja oct4 geno ir diferencijuojasi į pirminės endodermos ląsteles, iš kurių vėliau susidaro epitelio tipo parietalinės ir visceralinės ekstraembrioninės endodermos ląstelės. Vidinės embriono kūno ląstelės ekspresuoja oct4 geną ir išlaiko pluripotenciją 48 valandas kultivavimo. Tačiau tada kultūra morfologiškai pertvarkoma į epitelio monosluoksnį ir prasideda genų, kontroliuojančių pirminės ektodermos vystymąsi, raiška. Toliau prasideda visiškos netvarkingos citodiferenciacijos procesas, kai atsiranda įvairių ląstelių tipų, kurie yra visų trijų gemalo sluoksnių dariniai. Embrioidinio kūno ląstelių savaiminės diferenciacijos procese pirmiausia atsiranda agregatai su endodermos žymenimis trynio maišelio fragmentų (cistų) pavidalu. Tuomet šiose struktūrose atsiranda augančių kapiliarų angioblastai ir endotelio ląstelės. Paskutinėse savaiminės diferenciacijos stadijose iš embriono kūno vidinių ląstelių išsivysto įvairios galutinai diferencijuotos ląstelės, įskaitant neuronus, glijos elementus, kardiomiocitus, makrofagus ir eritrocitus. Tam tikru mastu (atsižvelgiant į gemalinių audinių sluoksnių formavimosi erdvinę inversiją), naudojant embriono kūnus, galima in vitro tirti morfogenetinius procesus ir analizuoti pradinių embriono citodiferenciacijos laikotarpių molekulinius mechanizmus.taip pat nustatyti konkrečių genų vaidmenį įgyvendinant šiuos procesus.

Taigi, klone yra ląstelių, kuriose atrastos skirtingos genetinio vystymosi programos – ESL, ankstyvieji pirmtakai ir diferencijuojasi pirmtakų populiacijos. ESL kultivavimas pakabinimo lašo arba masinės kultūros metodais be maitinamojo sluoksnio ir nepridedant LIF į terpę neišvengiamai veda prie embrioninių kūnelių susidarymo. Embrioninių kūnelių išorinio ir vidinio sluoksnių ląstelių morfologija skiriasi. Išorinį sluoksnį sudaro didelės, šakotos ląstelės. Jų paviršius, nukreiptas į aplinką, yra padengtas daugybe mikrogaurelių. Išorinį ląstelių sluoksnį nuo vidinio sluoksnio skiria pamatinė membrana, panaši į Reicherto membraną, o embrioninių kūnelių vidinio sluoksnio ląstelės yra stulpelinis epitelis. Morfologiškai vidinis sluoksnis, nors ir jame yra daug besidalijančių ląstelių, labiau primena nediferencijuotas ESL kolonijas.

Žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių charakteristikos

Parenchiminių-mezenchiminių signalizacijos sąveikų nebuvimas homeozės genų blokavimo fone lemia netvarkingą ESC augimą kultūroje, nes tai sutrikdo laikinųjų organų infrastruktūros formavimąsi ir vystymąsi. Netvarkingas ESC augimas ir netvarkinga savaiminė diferenciacija kultūroje atsiranda dėl to, kad nėra mezenchiminio būsimų organų stromos karkaso žymėjimo: in vitro visiškai įmanoma suformuoti milijonus hepatocitų, tačiau neįmanoma gauti vienos kepenų skiltelės, kurioje būtų tokie struktūriniai ir funkciniai elementai kaip sinusai, Disse tarpai ir Kupfferio ląstelės.

Manoma, kad ESC pluripotentiškumas realizuojamas išskirtinai embriogenezės metu, formuojantis embriono audiniams ir organams, o placenta ir virkštelė yra trofoblasto dariniai. Trofektoderminėje membranoje esančios ESC nuosekliai generuoja laikinųjų ląstelių klonus, kurie įgyvendina vystymosi programą per Nochtejovo tūrinės topografinės matricos kombinatorinę mRNR, kuri iš anksto lemia erdvinį išdėstymą, formą ir dydį, laikinųjų ir galutinių organų ląstelių skaičių, taip pat parenchimos surinkimą į struktūrinius ir funkcinius vienetus. Tuo pačiu metu ESC išlieka vieninteliu ląstelių tipu, kuriame jų potencialų įgyvendinimo molekulinis mechanizmas yra visiškai atjungtas nuo genetinės vystymosi programos, o pačios ESC netenka galimybės sąveikauti su kitomis ląstelėmis dėl receptorių suvokimo ir transsignalinių sistemų blokavimo. Tačiau tinkamas ESC aktyvavimas lemia laipsnišką embriogenezės programos vystymąsi, pasibaigiant pilnai susiformavusio organizmo, sudaryto iš milijardų ląstelių, paruoštų negimdiniam gyvenimui, gimimu. Šiame trumpalaikiame, bet neįsivaizduojamai ilgame kelyje ląstelių erdvėje neišvengiamai atsiranda klaidų tiek molekuliniuose mechanizmuose, užtikrinančiuose gyvybinę ląstelių veiklą, tiek programose, kontroliuojančiose jų proliferaciją, diferenciaciją ir specializaciją. Todėl šiuolaikinėje farmakogenomikoje molekulinės struktūros ligos ir ląstelių programavimo ligos nagrinėjamos atskirai. Be to, daugumos naujų vaistų veikimas yra skirtas diferenciacijos, proliferacijos ir organogenezės programų, taip pat organų ir audinių regeneracijos korekcijai. Suaugusio organizmo ESC leidžia kontroliuoti į smegenis, kepenis, blužnį, kaulų čiulpus ir kitus žmogaus organus persodintų kamieninių/progenitorinių ląstelių elgesį, siekiant atkurti pažeistą recipiento organų parenchimą, diferencijuojant ir specializuojant donorines ląsteles išsaugotoje mezenchiminėje matricoje. Iš esmės totipotencinė programa pradedama realizuoti oocitų, zigotų ir blastomerų genomų lygmenyje; tačiau šios ląstelės dar nebuvo klonuotos ir persodintos tokiais kiekiais, kokie reikalingi eksperimentinės ir praktinės medicinos poreikiams. Todėl ESC išlieka unikaliu genetinės informacijos šaltiniu, kuriame yra kodai trimačiam embriono žemėlapiui ir kodai specializuotų ląstelių linijų linijiniam apribojimui gastruliacijos metu.

Praktiškai neribotas ESC regeneracinis potencialas atsiranda dėl to, kad jų genomas, skirtingai nei diferencijuotų somatinių ląstelių genetinis aparatas, išlaiko pluripotentiškumą. Viena iš ESC įterptos genetinės informacijos ramybės būsenos apraiškų yra vadinamasis minimalus fenotipas – ESC paviršiuje ekspresuojamas ribotas receptorių skaičius, todėl ląstelės branduolinio aparato sąveikai su jos mikroaplinka naudojama labai mažai transsignalinių programų. Genų, atsakingų už specializuotų ląstelių linijų ribojimą ir ląstelių diferenciaciją, žiemos miego fone aktyvuojami tik apie 30 iš 500 genų, kurių produktai užtikrina ląstelės ryšį su aplinkine mikroaplinka. Naudojant genų raiškos serijinės analizės metodą, buvo parodyta, kad esant bendram pagrindinių genomo funkcinių dėžių, reguliuojančių energetiką ir metabolizmą somatinėse ląstelėse ir ESC, veikimui, pastarosiose yra labai mažas receptorių, G baltymų, antrinių pasiuntinių, transkriptazių, raiškos ir represijos kofaktorių mRNR lygis, t. y. visa reguliavimo signalo transmembraninio perdavimo į ląstelę sistema. Taip yra dėl transsignalinių genų nebuvimo arba labai mažos jų raiškos. Indukuotos ESC genomo diferenciacijos laikotarpiu 18 sinchroniškai nustoja veikti, aktyvuojant 61 transsignalinį geną, kontroliuojantį ląstelių adhezijos receptorių, tarpląstelinės matricos komponentų, restrikcijos transkriptazių ir signalo perdavimo sistemos į branduolinį aparatą iš ląstelės plazminės membranos receptorių sintezę. Tuo pačiu metu blokuojama už duslintuvų baltymų sintezę atsakingų genų raiška, taip pat genų raiškos koinhibitoriai, užtikrinantys ESC genomo totipotenciją.

