Embrioninės kamieninės ląstelės

Iš embriono kamieninių ląstelių atradimas - ten buvo ne atsitiktinumas ir atsirado ant paruošto grunto tyrimus dėl vystymosi biologijos mokslinių tyrimų srityje. Terminas "kamieninių ląstelių" buvo pristatytas į medicinos 1908 metu Hematologijos Kongreso draugijos Berlyne, Aleksandro Maximov taikomas kraujodaros ląsteles. Ilgai, kol izoliavimo ir paruošimas stabilių linijų pliuripotencinių embrioninių kamieninių ląstelių ankstyvoje kūrimo mokslinių tyrimų proceso naudojamas kamieninių terato- (embrionų-karcinomos ląstelės, su kuria tiriamas nežinomus mechanizmus embriogenezės, įskaitant, kad išankstinio genų ir baltymų produktų savo darbo išraiškos seka.

Bet ar žmogaus genomo totipotencija nepagrįstai prarandama evoliucijos procese? Ne, embriogenezė yra įrodymas. Jei taip, tada, kai iš principo bus realizuotas antrasis evoliucinės raidos kelias? Tikriausiai, kai žmogus palieka Cosmosą, kur aplinkos sąlygos bus santykinai pastovios gana ilgą laiką. Kaulų tankio sumažėjimas (kaulų demineralizacija į nesvarumo būklę) labai lėtai linkusios rekonstruoti ir atnaujinimas gali būti laikomas pirmuoju žingsniu į žmogaus adaptacijos procese kaip egzistencijos rūšių erdvėje. Tačiau mokėjimas už antrąjį evoliucijos vystymosi kelią bus kitoks - sterilumas bus visų totipotencijų ir absoliuto plastiko ląstelių grąžinimo kaina. Taigi daugintis šiame "evoliucinių chameleonų" pasaulyje neturės miozės, otpočkovaniem. Bet mes gyvensime ilgai. Telomerazės nemirtingumas yra amevos nemirtingumas. Daugelio ląstelių organizme kamieninės ląstelės yra kiekybinio ir kokybinio ilgaamžiškumo pagrindas.

[1], [2], [3], [4]

Embrioninių kamieninių ląstelių šaltiniai

Šiandien šaltiniai embrionines kamienines ląsteles laboratoriniai tyrimai linija pelių teratokarcinoma (129 / SV, F19, F8, Žin 40, CGR 86, rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ir žmogaus teratokarcinoma (NTERA-2, TERA-2 H-9 klonas), taip pat hess Trauneona. Tačiau buvimas išsamiai ląstelių pasą, nurodant imuninę fenotipas, chromosomos analizės rezultatus mRNR ekspresijos profilius veikiami receptoriai ir baltymų ląstelėje signalizacijos nekompensuoja reikšmingų trūkumų teratokartsinomnyh linijos ESRK - Rapid praradimo totipotency ir negalėjimo taikymo atliekant klinikinius tyrimus, ir mišrios diferenciaciją kultūra yra labai sunku atskirti gryna specializuota linija iš heterogeninės ląstelių populiacijos. Todėl, paprastai kodo ESC linijos pagamintas klinikiniais tikslais, tarnauja kaip vidinio ląstelių masės blastocistos, embrionų individualūs blastomeres iš 8-ląstelių vystymosi stadijoje, ląstelės morulė vėliau etapus, taip pat pirminiai embrioninių ląstelių.

Reikėtų pažymėti, kad teratokarcinomos ląstelės, nors ir turi pliuripotency, turi daug mažesnį potencialų, palyginti su ESC. Jų integracija su embrioninėmis ląstelėmis retai sukelia chimerų formavimąsi, be to, niekada nesudaromos gametos su teratokarcinomos ląstelių genotipu. Manoma, kad tai yra dėl to, kad dažnai atsiradimo metu ląstelių kultūros teratokarcinoma chromosomų anomalijos: nuostolius Y chromosomos trisomija, veislės, trynimų ar perk.

Bandymai atskirti žmogaus ESC liniją buvo atliekami daug kartų, tačiau ši užduotis nebuvo išspręsta, nes įprastų žmogaus blastocistų sunku pasiekti objektus. Be to, žmonėms chromosomų pakitimų dažnis yra didesnis negu gyvūnų embriogenezė. Dauguma ankstyvųjų žmogaus embrionų, gaunamų po apvaisinimo in vitro, pasižymi chaotišku chromosominiu mozaicizmu ir dažnai yra skaitinių ir struktūrinių aberacijų. Net ir vėliau, blastocisto stadijoje, tik 20-25% žmogaus embrionų sudaro ląstelės su normaliu kariotipu. Šiems embrionams buvo beveik neįmanoma sukurti ESK, nes zigotonai paprastai buvo kultivuojami iki dviejų ar keturių blastomerų stadijų ir vėliau persodinami į gimdą. Tik palyginti neseniai buvo patikimas metodas, sukurtas apvaisintų žmogaus kiaušialąstų auginimui į blastocistų stadiją. Šio metodo įvedimas į in vitro apvaisinimo praktiką ne tik padidino sėkmingo implantacijos rezultato dažnį, bet ir padarė įprastus blastocistus labiau prieinamus objektus.