Visų trijų gemalinių sluoksnių ląstelėms rasti genų žymekliai. Ektoderminio ląstelių sluoksnio identifikavimas atliekamas pagal mazdinių, oct3 ir fgf-5 genų ekspresiją, mezodermos ląstelių – pagal brachiūrijos, zeta-globino genus, endodermos – pagal gata-4 geno ekspresiją. Normalios embriogenezės metu gastruliacijos laikotarpiu stebima aktyvi nesubrendusių kamieninių ir progenitorinių ląstelių populiacijų migracija, lokaliai žyminti kaukolės veido kaulų, kai kurių smegenų dalių, periferinės nervų sistemos, širdies laidumo sistemos ir užkrūčio liaukos vystymosi zonas, kurių audiniai susidaro iš migruojančių ląstelių klonų. Ląstelių žymėjimas ankstyvaisiais gemalinių sluoksnių genais palengvina pirmtakinių ląstelių migracijos procesų besivystančiame embrione topografinę analizę. Visų pirma nustatyta, kad P19 embriokarcinomos ląstelių agregatuose pirmojo mezodermos geno brachyurija raiška prasideda tuo laikotarpiu, kai sumažėja audinių plazminogeno aktyvatoriaus, α-fetoproteino, keratino 8 ir keratino 19 genų, kurie yra pirmosios migruojančios mezodermos populiacijos žymenys, raiška. Todėl mezoderminės kilmės audinių formavimasis prasideda tik pasibaigus taškinės migracijos ir mezoderminių pirmtakų ląstelių išsisklaidymo procesui.

Nepaisant itin ribotų fenotipinių požymių ir daugumos transsignalinių vienetų nebuvimo, ESC vis dar ekspresuoja kai kurias receptorių molekules, kurios gali būti naudojamos joms identifikuoti. Pažymėtina, kad ESC žymenų antigenai žmonėms ir primatams pasirodė esantys įprasti. Dažniausiai ESC žymėjimui naudojami žymėti antikūnai prieš membraninius antigenus SSEA-3, SSEA-4 (unikalius lipidų antigenus, vaizduojančius glikolipido GL7 kompleksą su sialo rūgštimi), taip pat didelio polimeriškumo glikoproteinus TRA-1-81, TRA-1-60. Be to, ESC ekspresuoja specifinį embrioninį antigeną SSEA-1 ir endogeninę šarminę fosfatazę, taip pat specifinį transkripcijos faktorių Oct4. Pastarasis yra būtinas ESC proliferacijos mechanizmams palaikyti – specifinis transkripcijos faktorius Oct4 aktyvuoja fibroblastų augimo faktoriaus 4 geno ekspresiją ir stabilizuoja genų dėžutės, atsakingos už neribotą DNR replikaciją nesubrendusiose ląstelėse, ekspresiją. Svarbiausi tarpląsteliniai žymenų baltymai yra Oct3, Oct4, Tcf ir Groucho, kurie yra susiję su chromatino slopintuvais.

Beveik iš karto po daugelio metų sėkmingų bandymų kultivuoti ESL už kūno ribų ir gautų pirmųjų iš pelių blastocistų išskirtų kamieninių ląstelių kultūrų bei pirminių gemalo ląstelių kultūrų, prasidėjo ESL pluripotentinio potencialo tyrimų etapas, kai jos buvo įvestos į embrionus ankstyvosiose vystymosi stadijose. Buvo įrodyta, kad morulos ir blastocistos stadijose ESL geba suformuoti chimerinius embrionus, kuriuose donorinių ESL palikuonys aptinkami visuose somatiniuose audiniuose ir net gametose. Taigi, raidos biologijoje, naudojant ESL, buvo nutiestas „tiltas“ tarp eksperimentinių tyrimų in vivo ir in vitro, o tai žymiai išplėtė pirminių audinių ir organų formavimosi, jų diferenciacijos ir embriono organogenezės procesų tyrimo galimybes.

Aiškiai nustatyta, kad in vivo embriogenezės metu ESL integruojasi į ankstyvojo embriono ląstelių masę, o jų dariniai randami visuose organuose ir audiniuose. ESL kolonizuoja gemalo ląstelių liniją chimeriniame embrione, iš kurios palikuonys suformuoja visaverčius kiaušinėlius ir spermatozoidus. Embrioninės kamieninės ląstelės yra klonogeninės – viena ESL geba sukurti genetiškai identišką ląstelių koloniją su molekuliniais žymenimis, tarp kurių yra oct4 geno ir šarminės fosfatazės ekspresija, didelis telomerazės aktyvumas ir tam tikrų embrioninių antigenų ekspresija.

Embriogenezės mechanizmams tirti naudojant ESL buvo sukurtas morulų chimerizacijos metodas, sukuriant biologinę konstrukciją, kurios išorėje yra recipiento tetraploidinių blastomerų sluoksnis, o viduje įvedamos donorinės ESL. Taigi, iš recipiento tetraploidinių blastomerų palikuonių susidaro trofoblastas, užtikrinantis implantaciją ir placentaciją, o donorinės ESL veikia kaip vidinė ląstelių masė, iš kurios formuojasi gyvybingo embriono kūnas ir pirminių progenitorinių gemalo ląstelių linija. ESL tyrimų vertė slypi ne tik tame, kad atliekant in vitro manipuliacijas su jų genomu išsaugomas pluripotentiškumas, bet ir tame, kad išsaugomas ESL gebėjimas dalyvauti chimerinio embriono pirminių gemalo ląstelių formavime. Įrodyta, kad vos vienos genetiškai modifikuotos ESL palikuonys užpildo visus chimerinio embriono, gauto agreguojant arba kokultivuojant šią ląstelę su 8 ląstelių embrionu, pirminius rudimentus ir besivystančius audinius. Kai žaliai fluorescencinio baltymo genu transfekuotos ESL buvo persodintos į pelių morulą, visuose tirtuose besivystančio embriono audiniuose buvo rasti fluorescenciniai šios ląstelės palikuonys (Shimada, 1999). ESL transplantacija į morulą leidžia sukurti gyvybingas peles, kurių organizmas susideda tik iš donoro ESL palikuonių, o tai atveria perspektyvas įvairioms terapinio klonavimo galimybėms. Šis metodologinis požiūris dabar sėkmingai naudojamas vystymosi biologijos problemoms tirti, visų pirma, jis naudojamas analizuojant X chromosomos genetinės inaktyvacijos arba ESL epigenetinio nestabilumo mechanizmus. ESL transplantacija į ankstyvą embrioną taip pat naudojama žemės ūkio biotechnologijose, taip pat genų terapijos eksperimentuose.

Genetiškai modifikuotų ESL transplantacija naudojama mutantinių genų tikslinėms ląstelėms tirti. In vitro kultivuotos ESL biotechnologijose naudojamos kuriant nokautuotas peles. Šiuo tikslu tiriamas genas pašalinamas iš ESL homologinės rekombinacijos (nokauto) būdu, o ląstelės, neturinčios šio geno, išskiriamos selektyvioje terpėje. Nokautuotos ESL tada įvedamos į blastocistą arba agreguojamos su morulų blastomeromis. Tokiu būdu gauti chimeriniai ankstyvieji embrionai persodinami į recipientes pateles, o iš naujagimių pelių atrenkami individai, kurių gametos yra nulizigotinės tam tikram genui. Ši technologija buvo naudojama kuriant daugybę nokautuotų pelių linijų, kurios plačiai naudojamos eksperimentinėje biologijoje ir eksperimentinėje medicinoje. Tokie biologiniai modeliai naudojami tiriant tam tikrų genų reikšmę embriono vystymuisi, taip pat jų vaidmenį žmonių ligų ir patologinių būklių mechanizmuose. Be to, nokautuotos gyvūnų linijos naudojamos ikiklinikiniuose naujų genų terapijos metodų tyrimuose. Pavyzdžiui, transfekuojant mutantinio geno normalų alelį į ESL genomą, galima efektyviai ištaisyti mutaciją, paveikiančią kraujodaros sistemą. Įvedus svetimus genus į ESC, galima greitai sukurti homozigotinių transgeninių laboratorinių gyvūnų linijas. Tačiau reikėtų pažymėti, kad tikslinės rekombinacijos genų ištrynimo technika iki šiol patikimai išplėtota tik pelių ESC. Naudojant dvigubo išjungimo pelių ESC, buvo nustatytas 7 chromosomos genų klasterio regiono (žmogaus 19 chromosomos genomo regiono kopija) ir 11 chromosomos proksimalinio regiono (žmogaus 5g chromosomos kopija) funkcinis vaidmuo – šių genų ištrynimas pelių ESC leido įvertinti jų analogų funkciją žmonėse.

Išsiplėtė žmogaus embriogenezės genų funkcijos tyrimo galimybės, kurių transfekcija į laboratorinių gyvūnų ESL genomą leido visų pirma išsiaiškinti kriptogeno vaidmenį kardiogeninės mezodermos, pax-6 geno, formavime ir vystymesi akių embriogenezėje. Sudaromi pirmieji genų raiškos žemėlapiai nesubrendusiose proliferuojančiose teratokarcinomos ir pelių blastocistų ESL, patvirtinta transsignalinių genų slopinamoji represija ESL. 60–80 mutantinių ESL ir 20–30 normalių preimplantacinių pelių embrionų ląstelių derinys lemia chimerinių embrionų, kuriuose organų pradmenys susideda iš donorinių ir recipientinių ląstelių, vystymąsi, o tai leidžia išsiaiškinti nežinomų genų vaidmenį gastruliacijoje ir organogenezėje. Besivystančių pelių embrionų genų funkcinis žemėlapis buvo papildytas informacija apie sf-1 geno vaidmenį antinksčių ir lytinių liaukų formavimesi, wt-1 geno vaidmenį inkstų formavimesi, myoD šeimos genų vaidmenį griaučių raumenų formavimesi ir gata-1-4 šeimos genų vaidmenį eritropoezės ir limfopoezės užuomazgų restrikcijos brendime.

Kryptingas motinos ir tėvo genų alelių išjungimas ESL naudojant vektorių rekombinazes leido išaiškinti įvairių genų funkcijas ankstyvajame embriogenezės laikotarpyje, o nežinomų žmogaus genų kryptingo perkėlimo į pelių ESL technologija prisideda prie naujų mutantinių genų, atsakingų už sunkios paveldimos patologijos vystymąsi, atradimo. Naudojant nokautavimo metodą, buvo nustatyta kai kurių genų privaloma reikšmė embrioninių audinių formavimuisi: gata-4 - miokardui, gata-1 - hematopoetinio audinio eritroidinei linijai, myoD - griaučių raumenims, brachyury - mezodermai, restrikcijos transkriptazės hnf3 ir hnf4 - kepenų kamieninėms ląstelėms, rag-2 - T ir B limfocitų klonų formavimuisi (Repin, 2001). Dviguba genų ištrynimas ESL atvėrė prieigą prie gemalinio sluoksnio genų funkcinio vaidmens, segmentacijos ir homeozės tyrimų, o ESL transplantacija leido gauti gyvybingus tarprūšinius hibridinius embrionus. Naudojant patobulintą vieno donoro ESC persodinimo į 8 ląstelių embrioną techniką, įrodytas daugelio recipiento embriono organų chimerizacijos faktas ląstelių lygmenyje. Pažymėtina, kad žmogaus audinių ląstelių daigai buvo rasti recipientų pelių organuose, įvedus žmogaus kraujodaros kamienines ląsteles į blastocistą. Nustatyta, kad pluripotentinės ESC cirkuliuoja pelių embrionų kraujyje organų formavimosi laikotarpiu. Gali būti, kad jų biologinė funkcija slypi būsimos imuninės sistemos embriono organizacijoje. ESC pagalba laboratorinėmis sąlygomis buvo atkurti tinkami žmogaus genetinės patologijos modeliai: dvigubas distrofino geno išjungimas modeliuoja Diušeno raumenų distrofiją pelėms ir atm geno (chromatino signalo kinazės sintezės kontrolės) išjungimas – ataksija-telangektazija. Sergant šia mirtina paveldima liga vaikams, dėl DNR reparacijos defektų išsivysto Purkinje ląstelių degeneracija smegenėlėse, kurią lydi užkrūčio liaukos involiucija dėl proliferuojančių ląstelių žūties. Ataksijos-telangektazijos klinikinis vaizdas, patofiziologija ir patomorfologija, atkuriami įvedant patologinę genetinę informaciją į ESC, chimerų pelėse atitinka žmonių. Be ataksijos-telangektazijos, naudojant ESC ir nokautuotas peles, buvo sukurti eksperimentiniai kai kurių paveldimų homozigotinių žmonių ligų, susijusių su angliavandenių ir lipidų apykaitos patologija, aminorūgščių katabolizmu bei vario ir bilirubino išsiskyrimu, modeliai, kurie žymiai išplėtė eksperimentinės medicinos galimybes ikiklinikinių naujų atitinkamų žmonių ligų gydymo metodų bandymų etape.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Kamieninių ląstelių citohibridų naudojimas

Hibridinės ląstelės, gautos suliejant ESC su somatinėmis ląstelėmis, yra tinkamas ir perspektyvus modelis kamieninių ląstelių pluripotentiškumui tirti ir diferencijuotų ląstelių chromosomoms perprogramuoti. Citohibridai, gauti suliejant ESC su diferencijuotomis suaugusio gyvūno ląstelėmis, leidžia tirti skirtingo „amžiaus“ genomų ryšius: unikali situacija susidaro, kai homologiškos chromosomos, kilusios iš skirtingų diferenciacijos stadijų ir skirtingo brandos laipsnio ląstelių, yra tame pačiame branduolyje, kur jos gali lengvai keistis transaktyviais reguliavimo signalais. Sunku numatyti, kaip homologiškų chromosomų cisreguliacinės epigenetinės sistemos, susidariusios individualaus vystymosi metu, reaguos į transaktyvių signalų, sklindančių iš embrioninių giminingų genomų, įtaką. Be to, hibridinėse ląstelėse vyksta tėvų chromosomų segregacija, kuri leidžia tirti genomų sąveiką atskirų chromosomų lygmeniu, tai yra, potencialiai nustatyti specifinių chromosomų dalyvavimą palaikant pluripotentiškumą arba, atvirkščiai, išėjimą į diferenciaciją.

Pluripotentinių teratokarcinomos ir diferencijuotų somatinių ląstelių sąveikos tyrimui buvo panaudoti citohibridai, gauti suliejant pluripotentines teratokarcinomos ir diferencijuotas somatines ląsteles. Kai kuriais atvejais tokios hibridinės ląstelės išlaikė gana aukštą pluripotentinių savybių lygį. Visų pirma, teratokarcinomos-somatinės hibridinės ląstelės in vivo sukėlė tikrų teratomų, turinčių visų trijų gemalo sluoksnių darinius, vystymąsi, o in vitro suspensijos kultūrose jos suformavo embrioninius kūnus. Net ir tokio tipo tarprūšiniuose citohibriduose embrioninių antigenų buvimas buvo pastebėtas tais atvejais, kai somatiniai partneriai susiliejant su teratokarcinomos ląstelėmis buvo limfocitai arba timocitai. Pažymėtina, kad citohibridai, sukurti suliejant teratokarcinomos ląsteles su fibroblastais, fenotipu atitiko fibroblastus.

Svarbiausias nustatytas faktas yra tas, kad teratokarcinomos-somatinių hibridinių ląstelių atveju atsirado diferencijuoto ląstelės genomo perprogramavimo požymių, kuriems buvo būdingas arba atskirų genų, arba neaktyvios somatinio partnerio X chromosomos reaktyvavimas. Taigi, teratokarcinomos-somatinių ląstelių tipo citohibridų tyrimų rezultatai rodo, kad hibridinėse ląstelėse dažnai išsaugomas pluripotentiškumas ir yra somatinio partnerio genomo perprogramavimo požymių.

Eksperimentuose, kuriais buvo siekiama gauti vidurūšines embrionines hibridines ląsteles suliejant pelių ESC su suaugusių blužnies ląstelėse, buvo tiriamos tokių citohibridų charakteristikos, analizuojama tėvų chromosomų segregacija ir įvertinamas hibridinio genomo pluripotentiškumas. Intraspecifinės hibridinės ląstelės, gautos suliejant teratokarcinomos ląsteles su somatinėmis ląstelėmis, paprastai pasižymi mažu chromosomų segregacijos lygiu su tetraploidiniu arba beveik tetraploidiniu kariotipu. Panaši chromosomų sudėtis buvo pastebėta citohibriduose, suliejant pirmines gemalo ląsteles su limfocitais. Tuo pačiu metu tarprūšinės hibridinės ląstelės, gautos suliejant pelių teratokarcinomos ląsteles su audinių limfocitais, parodė intensyvią somatinio partnerio chromosomų segregaciją.

Kokybiškai naujas tėvų chromosomų segregacijos tyrimo etapas vidurūšiniuose hibriduose prasidėjo sukūrus mikrosatelitų analizės metodą, naudojant polimerazės grandininę reakciją, kurios dėka kiekvienai pelės chromosomai buvo rasti keli šimtai žymenų, leidžiančių patikimai atskirti bet kurią homologiškų chromosomų porą hibridinėse ląstelėse.

Suliejus ESC (HM-1 ląsteles, neturinčias hipoksantino fosforiboziltransferazės aktyvumo, 2n = 40, XY, išskirtas iš 129/01a pelių blastocistų) su kongeninių DD/c pelių blužnies ląstelėse esančiais blužnies ląstelėse (splenocitais), buvo galima gauti hibridinių klonų rinkinį, morfologiškai panašių į ESC. Visi klonai buvo išskirti selektyvioje terpėje, kurioje gali augti tik ląstelės, turinčios aktyvią hipoksantino fosforiboziltransferazę. Elektroforezinė analizė parodė, kad visi klonai turėjo alelinį hipoksantino fosforiboziltransferazės variantą, būdingą DD/c pelėms. Citogenetinė analizė parodė, kad trys iš keturių hibridinių klonų turėjo beveik diploidinį chromosomų rinkinį. Viename beveik tetraploidiniame klone buvo dvi hibridinių ląstelių populiacijos, iš kurių viena buvo tetraploidinė, o antroji, mažesnė, buvo diploidinė.