Kitas kamieninės ląstelės, šaltinis yra pirminiai lytiniai ląstelės, kurios, priešingai nei labiau išsivysčiusių kamieninių gyventojų germenativnogo epitelis yra ne beta-integrinu paviršiaus, tačiau išreikšti didelio aktyvumo shelochnoy fosfatazės. Reikėtų pažymėti, kad atsižvelgiant į kamieninių ląstelių, kurios susiformavo iš pirminių lytinių ląstelių populiacijos eksperimente yra tiriamas su 80-ųjų praėjusio šimtmečio. Tuo pačiu metu jis buvo suprojektuotas ir įrangos parinkimas pirmapradžiai lytinių ląstelių iš pelės embriono gemalų lytinės liaukos. Pirmieji nesėkmingų rezultatų auginant pirmykštes ląstelėse in vitro rodo, kad šių pastangų beprasmiškumą, kaip ląstelių, nors išliko, bet ne daugintis ir mirė per pirmą dieną. Vėliau buvo nustatyta, kad pirminiai pelių lytinių ląstelių proliferaciją in vitro vyksta dalyvaujant tik buvimo mitybinės terpės tirpių ir su membrana specifinis polipeptidinių augimo faktorių. Daug tyrimai parodė, kad tai yra būtina, auginimo terpėje, ne tik LIF buvimas, bet membrannosvyazannyh ir plieno tirpus faktorius (SIF) dėl išlikimo ir proliferacijos pirminių lytinių ląstelių. Šie peptidai yra gaminamas somatinių ląstelių embrionų homozigotinį Metalinių mutacijos, ir vienas iš jų yra Prasłowiańskiego-onkogeno cKit ligandas.

Žinduolių ir žmonių pirminės embrioninės ląstelės yra extragonadal kilmės ir yra lytinio ląstelių linijos klonų vystymosi šaltinis. Starting Line pirmapradis gemalo ląsteles, taip pat visus embriono ir extraembryonic Mezoderma audinius suteikia epiblast (pirminė ectoderm) Ankstyvas embrionų turinčius mozaikos struktūrinę organizaciją. Įvairių ankstyvo embriono dalių mikrokirurginis pašalinimas sukėlė lokalizacijos zoną pirminių lytinių ląstelių pirmtakų klono epiblastuose. Remiantis rodamino dekstranu, kuris buvo naudojamas kaip ląstelių žymeklis, nustatyta, kad pirminių lytinių ląstelių pirmtakai yra proksimaliniame epiblasto regione, šalia ekstra embrioninio ectodermo. Pirminė lytinių ląstelių linija atsiranda iš 45 ląstelių klonų, kurių paskirstymas prasideda gastruliavimo pradžioje. Tada atsiranda klonų atskyrimas, o gastruliavimo metu pirminės lyties ląstelės patenka į ekstraembryninę mezodermą ir yra rasti alantoiso pumpurų pagrinde už pagrindinės grupės. Iš ten pirminiai gemalo ląstelės migruoja į endodermos endokervikos ventralinį galą, o po to aktyviai judindami palei apeliacinį žiedą, genitalijų ritinėliai užpildomi migracijos pabaigoje. Migracijos procese, taip pat per pirmąsias 2-3 dienas lokalizacijos gonado rudimento metu, pagrindinės lytinės ląstelės aktyviai plečiasi ir išgyvena aštuonis replikatorinius ciklus. Jei ne iš migracijos pradžioje, yra apie 50 pirminių lytinių ląstelių, daugiau nei 25 000 lytinių keteros pelės embrionų dvylika dienų nuo pirmykščių gemalinių ląstelių skaičius.

Funkcinis panašumas ESRT ir pirmykščių gemalinių ląstelių demonstruoja visišką integraciją pastarajai atstatomosios blastocistos vidinės ląstelių masės ir po to visą plėtrą embriono, audinio, kuris susideda tik iš palikuonių pirmapradžiai ląstelėse. Pagal kitas savybes pelių pirminiai lytinių ląstelių PGCs taip pat buvo identiški, rodo galimybę išsivystyti į skirtingomis kryptimis, pats formuoti embryoid įstaigas in vitro, in vivo forma teratomas, kai, įšvirkšti į poodį į imuninės sistemos pelių panašūs spontaniškai teratomas sėklidžių pelėms linija 129 / ter.

Nustatyta, kad, kai pridedamas prie LIF terpę, ir tirpaus membrannosvyazannogo SIF izoliuoti pirminius ląstelėse 8 dieną pelių embrionai išgyventi ir daugintis kultūroje 4 dienas, bet tada mirti. Be to, laikotarpis, kai mirties kultūra pastebėta pirmykštes gemalo ląstelių sutampa su plėtros pelės embrionų (12.5-13.5 dienas) etape, kai pumpurai pirminiai gonadalinių moterų lytinių ląstelių įvesti mejozėje, ir vyrų pirminių lytinių ląstelių yra blokuojami mitozinio padalinys. Tačiau, jei jūs įtraukiate į aplinką ne tik augimo faktoriai LIF ir iš SIF, bet ir FGF2, pagrindinis lytinių ląstelių toliau proliferirovat ir subkultūros susiformuoja ląstelių kolonijos gali daugintis net po to, kai pašalinama iš augimo veiksnių (SIF ir FAF) aplinkoje. Tokios ląstelės gali būti auginamos ant ilgo substrato embrioninių fibroblastų be tirpaus augimo faktoriaus LIF to. Šie stabilios ląstelių linijos kilęs iš pirmykščių ląstelėse, ir buvo prašomi skambinti embriono gemalinių ląstelių. Šis terminas negali būti laikoma sėkminga, nes, kai išauginti EG-ląstelės negali gauti embrioninių lytinių ląstelių, galinčių atlikti tolesnius etapus oogenezei ar spermatogenezei. Taip yra dėl to, kad EG-ląstelių linijas, nors gautos iš pirmykščių ląstelėse, tačiau įgyti dėl embrioninių kamieninių ląstelių pliuripotencinių savybes kultūros praranda gebėjimą padaręs germenativnye liniją. Kitaip tariant, pagrindinis lytinių ląstelių auginimo metu prarasti savo savybes lytines ląsteles virsta pirmtakų ir ESC-kaip pliuripotencinių ląsteles.