Mikrosatelitinė analizė, leidžianti atskirti bet kurią homologiškų pelių 129/01a ir DD/c chromosomų porą hibridiniuose klonuose su beveik diploidiniu rinkiniu, parodė, kad dviejuose klonuose buvo aiškus pirmeninis somatinio partnerio autosomų eliminavimas. Dauguma HESS2 ir HESS3 klonų autosomų turėjo 129/01a linijos, t. y. pluripotentinio partnerio, žymenis. Išimtis buvo 1 ir I chromosomos: HESS2 ir HESS3 klonuose, kartu su HM-1 ląstelių žymenimis, nedideliais kiekiais buvo somatinio partnerio žymenų. Tokie rezultatai gali atspindėti nepilną somatinio partnerio 1 ir I chromosomų segregaciją ir atitinka citogenetinius duomenis, kad šių chromosomų trisomija stebima 30–40 % HESS2 ir HESS3 klonų ląstelių. Klonas HESS4 reikšmingai skyrėsi savo chromosomų sudėtimi: daugelis šio klono autosomų kilo iš ESC genomo (2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ir 17 chromosomos), tačiau 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ir 19 chromosomas reprezentavo abiejų tėvų homologai. Šias homologiškas chromosomas žyminčių mikrosatelitų kiekybinis santykis buvo maždaug 1:1. Tai leido autoriams daryti prielaidą, kad vienas homologas kilo iš ESC genomo, o kitas – iš diferencijuotų ląstelių. Kai kuriuose HESS4 klono subklonuose buvo tik somatinio partnerio 18 ir 19 chromosomų žymenys. Gauti rezultatai rodo, kad HESS4 klono ląstelėse, be somatinio partnerio chromosomų segregacijos, įvyko vieno ar abiejų aukščiau išvardytų pluripotentinio genomo chromosomų homologų eliminacija, tai yra, įvyko abiejų tėvų chromosomų dvišalė segregacija – labai neįprastas reiškinys, nes tik vieno iš tėvų chromosomų segregacija būdinga citohibridams.

Be to, po 20-ojo pasažo visuose hibridinių ląstelių klonuose buvo tik somatinio partnerio X chromosomos žymenys, t. y. klonuose ESC X chromosoma buvo pakeista somatinio partnerio X chromosoma. Šį svarbų faktą patvirtina in situ hibridizacijos duomenys, gauti naudojant FITC žymėtą zondą, specifinį pelės X chromosomai: teigiamas signalas aptiktas tik vienoje chromosomoje. Reikėtų pažymėti, kad ankstesniuose kultivavimo etapuose (iki 15-ojo pasažo), remiantis citogenetiniais duomenimis, daugelyje ląstelių buvo dvi X chromosomos. Todėl selektyvios terpės naudojimas leidžia manipuliuoti hibridinių ląstelių chromosomų sudėtimi ir selektyviai atrinkti klonus, turinčius vieną somatinio partnerio chromosomą ESC genomo fone.

Kadangi unikali citohibridinio genomo ypatybė yra tėvų genomų lokalizacija viename branduolyje, natūraliai kyla klausimas dėl embriono genomo pluripotentinių savybių išsaugojimo ESC-somatinių ląstelių hibriduose, esant glaudžiam kontaktui su diferencijuotos ląstelės genomu. Morfologiškai ESC ir somatinių ląstelių citohibridai buvo panašūs į tėvų ESC liniją. Pluripotentiškumo įvertinimas parodė, kad visi klonai, turintys beveik diploidinį chromosomų rinkinį, gebėjo sudaryti embrioninius kūnus suspensijos kultūrose, kuriose buvo trijų gemalinių sluoksnių dariniai.

Daugumoje hibridinių ląstelių buvo ECMA-7 antigenas, ankstyviesiems pelių embrionams būdingas žymuo, be to, jos pasižymėjo dideliu šarminės fosfatazės aktyvumu. Įtikinamiausi duomenys apie dideles hibridinių ląstelių pluripotentines savybes buvo gauti atliekant eksperimentus, kurių metu buvo gauta injekcinių chimerų serija, kurioje dalyvavo HESS2 klono hibridinės ląstelės. Biocheminių žymenų analizė parodė, kad donorinių hibridinių ląstelių palikuonys buvo daugumoje chimerų audinių. Todėl hibridinės ląstelės, gautos suliejant ESC ir somatines diferencijuotas ląsteles, išlaiko aukštą pluripotentiškumą, įskaitant gebėjimą sudaryti chimeras, kai jos suleidžiamos į blastocistos ertmę.

Klonai HESS2 ir HESS4 reikšmingai skyrėsi tėvinių chromosomų sudėtimi, tačiau turėjo panašias pluripotentines savybes. Galima būtų manyti, kad pluripotentiškumas hibridiniame genome pasireiškia kaip dominuojantis požymis, tačiau gali būti, kad ne visos embriono genomo chromosomos dalyvauja pluripotentiškumo palaikymo procese. Jei ši prielaida teisinga, galima tikėtis, kad kai kurių pluripotentinio partnerio chromosomų pašalinimas iš hibridinių ląstelių genomo nebus susijęs su jų pluripotentiškumo statuso pasikeitimu. Šiuo atveju tėvinių chromosomų segregacijos embrioninėse hibridinėse ląstelėse analizė leistų mums iš arti identifikuoti chromosomas, atsakingas už embrioninių ląstelių pluripotentiškumo kontrolę.

O. Serovas ir kt. (2001) nerado palikuonių tarp 50 palikuonių, gautų kryžminant chimeras su normaliomis pelėmis, turinčiomis 129/01a pelių genotipą ir turinčiomis DD pelių X chromosomą. Autoriai mano, kad tai lemia hibridinių ląstelių pluripotentiškumo sumažėjimas veikiant somatiniam genomui. Alternatyvus paaiškinimas gali būti neigiamas trisomijos poveikis kai kurioms autosomoms ir lytinių chromosomų disbalansas (XXY buvo pastebėta ląstelėse iki 15-ojo pasažo) hibridinėse ląstelėse mejozės metu. Yra žinoma, kad XXY ląstelės negali patirti mejozės ir formuoti gametų. Trisomija taip pat gali sumažinti hibridinių ląstelių proliferacinį aktyvumą, dėl ko selektyvus pranašumas chimerų vystymesi gali priklausyti recipiento embriono ląstelėms. Iš to išplaukia, kad norint tinkamai įvertinti hibridinių ląstelių pluripotentinį potencialą, būtina gauti hibridinius klonus su normaliu diploidiniu chromosomų rinkiniu.

O. Serovo ir bendraautorių (2001) eksperimentuose pirmą kartą buvo pademonstruota somatinės ląstelės X chromosomos perprogramavimo galimybė hibridinių ląstelių genome. Ši autorių išvada išplaukia iš hprt geno (X chromosomos žymens) raiškos analizės chimerose: visuose analizuotuose chimeriniuose audiniuose buvo aptiktas DD/c pelių hprt alelinis variantas. Reikėtų pabrėžti, kad įvedus hibridines ląsteles į blastocistos ertmę, citohibridai patenka į neselektyvias sąlygas, o X chromosomos išsaugojimas hibridinių ląstelių genome reiškia, kad ji tapo jos obligatiniu komponentu ir genomas jos neskiria nuo pluripotentinio partnerio Y chromosomos.

Apibendrinant somatinių ir pluripotentinių genomų sąveikos hibridinėse embrioninėse ląstelėse analizės rezultatus, autoriai daro išvadą, kad kai kuriuose citohibriduose pluripotentiškumas pasireiškia kaip dominuojantis bruožas. Hibridinis genomas geba perprogramuoti atskiras diferencijuotų ląstelių chromosomas, tačiau tai neatmeta atvirkštinio somatinio genomo poveikio embrioninio genomo pluripotentiškumui galimybės. Kultivuojant hibridines ląsteles, diferenciacijos indukcija vyksta žymiai dažniau nei pirminėje ESC HM-1 tėvinėje linijoje. Panašus poveikis stebimas ir formuojantis pirminėms kolonijoms: daugelis pirminių embrioninių hibridinių ląstelių kolonijų diferencijuojasi ankstyvosiose formavimosi stadijose, o jų atrankos ir reprodukcijos metu patiriami dideli klonų nuostoliai.

Taigi, citohibridai, sukurti susiliejus ESC su somatinėmis ląstelėmis, nepaisant glaudaus kontakto su diferencijuotų ląstelių genomu, išlaiko pluripotentiškumą kaip unikalią embriono genomo savybę. Be to, tokiose hibridinėse ląstelėse galima perprogramuoti atskiras chromosomas, kilusias iš diferencijuotų ląstelių. Lieka neaišku, kiek embriono genomo pluripotentiškumo savybės išlaikomos hibridinėse ląstelėse, ypač jų gebėjimas dalyvauti gemalo linijos formavime chimerose. Tam reikia gauti embrionines hibridines ląsteles su normaliu kariotipu. Bet kokiu atveju, pluripotentiškos embrioninės hibridinės ląstelės gali tapti tikru genetiniu modeliu chromosomoms, dalyvaujančioms palaikant pluripotentiškumą ar jį kontroliuojant, identifikuoti, nes dvišalė tėvų chromosomų segregacija potencialiai suteikia tokią galimybę.