Pažymima, kad, kai imunodeficient EG pelės yra skiriamos teratomos nesukelia. Manoma, kad žmogaus EG-ląstelių praradimas gebėjimas sukelti teratomas dėl to, kad šios linijos nebuvo sukurtas tiesiogiai iš išaugintų pirmykščių ląstelėse, ir yra gautas iš ląstelių, išskirtų iš embryoid įstaigoms. Todėl yra įmanoma, kad jie yra pluripotencinių, bet jau įvykdytų ląstelių palikuonys.

Reikėtų pažymėti, kad yra esminių skirtumų tarp EG ląstelių ir pirminių lytinių ląstelių. Pastarosios neleidžia gauti chimerinių pelių embrionų, o tai rodo, kad pirminių gemalų ląstelių gebėjimas integruotis į vidinę ląstelių masę ar trophektodermą nėra. Gyventojų savybes pirmapradžiai lytinių ląstelių panašūs į daugumą somatinių ląstelių padarytus linijų vėliau embrionų, įžangoje kurių į blastocistos pat susidaro iš chimeriniais embrionų formavimo.

Modifikavimo metodai kultivavimą embryoid kūnus, gautus su EG-agregacijos ląstelių leidžiamų atrankos į pasirinktinio žiniasklaidos gauti kitą pliuripotencinių ląstelių populiaciją, vadinamas gautos iš embryoid įstaigos (embryoid kūno kilmės ląstelės - EBD-Cells) ląstelės. EBD ląstelių gebėjimas ilgą laiką daugintis kultūroje leido sukurti stabilų ląstelių ląstelių linijas. Gauta ląstelių klonai, ekspresuojantys platų spektrą specializuotų ląstelių mRNR ir baltymų žymeklių. Šis metodas, kaip rezultatas įrodyta, kad pagrindinis lyties žmogaus daugiapotencinės ląstelės, ir diferencijuoti in vitro į įvairias ląstelių tipus: neuronų, glia, kraujagyslių endotelio ląstelių, kraujodaros, raumenų, ir endodermal ląstelių.

Alternatyvūs embrioninių kamieninių ląstelių šaltiniai

Alternatyvus ESC linijų šaltinis gali būti hibridinės ląstelės. Implantacija į pseudopregnant karvių geterogenomnoy struktūros gaunamas, kai sujungus per elektroporacijos fetusa žmogaus somatinėse ląstelėse su kiaušinių karvių, kurios anksčiau buvo pašalintas iš probranduolį gimdos, todėl galima gauti vidinį ląstelių masę prieš implantaciją embriono dirbtinių vystymosi etapais. Šiam tikslui, pirmoje pakopoje yra gautas iš blastocistos kiaušinių karvės transplantuoto žmogaus ląstelių branduolio.

Antrame etape embrioblastas ekstrahuojamas iš blastocisto, o iš jo - ESC pagal Thomsono metodą. Ji yra Pažymėtina, kad geriausi rezultatai atskyrimo ESC linijų pagal šį metodą buvo gauti naudojant branduolius folikulų ląstelių arba pirminių lytinių ląstelių, kurios išlieka žmogaus kūno į užmigdymo būseną. Tai yra dėl to, kad karvės kiaušinių persodinto žmogaus ląstelės branduolys neukorochennye turėtų turėti didelio aktyvumo ir Telomera telomeazy, kad išvengiama per anksti senėjimo ESS klonai, gautų iš hibridinių kiaušinio (Repin, 2001). Yra žinoma, kad svarbiausi ląstelėje baltymus žymenis PGCs yra Oct3, Oct4, TCF, Groucho, kuris priklauso vadinamųjų duslintuvų, chromatino baltymų. Silentai užtikrina ypač kompaktišką heterohromatino pakuotę, kuri neleidžia formuoti euchromatino kilpų. Chromatino pakuotė, kurią sukelia šie baltymai, koreliuoja su ESC genomo totipotencija. Šiandien nustatė, kad brandus kiaušinių galvijų ir žmonių yra vienintelė rūšis specializuotų ląstelių, kurių sudėtyje yra didelės koncentracijos baltymų į citoplazmą duslintuvus. Tuo remiantis buvo sukurtas hibridinių ESK gamybos metodas, perduodant somatinių ląstelių branduolius karvių nebranduolinėms ovulėms. Preliminarų tyrimai in vitro parodė, kad oocitų karvių Citoplazmos atkuria totipotency genomą žmogaus somatinių ląstelių branduolių po 12-24 valandų kultūros.

Ypatingas susidomėjimas yra duomenys apie žmogaus embrionų išankstinio implantavimo atsiradimo požymius, kurie rodo, kad totipotencinių ląstelių vėliau pakeičiama pluripotentinių ląstelių populiacija, palyginti su pelėmis. Tyrimas ląstelių transformaciją parodė, kad nuo vidinio ląstelių masės žmogaus blastocistos ląstelių, ESK Be to, yra ir trofoblastų ląstelės, nurodant jų bendrą potenciją.

Yra žinoma, kad blastocisto stadijoje yra dvi skirtingos ląstelių populiacijos. Vienas iš jų yra išorinis blastocisto sluoksnis, trofekodermas, gautas iš trofoblastinių ląstelių ir kitų embrioninių placentų komponentų. Antroji ląstelių populiacija yra sugrupuota į tankią masei, kuri yra susijusi su tropekodermo vidiniu paviršiumi. Vidinės ląstelių masės ląstelių populiacija yra gaunama iš visų embrionų organų audinių ir mikrobų. Vėlyvojo blastocisto stadijoje iš vidinės ląstelės masės susidaro ekstra embrioninė endodermas ir formuojamas epiblastas (pirminis ectodermas). Tuo pačiu metu epiblasto ląstelės išlaiko pliuripotencialą, o gebėjimas diferencijuoti ląsteles iš antrinių endodermų yra ribotas.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Gauti žmogaus embrionines kamienines ląsteles

Dar visai neseniai buvo manoma, kad neįmanoma gauti ESF iš trofoblasto. Tačiau diploidinius linija trophectoderm kamieninės ląstelės, išskirtų iš blastocistos terpėje, kuriame yra, o ne LIF ir FGF2 heparino, proliferates ir yra transformuojamas į kamieninių ląstelių. Jei pašalinsite nuo FGF2 viduryje, kad trophectoderm ląstelės sustabdyti veisimo, jie pradeda Endoreduplikacija chromosomų ir ląstelių elementų trofektodermalnye pamažu virsta milžinišką trofoblastų ląsteles. Tikriausiai, LIF ne stimuliuoja proliferaciją trophectoderm ląstelių dėl to, kad FGF2 suaktyvinančios mechanizmas transsignalizatsii kaip FGF2, surišta citoplazminio receptoriaus (FGFR2), aktyvuoti MAP kinazės citoplazmą - ERK1 ir ERK2. Todėl, kai įtrauktas į vienos signalinio kelio blastocistos ląstelių (LIF - gpl30 - JAK-kinazės - STAT3) vidiniai ląstelių masės ląstelės yra transformuojami į pliuripotencinių hESCs, iki kol antrą mechanizmą transmembraniniu signalizacijos (FGF2 - FGFR2 - MAP kinazės ERK1 / ERK2) Blastocistoje susidaro trophektodermo kamieninės ląstelės. Savo ruožtu signalų kelio pasirinkimas priklauso nuo oct4 geno veiklos. Šis genas, priklausanti POU domeno, esantis lokuso t 17 autosomes ir yra išreikšti oogenezei metu, smulkinimo laikotarpį, taip pat ląstelių į vidinį ląstelių masės blastocistos, ir pirminių lytinių ląstelių. Funkcinį vaidmenį oct4 genas yra koduojantis transkripcijos faktorius, reikalingą pliuripotencinių ląstelių, jų diferenciacijos ir dedifferentiation atsiradimo.

Okt4 geno išraiška ESK priklauso nuo šio transkripcijos faktoriaus ir kofaktorių sąveikos. Okt4 ekspresijos kryžminis reguliavimas blastocistuose parodė, kad kai jo aktyvumas mažėja, pusė ląstelių formuoja trophektodermą, o su padidėjusia indukuota okt4 ekspresija, vyrauja ESC.

Eksperimento metu ESC negalima paversti linija, kai auga totipotenciniai blastomerai suspaudimo metu, taip pat gastruliavimo ir vėlesnių embrionų vystymosi stadijų metu. Pelės ESRT paprastai skirti ne 3.5-4.5 dienų nėštumo, kuri atitinka į šeštąjį (vieno sluoksnio blastocistos) ir septintojo etapais (dviejų sluoksnių blastocistos - anksti kiaušinių balionas) normalus embriogenezės. Akivaizdu, kad tik priešinplantacijos laikotarpiu pelių embrionuose yra ląstelių populiacijų, kurios gali būti transformuotos į ESC. Todėl ESC linijų izoliavimas yra įmanomas tik tam tikruose embriogenezės etapuose. Totipotent, atsižvelgiant į galimybę sukurti gyvybingą embrioną su embrioninėmis membranomis ir placenta, yra zigotas ir blastomerai, kurie kyla suspaudimo metu. Visų germininių ląstelių potencijos praradimas prasideda praėjusio morulo etape, kai tolesnis blastomerų pūtimas priklauso nuo jų vietos. Ankstyvi morulė blastomeres išlaikyti totipotency kaip eksperimentinės manipuliacijos su keičia savo vietą, pavyzdžiui, jų vietą inversijos, netrukdo aukštos kokybės embriono vystymąsi.

Nustatyta, kad ESC išsiskyrimo efektyvumą linijoje paveikia blastocistų būklė jų paaiškinimo metu. Iš blastocistų naudojimas po septynių dienų modeliavimo diapause į lytinių takų pelių, kurioms pašalintos kiaušidės 3,5 dienų nėštumo ir gydomi progesterono, prisideda prie sėkmingesnės atskyrimo linijos embrionines kamienines ląsteles. Manoma, kad tokiomis sąlygomis padidėja blazometrų, sudarančių vidinę koreliacinę masę, skaičius. Taip pat yra įmanoma, kad ląstelių ciklas išsiplės ir dauguma blastomerų patenka į G0 fazę.