Ne mažiau patrauklus yra reiškinio, kurį O. Serovas ir kt. (2001) apibrėžia kaip „chromosominę atmintį“, tyrimas. Hibridiniame genome homologiškos chromosomos yra dviejų alternatyvių konfigūracijų: somatinio partnerio homologai jau yra diferenciavęsi, o pluripotentinio partnerio homologuose šis procesas tik prasideda. Taigi, hibridinių ląstelių didelių pluripotentiškų savybių išsaugojimas rodo, kad ESC homologų „pluripotentinė“ konfigūracija hibridiniame genome yra pakankamai stabili, nepaisant iš somatinio partnerio sklindančių transaktyviųjų faktorių įtakos. Aukščiau aprašyti diferencijuoto genomo homologiškų chromosomų perprogramavimo požymiai chimerų vystymosi metu neatmeta galimybės, kad pirmaisiais citohibridų formavimosi ir auginimo in vitro etapais jos išlaiko savo statusą, įgytą diferenciacijos in vivo metu. Remiantis neseniai gautais duomenimis, perkėlus embrionines hibridines ląsteles į neselektyvią aplinką, jose intensyviai eliminuojamos tik somatinio partnerio chromosomos, t. y. hibridinių ląstelių genomas lengvai atskiria homologus po 10–15 pasažų auginimo in vitro. Taigi, embrioninės hibridinės ląstelės yra perspektyvus eksperimentinis modelis, skirtas tirti ne tik tokią pagrindinę embriono genomo savybę kaip pluripotentiškumą, bet ir jos alternatyvą – embrioninę diferenciaciją.

Embrioninių kamieninių ląstelių transplantacijos terapinis veiksmingumas

Prieš analizuodami ESL ir jų darinių transplantacijos terapinį efektyvumą, apibendriname aukščiau pateiktą medžiagą. ESL galimybės visapusiškai įgyvendinti embriogenezę in vitro yra nepakankamos, nes vystymosi defektai šiuo atveju atsiranda dėl mezenchiminių kamieninių ląstelių, kurios organizme atsiranda autonomiškai ir nepriklausomai nuo ESL, nebuvimo. ESL genetinis potencialas yra mažesnis nei zigotos genetinis potencialas, todėl ESL nėra tiesiogiai naudojamos embrionų klonavimui. Unikalus ESL biologinis potencialas, kaip vienintelių ląstelių, kuriose vystymosi programos yra visiškai ir nuosekliai įgyvendinamos, naudojamas genų funkcijos tyrimuose. ESL pagalba dekoduojami pirmieji signalų deriniai, aktyvuojantys ankstyvųjų ir vėlyvųjų genų, koduojančių trijų gemalo sluoksnių vystymąsi, raišką. ESL genomo pluripotentiškumo išsaugojimas in vitro daro jas unikalia reparacinės regeneracijos priemone, galinčia automatiškai papildyti ląstelių nuostolius organų ir audinių pažeidimo atveju. Idealiu hipotetiniu scenarijumi galima daryti prielaidą, kad „... transplantuojant donoro ESC, į recipiento organizmą perkeliamos kompaktiškai supakuotos programos, kurios, esant palankioms sąlygoms, realizuojamos kuriant naujus audinius“7, galinčius „... efektyviai integruotis į recipiento organizmą tiek morfologiniu, tiek funkciniu lygmenimis“.

Natūralu, kad, sukūrus ESL monodiferenciacijos metodus, pradėtas in vivo tyrimas apie ląstelių, gautų in vitro iš vieno specializuoto klono, funkcinį aktyvumą. Proliferuojantis ESL klonas generuoja migruojančių progenitorinių ląstelių populiacijas, kurios iš tiesų geba aktyviai integruotis į recipiento audinių pažeidimo vietas, o tai taikoma regeneracinėje-plastinėje medicinoje. Nustatyta, kad DOPA neuronų transplantacija į juodąją medžiagą sumažina klinikinius eksperimentinio hemiparkinsonizmo požymius. Regioninės donorinių nervinių kamieninių ląstelių transplantacijos sumažina nugaros smegenų ir galvos smegenų traumos ar sumušimo sukeltų motorinių sutrikimų laipsnį. Taip pat gauti pirmieji teigiami kamieninių ląstelių transplantacijos demielinizuojančių ligų atveju rezultatai. Atrodytų, kad ESL regeneracinis-plastinis potencialas atveria neribotas ląstelių transplantacijos taikymo praktinėje medicinoje galimybes. Tačiau persodinus į ektopines zonas, ESL neišvengiamai transformuojasi į navikus. Teratomos susidaro, kai ESL suleidžiamos po oda imunodeficito pelėms. Kai singeninėms pelėms po sėklidės kapsule persodinamos ESC suspensijos, taip pat susidaro teratomos, susidedančios iš skirtingų audinių, kurių ląstelės yra visų trijų gemalo sluoksnių dariniai. Tokiose teratomose sumažėjusios organogenezės procesai yra itin reti.

Nemažai tyrimų pateikia informacijos apie teigiamus ankstyvųjų ESC darinių transplantacijos gyvūnams, sergantiems eksperimentine patologija, rezultatus. Ląstelių neurotransplantacija naudojant ESC darinius toliau plėtojama eksperimentuose ir pirmuosiuose klinikiniuose tyrimuose, siekiant ištaisyti funkcinius sutrikimus esant smegenų ir stuburo traumoms, gydyti siringomieliją ir išsėtinę sklerozę (Repin, 2001). Atsiradus in vitro neurogenezės iš ESC technikai, vietoj embrioninio smegenų audinio kuriami metodai neurosferos dariniams, gautiems iš embrioninių nervinių audinių kultūrų, persodinti. Tokios transplantacijos suspensijos yra žymiai homogeniškesnės ir jose yra atsidavusių neuronų ir neuroglijos pirmtakų.

Reguliariai 6 savaites į terpę įterpiant 10 μg/ml retinoinės rūgšties, žmogaus embriono (terato)karcinomos linijoje NTERA-2 susidaro daugiau nei 80 % postmitozinių neuronų. Visiškas neuronų populiacijos homogeniškumas pasiekiamas srautiniu būdu rūšiuojant subrendusius neuronus, paženklintus imunofenotipiniais žymenimis, o tai leidžia atsikratyti teratokarcinomos liekanų ir nesubrendusių ląstelių. Po transplantacijos į įvairius eksperimentinių gyvūnų smegenų regionus tokie neuronai ne tik išgyvena, bet ir integruojasi į regioninius neuroninius tinklus. Gyvūnams, turintiems eksperimentinius vietinių CNS defektų modelius, neurotransplantacija sumažina tokių žmogaus patologijų kaip trauminės smegenų traumos, insulto, demielinizuojančių ligų, paveldimų smegenėlių vystymosi defektų, lipidų ir polisacharidų nusėdimo ligų pasekmes, klinikines apraiškas.

Siekiant optimizuoti regeneracijos procesus degeneracinėse centrinės nervų sistemos ligose, kuriamos technologijos mieliną gaminančių oligodendrocitų gavimui iš ESC. Pirmasis etapas tradiciškai apima ESC proliferaciją, atkuriant transplantacijai reikalingą ląstelių skaičių. Antrajame etape atliekama tikslinė ląstelių diferenciacija į mieliną gaminančių oligodendrocitų pirmtakų populiaciją, kurią kontroliuoja selektyvūs žymenų antigenai.

Atsiveria tam tikros perspektyvos panaudoti ESC darinius kuriant metodus, skirtus imunodeficitams, kuriuos sukelia genetiniai užkrūčio liaukos brendimo defektai, koreguoti. Tyrimuose su nokautuotomis (rag 1) pelėmis, kurioms nustatytas indukuotas genų defektas – TCR genų V(D)J lokusų rekombinacijos mechanizmo sutrikimas, dėl kurio prarandama T limfocitų funkcija, ankstyvųjų ESC darinių transplantacija į gyvūnų užkrūčio liauką atkuria normalių imuninių klonų, atsakingų už ląstelinį imunitetą, populiacijų brendimą. Šiuo metu atliekami klinikiniai in vitro iš anksto suformuotų ESC transplantacijos tyrimai, skirti mirtinoms paveldimoms anemijoms gydyti vaikams.

Prieštaravimai dėl greito kamieninių ląstelių transplantacijos įdiegimo klinikoje grindžiami ribotu stabilių žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių linijų skaičiumi ir poreikiu jas standartizuoti. Siekiant padidinti standartizuotų ESC linijų, taip pat ir suaugusių žmogaus kamieninių ląstelių, grynumą, siūloma naudoti linijų atrankos metodą, pagrįstą trumpų tandeminių DNR pasikartojimų molekuline genetine analize. Taip pat būtina ištirti ESC linijas dėl mažų chromosomų pertvarkymų ir genetinių mutacijų, kurių atsiradimo tikimybė ląstelių kultūros sąlygomis yra gana didelė. Pateikiama tezė apie privalomą visų tipų ESC ir regioninių pluripotentinių kamieninių ląstelių savybių tyrimą, nes jų dauginimasis in vitro gali sukelti naujų savybių, kurios nėra būdingos embrioninėms kamieninėms ląstelėms ar galutiniams audiniams, atsiradimą. Visų pirma, daroma prielaida, kad ilgalaikis auginimas terpėse su citokinais priartina ESC linijas prie naviko ląstelių, nes jos patiria panašius ląstelių ciklo reguliavimo kelių pokyčius, įgydamos gebėjimą atlikti neribotą skaičių ląstelių dalijimųsi. Kai kurie autoriai, remdamiesi naviko vystymosi potencialu, ankstyvųjų embrioninių kamieninių ląstelių darinių transplantaciją žmonėms laiko neapgalvota. Jų nuomone, daug saugiau naudoti atsidavusius ESC palikuonis, t. y. diferencijuotų ląstelių pirmtakų linijas. Tačiau šiuo metu dar nėra sukurta patikima technika, kaip gauti stabilias žmogaus ląstelių linijas, kurios diferencijuojasi norima kryptimi.