Be to, stabilių pliuripotencinių žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių linijų kūrimas priklauso nuo genotipo embrionų: gana lengvai atskirti nuo ESRT Pelės blastocistos linija 129, yra žymiai sunkiau gauti juos naudojant peles CS7BL / 6 ir praktiškai neįmanoma atskirti liniją nuo hESCs blastocistų ENA / Ca pelėmis. Akivaizdu, kad ankstyvieji embrionai turi keletą genetinių savybių, turinčių įtakos pluripotentės ESC linijos vystymui. Tačiau, kai kultivuojamos epiblast izoliuoti, taip pat, selektyviai atrankos diferenciacijos hESCs ląstelių linijos, iš pradžioje embrionų ENA / Ca pelių buvo vis dar skiriama.

Įrodyta, kad standartinė technika, skirta gauti ESK linijas iš blastocistų, pateikta laboratorijos vadovuose dėl eksperimento su ankstyvaisiais embrionais metodo. Eksperimentinės ESK linijos taip pat gali būti gautos, išskirdamas 4,5 dienų mielių embrionų išskirtą epiblastą (pirminį ectodermą) su gana sudėtinga mikrokirurgine technika ir modifikuotomis kultivavimo sąlygomis. Šios procedūros sudėtingumas yra pateisinamas, nes ESC linijų susidarymo dažnis buvo daug didesnis nei darbas su vidine ląstelių masine blastocistu.

Siekiant išskirti ESC linijas, kiekvienas klonas perduodamas į mikrochainą, išauginamas 40-60 ląstelių agregatas, jis vėl išsklaidomas. Kelis pasikartojimų Šios procedūros leidžia gauti imortalizuotą ESK liniją su didžiausių proliferacija kurso normokariotipnyh ląstelių pritvirtintomis prie plastiko, kuris per ištraukas 50-100 išlaikyti totipotency ir aukštą telomerazės aktyvumą. Patvirtinančių proceso linijos ESC didžiausias pavojus yra taršos arba serumo bakterinių endotoksinų - net pėdsakai endotoksino koncentracija į terpę sukelia masės mirtį nesubrendusių lytinių ląstelių. Rūpestingai kontrolės linijinio augimo ir laiku sklaidos ESRT į kultūrą yra pajėgi simetriškai dalijimosi, kuriame abi dukterinės ląstelės lieka daugiapotencinės ir gali atlikti neribotą skaičių mobilieji ciklų, išlaikant diploidinis kariotipu ir visą potenciją.

Švarios ESRK populiacijos pasirinkimas gali būti atliekamas transfektuojant į savo genomą rekombinantinių DNR molekulių, turinčių geną, koduojantį žalią fluorescencinį baltymą (GFP). Išraiška GFP didėja auga ESCS aplinkoje atraminio jų proliferaciją, kadangi genų ekspresijos lygio diferenciacijos pradžia yra sumažintas, kuri leidžia pasirinktų selektyviais vidutinių gryno patvaraus, pliuripotencinių ląstelių linijų. Kai kultivuojamas su GFP selekcija ESC, kolonijų dažnis labai padidėja, nes selekcinių augalų sąlygomis eliminuojamas stiprus antiproliferacinis diferencijuotų ląstelių poveikis.

Vertimo žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių linijos priemonėmis jų metodo izoliacijos priešimplantaciniu embrionų (žingsnio 80-120 ląstelių), kurie lieka po to, kai in vitro apvaisinimo procedūrą. Dėl šios priežasties dirbtinai gautos "perteklinės" embrionai mechaniškai išsklaidomi Delbecco-Needle aplinkoje. Po to, kai ženklinimo ląsteles su monokloniniais antikūnais, selektyvaus fluorescentinį žymenį embryoblast izoliuotų ląstelių. Embrioblastas disperguoja į atskiras ląsteles naudojant disaspazės-kolagenozezės mišinį. Disocijuoja ląstelės buvo auginamos specialioje terpėje (80% Delbekko vidutinės + 20% veršiuko embriono kiekį kraujo serume, IL-6, LIF ir SCF 500 ųg / ml buvimą) dėl embrioninių fibroblastų monosluoksnio FINANSUOJANČIOJO pirmi 3 ertmę. Tokiu būdu išgyvenimo ir proliferacija kamieninių ląstelių ir kamieninių yra palaikoma poveikio IL-6, LIF ir SCF. Šioje aplinkoje, pakabos hESCs augti klonai osharennyh nepritvirtintos ląstelių turi būti atsietas švelniai kelis pipete. Nauji klonai laikomi suspenduotoje kultūroje 5-7 dienomis. Maksimalus ESK augimo greitis pasiekiamas pakartotinai disonuojant klonus 10-15 ląstelių stadijoje. Tada kiekvienas klonas pernešamas į mikocelę ir išauginamas iki 40-50 ląstelių. Procedūra kartojama daug kartų ištraukas, didinant kultūros apimtis 5-10 milijono ląstelių per 6 cm patiekalas tankis. Naudojant, pavyzdžiui Thomson persėjant jis buvo išskirtas 10 klonai imortalizuotas žmogaus ESCS kuri per ištraukas 100 išlaikyti aukštą telomerazės aktyvumą, taip, gebėjimas intensyvaus proliferaciją ir fenotipo savybes mažiausias bendras imunogeniškumo, diferencijavimas pagal bet kurį iš 350 specializuotų ląstelių linijų, kad yra gaunami Eko, Mezas - ir endodermas. Diferenciacija žmogaus ESC pradėjo (bent vidutinio, to ir pašalinimo LIF serumo kaitos) su ląstelių prisijungimo prie substrato, nurodant citoskeleto ir adhezijos receptorių vystymąsi. Svarbu, kad su neribotais žmogaus ESK išsiskyrimu būtų išlaikytas įprastas kariotipas.