Taigi literatūroje pasirodo vis daugiau duomenų apie teigiamą žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių darinių transplantacijos terapinį poveikį. Tačiau daugelis šių tyrimų yra peržiūrimi ir kritikuojami. Kai kurie tyrėjai mano, kad ankstyvųjų klinikinių tyrimų rezultatai yra preliminarūs ir rodo tik tai, kad kamieninės ląstelės gali daryti teigiamą poveikį konkrečios ligos klinikinei eigai. Todėl būtina gauti duomenų apie tolimus ląstelių transplantacijos rezultatus. Kaip argumentas pateikiami klinikinės neurotransplantologijos vystymosi etapai. Iš tiesų, iš pradžių literatūroje vyravo publikacijos apie didelį embrioninių smegenų fragmentų transplantacijos efektyvumą sergant Parkinsono liga, tačiau vėliau pradėjo pasirodyti pranešimai, neigiantys į pacientų smegenis persodinto embriono ar vaisiaus nervinio audinio terapinį efektyvumą.

Pirmieji klinikiniai tyrimai buvo atlikti siekiant įvertinti iš NTERA-2 teratokarcinomos ESL gautų neuroblastų transplantacijos saugumą, kurių nesubrendusios ląstelės buvo proliferuojamos kultūroje, kol sukaupta 100 milijonų ląstelių masė. Kai kurios tokiu būdu gautos ląstelės buvo panaudotos fenotipui apibūdinti ir ląstelių priemaišoms nustatyti, taip pat galimam užterštumui virusais ir bakterijomis ištirti. LIF ir vaisiaus stromos ląstelių maitinamasis sluoksnis buvo pašalinti iš kultūros terpės, ir buvo sudarytos sąlygos tikslinei ESL diferenciacijai į neuroblastus, naudojant citokinų ir augimo faktorių derinį. Tada neuroblastai buvo išgryninti iš nesubrendusių teratokarcinomos ląstelių srauto ląstelių rūšiuotuvu. Po antrinio gryninimo ir persodintų ląstelių fenotipo apibūdinimo, neuroblastų suspensija (10–12 milijonų) buvo sušvirkšta į pacientų smegenų bazinį branduolį (septintą mėnesį po hemoraginio insulto), naudojant specialią mikrokaniulę ir švirkštą, kontroliuojant stereotaksiją ir kompiuterinę tomografiją. Po transplantacijos vienerių metų trukmės neuronų transplantacijos į insulto zoną pasekmių patikra nenustatė jokio šalutinio ar nepageidaujamo poveikio. Pusei pacientų motorinė funkcija pagerėjo per 6–12 mėnesių po transplantacijos. Teigiamus klinikinius pokyčius lydėjo padidėjęs kraujo tiekimas į insulto zoną po ląstelių transplantacijos: vidutinis fluorescenciniu būdu žymėtos 2-deoksigliukozės absorbcijos padidėjimas, remiantis pozitronų emisijos tomografija, siekė 18 %, o kai kuriems pacientams – 35 %.

Vis dėlto JAV Nacionaliniai sveikatos institutai atliko nepriklausomą neurotransplantacijos klinikinio veiksmingumo tyrimą pacientams, sergantiems parkinsonizmu. Pirmosios grupės pacientams buvo persodinti embriono nervinio audinio gabalai, gaminantys dopaminą, o antrosios grupės pacientams buvo atlikta fiktyvi operacija. Rezultatai rodo nulinį tokios neurotransplantacijos klinikinį veiksmingumą, nepaisant to, kad dopaminą gaminantys embrioniniai neuronai recipientų smegenyse išliko. Be to, praėjus 2 metams po embriono nervinio audinio transplantacijos, 15 % pacientų išsivystė nuolatinė diskinezija, kurios nebuvo placebo grupės pacientams (Kamieninės ląstelės: mokslo pažanga ir būsimos tyrimų kryptys. Nat. Inst, of Health. USA). Tolesnė ligos raida šiems pacientams toliau stebima.

Kai kurie autoriai prieštaringus literatūros duomenis apie neurotransplantacijos klinikinio veiksmingumo vertinimą sieja su skirtingais pacientų grupių atrankos metodais, nepakankamu metodų, skirtų objektyviai įvertinti jų būklę, pasirinkimu ir, svarbiausia, skirtingais embriono nervinio audinio vystymosi laikotarpiais ir skirtingomis smegenų sritimis, iš kurių šis audinys buvo gautas, skirtingais transplantato dydžiais ir chirurginės intervencijos metodinėmis ypatybėmis.

Reikėtų pažymėti, kad bandymai tiesiogiai transplantuoti pluripotentines embrionines kamienines ląsteles į žiurkių, sergančių eksperimentiniu hemiparkinsonizmu, smegenų striatumo sritį buvo lydimi ESC proliferacijos ir jų diferenciacijos į dopaminerginius neuronus. Reikėtų manyti, kad naujai susiformavę neuronai buvo efektyviai integruoti į neuroninius tinklus, nes po ESC transplantacijos buvo pastebėta elgesio anomalijų ir motorinės asimetrijos korekcija apomorfino teste. Tuo pačiu metu kai kurie gyvūnai mirė dėl persodintų ESC transformacijos į smegenų auglius.

JAV Nacionalinės ir Medicinos akademijų ekspertai, JAV Nacionalinio sveikatos instituto specialistai mano, kad ESC klinikinis potencialas nusipelno rimčiausio dėmesio, tačiau primygtinai reikalauja išsamiai ištirti jų savybes, komplikacijų tikimybę ir ilgalaikes pasekmes eksperimentuose su atitinkamais žmonių ligų biologiniais modeliais (Kamieninės ląstelės ir būsimoji regeneracinė medicina, Nacionalinė akademijos leidykla; Kamieninės ląstelės ir būsimos tyrimų kryptys, Nat. Inst, of Health USA).

Šiuo požiūriu svarbu, kad lyginamoji histologinė eksperimentinių teratomų, gautų persodinus ESC suspensiją į sėklidę, ir teratomų, susidariusių persodinus ankstyvą embrioną, kuriame taip pat yra ESC, analizė parodė, kad ESC, nepriklausomai nuo jų kilmės šaltinio ar sąveikos su tam tikromis aplinkinėmis ląstelėmis, savo naviko atsiradimo potencialą įgyvendina vienodai. Įrodyta, kad tokios teratomos turi kloninę kilmę, nes iš vienos ESC gali kilti navikai, sudaryti iš visų trijų gemalinių sluoksnių darinių (Rega, 2001). Pažymėtina, kad persodinus klonuotas ESC su normaliu kariotipu imunodeficitinėms pelėms, taip pat susidarė teratomos, sudarytos iš skirtingų tipų diferencijuotų somatinių ląstelių. Šie eksperimentiniai duomenys yra nepriekaištingas teratomų kloninės kilmės įrodymas. Vystymosi biologijos požiūriu jie rodo, kad ne kelios atsidavusios progenitorinės ląstelės, o viena pluripotentinė kamieninė ląstelė veikia kaip diferencijuotų visų trijų teratomą sudarančių gemalinių sluoksnių darinių šaltinis. Tačiau praktinės ląstelių transplantacijos kelyje šių tyrimų rezultatai yra jei ne draudimas, tai įspėjamasis galimo pavojaus ženklas, nes ESL arba pirmykščių gemalo ląstelių inokuliacija į įvairius suaugusių imunodeficitinių pelių audinius neišvengiamai sukelia navikų vystymąsi iš persodintų kamieninių ląstelių. Ektopiškai persodintų ESL neoplastinę degeneraciją lydi diferencijuotų ląstelių palydovinių populiacijų atsiradimas – dėl dalinės ESL ir pirmtakų klonų diferenciacijos į specializuotas linijas. Įdomu tai, kad persodinus ESL į griaučių raumenis, neuronai dažniausiai susidaro šalia teratokarcinomos ląstelių. Tačiau ESL įvedimas į besidalijančią kiaušialąstę arba blastocistą lydimas visiško ląstelių integravimosi į embrioną be neoplastinių elementų susidarymo. Šiuo atveju ESL integruojasi į praktiškai visus embriono organus ir audinius, įskaitant lytinių organų pradmenį. Tokie alofeno gyvūnai pirmą kartą buvo gauti įvedus teratokarcinomos 129 ląsteles į ankstyvuosius embrionus 8–100 ląstelių stadijose. Alofeno pelėse heterogeninių ląstelių populiacijos, gautos iš donorinių ESC, integruojasi į kaulų čiulpų, žarnyno, odos, kepenų ir lytinių organų audinius, todėl eksperimente galima sukurti net tarprūšines ląstelių chimeras. Kuo trumpesnis ankstyvojo embriono vystymosi laikotarpis, tuo didesnis ląstelių chimerizacijos procentas, o didžiausias chimerizacijos laipsnis stebimas alofeno embriono kraujodaros sistemoje, odoje, nervų sistemoje, kepenyse ir plonojoje žarnoje. Suaugusio organizmo audiniai, apsaugoti nuo recipiento imuninės sistemos histohematiniais barjerais, yra jautrūs chimerizacijai:Pirminių gemalo ląstelių transplantacija į sėklidės parenchimą vyksta kartu su donoro kamieninių ląstelių įterpimu į recipiento gemalo audinio sluoksnį. Tačiau persodinant ESL į blastocistą, chimerinių lytinių organų užuomazgų susidarymas kartu su donoro pirminių gemalo ląstelių generacija nevyksta. ESL pluripotentiškumas, sudarius specialias sąlygas, taip pat gali būti naudojamas klonavimui: pelių ESL persodinimas į 8–16 ląstelių pelės embrioną, kuriame ląstelių mitozės blokuojamos citokalsinu, skatina normalios embriogenezės įgyvendinimą, vystant embrioną iš donorų ESL.