Antrasis ESC linijų išskyrimo metodas grindžiamas pirminių lytinių ląstelių naudojimu. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad Eu-ląstelių linijos gali būti gaunamos iš 12,5 dienos amžiaus pelių embrionų genitalijų plokštelių. Tačiau šiais atvejais genotipo ląstelių linijų susidarymo dažnis buvo žymiai mažesnis nei bandymuose su ankstesniais embrionais. Tuo pačiu metu pirminės lyties ląstelės iš 13,5 dienos gestacinio amžiaus grybų pelių embrionų paprastai negali transformuotis į linijas.

Pirmosios stabilios pluripotencinių žmogaus EG ląstelių linijos buvo gautos iš pirminių gonocitų, išskirtų iš 5-9 savaičių amžiaus embrionų lytinių organų. Izoliuotos ląstelės buvo kultivuojamos nuo inaktyvuota pelės embriono fibroblastuose DMEM terpėje su vaisiaus serumo substrato, prie kurios buvo pridėta merkaptoetanolio, forskolin, taip pat rekombinantinis žmogaus augimo faktorius (FGF ir LIF). Po 7-12 dienų daugelio ląstelių kolonijos pasirodė kultūroje pagal morfologines savybes ir molekulinius žymenis, atitinkančius žmogaus EG ląsteles. Po agregacijos šie ląstelės sudarė embrionų kūnus, kurių tolesnis vystymasis atsirado specializuotų ląstelių, būdingų visų trijų embrioninių lapų dariniams. Per 10-20 fragmentų EG ląstelių linijos išlaikė įprastą kariotipą ir neprarado daugybės potencialo.

Taip pat parodyta, kad bendras LIF, membraninių ir tirpių plieninių faktorių, taip pat TGF-b, poveikis modifikuoja pirminių lytinių ląstelių vystymosi programą. Užuot sustabdę mitogeninius susiskaldymus ir pradedant diferencijuoti į oogenezę ar spermatogenezę, pirminės lyties ląstelės ir toliau dauginasi. Atlikus keletą papildomų mitozės ciklą jie tampa panašūs į epiblast ląstelių ir prarasti savybes prekursorių ląstelėse, yra konvertuojami į pliuripotencinių EG-embrionines kamienines ląsteles.

Taigi 1998 m. Immortalizuotos pirminių lytinių ląstelių linijos pirmą kartą buvo išskirtos iš žmogaus vaisiaus autopsijos audinio seksualinio išsišakojimo. Žmogaus pirminių lytinių ląstelių embriogeneza atsiras trynio maišeliu trečią savaitę plėtros ir ant 4-5th savaites, šios ląstelės migruoja į seksualinio gumbelis srityje, kur jie sudaro pirminių dormantnye gonocytes gyventojų. Esant neaktyviai būsenai, pirminės lytinių ląstelių lieka gimdoje iki gimimo. Pirminės lytinių ląstelių linijos buvo ekstrahuojamas iš vaisiaus lyties organų gauburėlio 5-9 savaičių amžiaus embrionų nuskaitytų ex tempore audinys, kuris yra gydomi kolagenazės tipo IV-V, hialuronidazės ir labilios dezoksiribonukleazės mišinio kiekybinio ir kokybinio padidėjimas ląstelių išeiga. Pradinės lytinių ląstelių, esančių vaisiaus genitalijų tuberkulio audiniuose, apsuptyje yra Sertoli stromos (mezenchimos) ląstelės. Funkcinis tikslas Sertoli ląstelių yra anti-aprotoniniais veiksnių (Fas-ligandų), mitogenus, ir imunitetą slopinančiais preparatais, kad apsaugoti seksualinių kamienines ląsteles nuo imuninės ataką pagal kūno gamybos. Be to, lytinių organų tuberkuliozės stromos mikroskopijai tenka svarbus lytinių ląstelių brandinimo laikotarpis. Izoliuotos pirminės gemalinės ląstelės yra pasodintos kultūroje per maitinimo stromos sluoksnį, kurį sudaro pirmųjų trijų ištraukų vaisiaus fibroblastus. Veiksmingiausias mitogenų derinys yra kompleksas, kurį sudaro LIF, FGF ir forskolinas (stimuliatorius cAMP formavimui). Platinimo pirmapradžiai lytinių ląstelių in vitro reikalauja vaisiaus serumo to, kad pirminis atgaminimo gonocytes kultūroje klonų, lydimas globuliuotų, neadhezinę ląstelių formavimui substrato buvimą.

JAV Nacionalinių sveikatos institutų dėl apibendrinti turimą informaciją apie paskirstymo žmogaus ESC linijos iš blastocistų metodais buvo padarė preliminarią išvadą, kad sėkmingas paskirstymas ESC greičiausiai, kai išauginti blastocistų su gerai suformuota vidinė ląstelių masė (Kamieninės ląstelės: mokslo pažangą ir ateities mokslinių tyrimų kryptys Nat.Instit, Sveikatos JAV). Iš šio požiūriu, geriausias šaltinis ESRT sukurti linijos yra žmogaus blastocistos 5. Diena plėtros, kurių vidinės ląstelių masės paskirstymas turėtų būti kruopščiai pašalinti trophectoderm. Izoliuota vidinis ląstelių masė, kurią sudaro šiuo 30-35 ląstelių etape turi būti auginamos ant substrato pelių embrioninių fibroblastų, kuris yra lemiamas sąlyga kolonijų kultūros hESCs formavimas.

Embrioninių kamieninių ląstelių fenotipinių ypatybių analizė

Neabejotinas palūkanų tarprūšinis lyginamoji analizė fenotipo savybes ESC. Buvo nustatyta, kad žmogaus ESC kolonijos - tankus grupes plokšti epitelinių ląstelių, o pelės embryoid blauzdos susideda iš palaidų konglomeratas užapvalintais ląstelių. Žmogaus ESC indeksą atominės Plazmatyczny santykis yra mažesnis nei pelės ESRT. Beždžionių embrioninės kamieninės ląstelės formuoja plokščią kolonijų daugiau nelygūs ląsteles. Ankstyvuose ESC primatų klonuose lengvai matomos vienos ląstelės. Plinta hESCs visas gyvūnų rūšis neturi išreikšti MHC I klasės ir II. Tuo pačiu metu, žmogaus ESRT suteikti teigiamą atsakymą į antikūnų Tera 1-60 ir GCTM-2, kuris rodo, buvimą ant jų paviršiaus keratino / chondroitino sulfatas proteoglikanų, būdinga embriono (teratomas) -kartsinomnyh kamieninių ląstelių. Išraiška hESCs visi gyvūnai oct4 geno rūšių rodo, kad, nepaisant fenotipo skirtumus žmogaus ir pelės ESRT, matyt įjungiama tuo pačiu rinkinį genų, atsakingų už išlaikant pluripotency (Peru, 2001). Be to, ESC linijos, pagaminti iš embrioninių žiurkių, kiaulių, triušių, primatų, ir galvijų, turi morfologinės savybės yra panašios, panašus rinkinys molekulinės identifikavimo žymenų ir beveik identiškas molekulinės mechanizmas iš embriogenezę programos įgyvendinimo, kuri leidžia jums imtis naujo pažvelgti į ksenotransplantacija klausimu .

Skirtingai nuo įprastų embriogenezės in vivo, in vitro proliferacija hESCs yra kartu gali būti pateikiama germinaciniuose sluoksnių formavimo ir pereina prie blokuoti homeotic Nohgenov foną, t.y., be organogenezės. Nuo segmentavimo genai neveikia kultūroje hESCs neįmanoma atgaminti tokius laikotarpius embriogenezę tab somite susiskaidymą branduolio, į trynio maišelio, Šlapimo maišas su išlyga ir kitų organų ir audinių formavimas. Kultūrinės ESK buvo užšaldytos, kai prasidėjo 350 specializuotų ląstelių ribinių linijų formavimas. Taigi, klonas dukterinės kamieninių ląstelių ir centralizuotai lokalizuota PGCs yra tik modelis embrionas vystymosi metu, kurioje skirtingos audinio regionai formuojamos vienoje scenoje skiriasi nuo specializuotų ląstelių, gautų, tačiau nuo bendri pirmtakai. Nors minimalaus receptorių hESCs paviršiaus, jie išlaiko gebėjimą atlikti primityvius morfogenetiniai procesus imituoti ankstyvo embrionų struktūros urmu: srutų hESCs kultūros ir agregatų formuoja struktūrą primenanti blastocistos ar dar vėliau embrionus (kiaušinių cilindrai). Tokie suspensijos agregatai buvo tinkamai pavadinti paprastais ir sudėtingais embrionais.

Kai sumaišomas diferencijuoti į įvairias ląstelių embryoid kūno tuo pačiu metu išreikštų anksti genais ectoderm (oct3, FGF-5, mazginis), Endoderma (gata-4), Mezoderma (brachyury), kardiogeninis Mezoderma (PKH-2,5), nervinio vamzdelio (msx3 ) ir hematopoiesis (elkf). Naudojant įvairius derinius citokinų ir augimo faktorių nukreipimui į gemalų sluoksnio kūnelių susidarymą in vitro kai kuriais atvejais tai buvo įmanoma gauti embryoid įstaigas, kurios, pageidautina buvo išreikštų genų ectoderm arba Mezoderma, vedančio į gastrulation ir ankstyvą organogenezės etapo modeliavimo skaičiaus.