Todėl alternatyva alogeninei ESC transplantacijai yra terapinis klonavimas, pagrįstas somatinių ląstelių branduolių transplantacija į enukleuotą kiaušinėlį, siekiant sukurti blastocistą, iš kurios vidinės ląstelių masės vėliau išskiriamos somatinio branduolio donorui genetiškai identiškos ESC linijos. Techniškai ši idėja yra gana įgyvendinama, nes ESC linijų kūrimo iš blastocistų, gautų persodinus somatinius branduolius į enukleuotus kiaušinėlius, galimybė buvo ne kartą įrodyta eksperimentais su laboratoriniais gyvūnais (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Visų pirma, pelėms, homozigotinėms rag2 geno mutacijai, fibroblastai, gauti kultivuojant poepiderminio audinio ląsteles, buvo naudojami kaip branduolių donorai, kurie buvo persodinti į enukleuotus oocitus. Po oocitų aktyvavimo „zigota“ buvo kultivuojama iki blastocistos susidarymo, iš kurios vidinės ląstelių masės buvo išskirtos ESC ir perkeltos į ląstelių liniją, nullizigotinę mutantiniam genui (rag2~/~). Tokiose ESC vieno alelinio geno mutacija buvo ištaisyta homologinės rekombinacijos metodu. Pirmojoje eksperimentų serijoje embrionų kūneliai buvo gauti iš ESC su rekombinantiniu atkurtu genu, jų ląstelės buvo transfekuotos rekombinantiniu retrovirusu (HoxB4i/GFP) ir po reprodukcijos suleistos į rag2~/~ pelių veną. Antrojoje serijoje tetraploidiniai blastomerai buvo agreguoti su genetiškai modifikuotomis ESC ir persodinti recipientėms patelėms. Gautos imunokompetentės pelės buvo kaulų čiulpų donorės transplantacijai į rag2~/~ mutantines peles. Abiejose serijose rezultatas buvo teigiamas: po 3-4 savaičių visose pelėse buvo rastos subrendusios normalios mieloidinės ir limfoidinės ląstelės, galinčios gaminti imunoglobulinus. Taigi, somatinių ląstelių branduolių transplantacija į oocitus gali būti naudojama ne tik ESC linijoms gauti, bet ir citogenoterapijai – paveldimų anomalijų korekcijai, naudojant ESC kaip vektorių korekcinės genetinės informacijos transportavimui. Tačiau ši ląstelių transplantacijos kryptis, be bioetinių problemų, turi ir apribojimų. Neaišku, kiek saugi bus terapiškai klonuotų ląstelių, kurių genotipas identiškas konkretaus paciento genotipui, transplantacija, nes tokios ląstelės gali sukelti mutacijas, kurios sukuria polinkį sirgti kitomis ligomis. Normalūs žmogaus kiaušinėliai išlieka sunkiai prieinamu objektu, o net ir persodinus somatinius branduolius į gyvūnų kiaušinėlius be branduolio, tik 15–25 % sukonstruotų „zigotų“ išsivysto iki blastocistos stadijos. Kol kas nenustatyta, kiek blastocistų reikia norint gauti vieną pluripotentinių klonuotų ESC liniją. Taip pat verta atkreipti dėmesį į dideles finansines išlaidas, susijusias su terapinio klonavimo metodologijos sudėtingumu.

Apibendrinant reikėtų pažymėti, kad ESC genomo pluripotentiškumas su hipometilinta DNR yra derinamas su dideliu telomerazės aktyvumu ir trumpa ląstelės ciklo C^ faze, kuri užtikrina intensyvią ir potencialiai begalinę jų dauginimąsi, kurios metu ESC išlaiko diploidinį chromosomų rinkinį ir „juvenilinį“ fenotipinių savybių rinkinį. Kloninis ESC augimas kultūroje netrukdo jų diferenciacijai į jokią specializuotą organizmo ląstelių liniją, kai proliferacija sustabdoma ir pridedami atitinkami reguliavimo signalai. ESC restrikcijos diferenciacija į somatines ląstelių linijas in vitro realizuojama be mezenchimo dalyvavimo, apeinant Nochtey, už organogenezės ribų ir be embriono formavimosi. Negimdinis ESC įvedimas in vivo neišvengiamai veda prie teratokarcinomų susidarymo. ESC transplantacija į blastocistą arba ankstyvą embrioną lydima jų integracijos į embrioninius audinius ir stabilios jo organų chimerizacijos.

Regeneracinės-plastinės technologijos, pagrįstos ląstelių transplantacija, yra ląstelių biologijos, raidos biologijos, eksperimentinės genetikos, imunologijos, neurologijos, kardiologijos, hematologijos ir daugelio kitų eksperimentinės ir praktinės medicinos sričių atstovų interesų sankirtos taškas. Svarbiausi eksperimentinių tyrimų rezultatai įrodo kamieninių ląstelių perprogramavimo galimybę tikslingai keičiant jų savybes, o tai atveria perspektyvas kontroliuoti citodiferenciacijos procesus naudojant augimo faktorius – miokardo regeneracijai, CNS pažeidimų atstatymui ir kasos salelių aparato funkcijos normalizavimui. Tačiau norint plačiai įdiegti ESC darinių transplantaciją praktinėje medicinoje, būtina išsamiau ištirti žmogaus kamieninių ląstelių savybes ir tęsti eksperimentus su ESC eksperimentiniuose ligų modeliuose.

Bioetinius klausimus ir alogeninės ląstelių transplantacijos atmetimo problemą galėtų išspręsti atrastas suaugusio organizmo regioninių kamieninių ląstelių genomo plastiškumas. Tačiau pradinė informacija, kad persodinus į kepenis izoliuotas ir kruopščiai apibūdintas hematopoetines autologines ląsteles, iš kurių susidaro nauji hepatocitai, jos integruojasi į kepenų skilteles, dabar yra peržiūrima ir kritikuojama. Nepaisant to, buvo paskelbti duomenys, kad nervinių kamieninių ląstelių transplantacija į užkrūčio liauką sukelia naujų donorinių T ir B limfocitų daigų susidarymą, o smegenų nervinių kamieninių ląstelių transplantacija į kaulų čiulpus veda prie hematopoetinių daigų su ilgalaike donorine mielo- ir eritropoeze susidarymo. Todėl pluripotentinės kamieninės ląstelės, galinčios perprogramuoti genomą iki ESC potencialo, gali išlikti suaugusio organizmo organuose.

ESC gavimo medicininiais tikslais šaltinis išlieka žmogaus embrionas, o tai lemia neišvengiamą naują moralinių, etinių, teisinių ir religinių klausimų sankirtą žmogaus gyvybės atsiradimo taške. ESC atradimas suteikė galingą impulsą atnaujinti sunkias diskusijas apie tai, kur yra riba tarp gyvų ląstelių ir materijos, būties ir asmenybės. Tuo pačiu metu nėra universalių normų, taisyklių ir įstatymų, susijusių su ESC naudojimu medicinoje, nepaisant pakartotinių bandymų juos sukurti ir priimti. Kiekviena valstybė, laikydamasi savo teisės aktų, šią problemą sprendžia savarankiškai. Savo ruožtu gydytojai visame pasaulyje ir toliau bando išstumti regeneracinę-plastinę mediciną už tokių diskusijų ribų, pirmiausia naudodami suaugusiųjų kamieninių ląstelių rezervus, o ne embrionines kamienines ląsteles.

Truputis embrioninių kamieninių ląstelių išskyrimo istorijos

Terato(embrioninės)karcinomos ląstelės buvo išskirtos iš savaime atsiradusių 129/ter-Sv pelių sėklidžių teratomų, savaiminių Lt/Sv pelių kiaušidžių teratomų ir iš teratomų, gautų iš ektopiškai persodintų embrioninių ląstelių ar audinių. Tarp tokiu būdu gautų stabilių pelių terato(embrioninės)karcinomos ląstelių linijų kai kurios buvo pluripotentinės, kitos diferencijuojosi tik į vieną specifinį ląstelių tipą, o kai kurios buvo visiškai nepajėgios citodiferenciuotis.

Vienu metu dėmesys buvo skiriamas tyrimams, kurių rezultatai rodė galimybę grąžinti terato-(embrioninės) karcinomos ląsteles į normalų fenotipą po jų įvedimo į besivystančio embriono audinius, taip pat genetiškai modifikuotų terato-(embrioninės) karcinomos ląstelių kūrimo in vitro darbams, kurių pagalba buvo gautos mutantinės pelės žmogaus paveldimos patologijos biologiniam modeliavimui.

Terato-(embrioninių) karcinomos ląstelių linijoms išskirti buvo naudojamas sąlyginis suspensijos kultivavimas. Kultūroje terato-(embrioninių) karcinomos ląstelės, kaip ir ESC, auga iki embrioninių kūnelių ir joms reikalinga disociacija linijos perkėlimui, išlaikant pluripotentiškumą embrioninių fibroblastų maitinamajame sluoksnyje arba suspensijos kultivavimo metu sąlyginėje terpėje. Pluripotentinių terato-(embrioninių) karcinomos linijų ląstelės yra didelės, sferinės, pasižymi dideliu šarminės fosfatazės aktyvumu, sudaro agregatus ir geba diferenciuotis įvairiomis kryptimis. Įvestos į blastocistą, jos agreguojasi su morula, todėl susidaro chimeriniai embrionai, esantys įvairių organų ir audinių sudėtyje, kurių sudėtyje randami terato-(embrioninių) karcinomos ląstelių dariniai. Tačiau didžioji dauguma tokių chimerinių embrionų žūsta gimdoje, o išgyvenusių naujagimių chimerų organuose svetimos ląstelės aptinkamos retai ir jų tankis yra mažas. Tuo pačiu metu smarkiai padidėja navikų (fibrosarkomos, rabdomiosarkomos, kitų tipų piktybinių navikų ir kasos adenomos) dažnis, o naviko degeneracija dažnai pasireiškia chimerinių embrionų intrauterininio vystymosi laikotarpiu.

Dauguma terato-(embrioninių) karcinomos ląstelių normalių embrioninių ląstelių mikroaplinkoje beveik natūraliai įgyja piktybinių neoplastinių savybių. Manoma, kad negrįžtamas piktybiškumas atsiranda dėl protoonkogenų aktyvacijos struktūrinių pertvarkymų procese. Viena iš išimčių yra embriono karcinomos linijos SST3 ląstelės, gautos iš pelių sėklidžių teratomų (linija 129/Sv-ter), kurios pasižymi dideliu gebėjimu integruotis į embriono audinius ir organus be vėlesnio naviko susidarymo chimerinėse pelėse. Terato-(embrioninių) karcinomos ląstelių linijų dariniai chimerinėse pelėse praktiškai nedalyvauja pirminių gonocitų formavime. Matyt, taip yra dėl didelio chromosomų aberacijų dažnio, būdingo daugumai terato-(embrioninių) karcinomos linijų, kurių ląstelėse stebima ir aneuploidija, ir chromosomų anomalijos.

Laboratorinėmis sąlygomis buvo gautos kelios stabilios žmogaus terato-(embrioninės) karcinomos ląstelių linijos, pasižyminčios pluripotentiškumu, dideliu proliferaciniu aktyvumu ir gebėjimu diferenciuotis augimo kultūrose metu. Visų pirma, žmogaus terato-(embrioninės) karcinomos ląstelių linija NTERA-2 buvo panaudota neuronų citodiferenciacijos mechanizmams tirti. Po šios linijos ląstelių transplantacijos į naujagimių žiurkių priekinių smegenų subventrikulinę sritį buvo stebima jų migracija ir neurogenezė. Netgi buvo bandoma persodinti neuronus, gautus kultivuojant terato-(embrioninės) karcinomos linijos NTERA-2 ląsteles, pacientams, patyrusiems insultą, o tai, anot autorių, pagerino ligos klinikinę eigą. Tuo pačiu metu nebuvo užfiksuota persodintų terato-(embrioninės) karcinomos linijos NTERA-2 ląstelių piktybiškumo atvejų pacientams, patyrusiems insultą.

Pirmąsias nediferencijuotų pluripotentinių pelių embrioninių kamieninių ląstelių linijas devintojo dešimtmečio pradžioje gavo Evansas ir Martinas, išskyrę jas iš blastocistos vidinės ląstelių masės – embrioblasto. Izoliuotos ESC linijos ilgą laiką išlaikė pluripotentiškumą ir gebėjimą diferencijuotis į įvairius ląstelių tipus veikiant veiksniams specialioje kultūros terpėje.

Pats terminas „embrioninės pluripotentinės kamieninės ląstelės“ priklauso Leroy Stevensui, kuris, tyrinėdamas tabako dervos poveikį navikų vystymosi dažnumui, atkreipė dėmesį į savaiminį sėklidžių teratokarcinomos atsiradimą kontrolinės grupės linijinėse (129/v) pelėse. Sėklidžių teratokarcinomų ląstelėms buvo būdingas didelis proliferacijos greitis, ir esant pilvo ertmės skysčiui, jos savaime diferencijuojasi, formuodamos neuronus, keratinocitus, chondrocitus, kardiomiocitus, taip pat plaukų ir kaulų fragmentus, tačiau be jokių atitinkamo audinio tvarkingos citoarchitektūros požymių. Įterptos į kultūrą teratokarcinomos ląstelės augo kaip pluripotentiniai klonai, neprisijungę prie substrato, ir suformavo embrioninius kūnus, po kurių nustojo dalytis ir patyrė savaiminę netvarkingą diferenciaciją į neuronus, glijas, raumenų ląsteles ir kardiomiocitus. Stevensas nustatė, kad pelių teratokarcinoma 129/v turi mažiau nei 1 % ląstelių, galinčių diferenciuotis į įvairias specializuotas somatines linijas, o pati diferenciacija priklauso nuo jas veikiančių veiksnių (pilvaplėvės skysčio sudėties, subrendusių ląstelių produktų ar audinių, pridėtų prie kultūros). Leroy Stevensono hipotezė apie gemalo linijos embrioninių pirmtakų ląstelių buvimą tarp teratokarcinomos ląstelių buvo patvirtinta: embrionų embrioblastų ląstelių iš preimplantacinių embrionų suspensija suaugusių pelių audiniuose suformavo teratokarcinomas, o iš jų išskirtos grynos ląstelių linijos po intraperitoninio suleidimo recipientams diferencijuojasi į neuronus, kardiomiocitus ir kitas somatines ląsteles, gautas iš visų trijų gemalo sluoksnių. In vivo eksperimentuose ESC (gautų iš embriono, bet ne trofoblasto) transplantacija į kitos linijos pelių embrionus blastomerų stadijose 8–32 lėmė chimerinių gyvūnų (be navikų išsivystymo) gimimą, kurių organuose buvo rasta donoro audinių daigų. Chimerizmas buvo pastebėtas net gemalo ląstelių linijoje.

Iš pelės embriono lytinių užuomazgų išskirtos pirminės progenitorinės gemalo ląstelės morfologija, imunologiniu fenotipu ir funkcinėmis savybėmis atitiko Stevensono metodu iš teratokarcinomos ir embrioblastų gautas ESL. Chimerose, gimusiose po ESL įvedimo į blastocistą, alofeno organų morfogenezei buvo būdingas mozaikinis donoro ir recipiento struktūrinių ir funkcinių vienetų – kepenų, plaučių ir inkstų – kaitaliojimas. Kai kuriais atvejais buvo stebimas žarnyno kriptų arba kepenų skiltelių, sudarytų iš recipiento ir donoro ląstelių, susidarymas. Tačiau morfogenezė visada vykdavo pagal rūšies, kuriai priklausė recipientas, genetinę programą, o chimerizmas apsiribodavo išskirtinai ląstelių lygmeniu.

Tuomet buvo nustatyta, kad ESL proliferacija be citodiferenciacijos ant mezenchimo kilmės ląstelių (vaisiaus fibroblastų) maitinamojo sluoksnio vyksta esant privalomam LIF buvimui selektyviose maitinamosiose terpėse, kurios selektyviai užtikrina tik kamieninių ir progenitorinių ląstelių išlikimą, o didžioji dauguma specializuotų ląstelių elementų žūsta. Naudodamas tokius metodus, 1998 m. Jamesas Thomsonas išskyrė penkias nemirtingas embrioninių kamieninių ląstelių linijas iš žmogaus blastocistos vidinės ląstelių masės. Tais pačiais metais Johnas Gerhartas sukūrė nemirtingų ESL linijų išskyrimo iš keturių–penkių savaičių amžiaus žmogaus embrionų lytinių gumburėlių metodą. Dėl savo unikalių savybių vos po dvejų metų embrioninės kamieninės ląstelės ir galutinių audinių kamieninės ląstelės pradėtos naudoti regeneracinės medicinos ir genų terapijos praktikoje.