Klonų augimas hESCs yra įrodymų, asimetrinės ląstelių dalijimąsi, kurioje tik vienas iš centro klonas ESC išlaiko ne ribojantis reprodukcijos pajėgumą, o kita dukra ląstelių atsiranda kartos kamieninių ląstelių diferenciacija jau ateina. Todėl klono dauginimasis embrioidinio kūno periferijoje yra didesnis nei centre. Augimo klono marginalinės ląstelės patiria spontanišką sutrikusią diferenciaciją, migruojasi arba miršta apoptozės mechanizmais. Šie įvykiai nustatyti klonas likimą, jei neplatinimo lygis viršija migracijos ir apoptozės ląstelių žūtį, klonas dydžiai ir toliau didės, stabilizavimas vyksta su vienodo apoptozės ir formavimosi naują mobilųjį greičio, regresijos norma - atvirkštine santykis šiuose procesuose. Antikūnų ląstelės dalijamos simetriškai, tai yra, abi dukterinės ląstelės toliau diferencijuojamos į subrendusias specializuotas ląstelių linijas. ESC / progenitorių ląstelių santykis skiriasi, bet visada ESC kiekis yra tik dalis progenitorių ląstelių populiacijos procento. Todėl tik kruopštus pipetavimas ir savalaikis klonų išskirstymas gali padidinti ESK skaičių kultūroje. Norint gauti maksimalų ESC derlių, efektyviausias buvo 10-12 ląstelių klonų išskaidymas. Ląstelių diferencijavimo kryptis ir laipsnis embrioidiniame kūne priklauso nuo jų buvimo vietos. Išoriniai embryoid kūno ląstelės neturi išreikšti genas ir oct4 atlikti diferenciaciją pirminės Endoderma ląstelių, iš kurių vėliau suformuotų epitelioidinėmis ląsteles ir parietalinėje extraembryonic visceralinio Endoderma. Embrioidinio kūno vidinės ląstelės ekspresuoja oct4 geną ir palaiko pliuripotency 48 valandų kultūros. Bet tada morfologinės pertvarkymas įvyksta epitelio ląstelių kultūras kultūra prasideda ir išraiška genų, kurie kontroliuoja pirminės ectoderm vystymąsi. Be to, iš viso sutrikusio cytodifferentiation procesas prasideda su įvairių tipų ląstelių, kurios yra dariniai visų trijų sluoksnių lytinių išvaizdą. Netikėto diferenciacijos embryoid kūno ląstelių proceso pirmasis kyla AGGREGATES Endoderma markerius fragmentų (cistos) trynio maišelio formos. Be to, šiose struktūrose pasirodo angioblastai ir augančių kapiliarų endotelio ląstelės. Baigiamuosiuose etapuose spontaniškai diferenciacijos vidaus ląstelių embryoid kūno vystosi įvairių, terminiu būdu, diferencijuotos ląstelės, įskaitant neuronų, glijos elementų, kardiomiocitų, makrofagų ir eritrocitų. Tam tikrose, suderinimo (atsižvelgiant į erdvinę inversija lapų sudarančių embriono audinių) per embryoid organų in vitro gali tyrinėti morfogenetiniai procesus ir analizuoti molekulinius mechanizmus embriono cytodifferentiation pradiniam laikotarpiui, ir nustatyti konkrečių genų vaidmenį šiuose procesuose įgyvendinimą.

Taigi, klonu yra ląstelės, kuriose yra atrasti skirtingi genetinės plėtros programos - ESK, ankstyvieji progenoriai ir diferencijuojančios progenitorių populiacijos. ESC kultivavimas slopinantį lašą arba masės kultūrą be pašarų sluoksnio ir be LIF pridėjimo į terpę neišvengiamai sukelia embrioidinių kūnelių susidarymą. Embrioidinių kūnų išorinių ir vidinių sluoksnių ląstelių morfologija yra kitokia. Išorinis sluoksnis susideda iš didelių procesų elementų. Jų paviršius, nukreiptas į aplinką, yra padengtas daugybe mikrovilių. Išorinis ląstelių sluoksnis yra atskirtas nuo vidinės bazinės membranos, panašios į Reichert membraną, o vidiniai embrioidinių kūnelių sluoksniai yra cilindrinis epitelis. Morfologiškai vidinis sluoksnis, nors ir turintis daug dalijimosi ląstelių, labiau primena nesiferencijuotas ESC kolonijas.

Žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių ypatybės

Nebuvimas parenchiminių-mezenchiminių sąveiką fono signalo blokavimo genus homeosis sukelia netvarkingai augimą PGCs kultūra, nes tai skirtukas yra pažeistas ir formavimas infrastruktūros sąlyginis organai. Neorganizuota augimas ir netvarkingai spontaniškas diferenciacija hESCs į kultūrą dėl to, kad mezenchiminių ženklu stromos sistemą būsimų organų trūkumo: in vitro tai įmanoma milijonų hepatocitų formavimas, bet jūs negalite gauti jokių kepenų skiltelės, įskaitant tokių struktūrinių ir funkcinių elementų, pavyzdžiui, ančių, iš Disse ir Kupfferio ląstelių erdvėje.

Manoma, kad ESRT pluripotency realizuotas tik embriogenezės, kad sudarytų audinius ir organus embrioną, o virkštelės ir placentos yra gaunami trofoblastų. Uždara apvalkale trofektodermalnuyu ESK nuosekliai generuoti ląstelių klonai su išlyga realizuoti kūrimo programa kombinatorines mRNR birių Nohteyaov topografinius matricą, kuri ilgainiui lemiančių erdvine tvarka, forma, matmenimis, skaičių laikinųjų ir galutinių organų ląstelių ir parenchima surinkimas struktūrinės ir funkcinis vienetas. Tuo pačiu metu ESC yra tik ląstelių tipas, kuriame molekulinė mechanizmas realizavimo jų potencialą visiškai atskiriama nuo genetinės plėtros programos ir ESCO patys atimtas sąveikos su kitais ląstelių galimybė susidarius blokavimo abiejų receptorių suvokimo ir transsignalizatsii sistemų. Tačiau pakankamai aktyvavimo ESRT rezultatai palaipsniui diegti embriogenezę programa nesibaigianti gimimo yra visiškai suformuotas ir paruoštas negimdinio gyvenimo organizmo sudaryta iš milijardų ląstelių. Per šį trumpą laiką, tačiau neįsivaizduojama skola mobiliojo ryšio erdvėje kelio neišvengiamą atsiradimo klaidų molekulinius mechanizmus, kurie teikia gyvybines funkcijas ląstelių, ir programas, kontroliuoti jų plitimą, diferenciacijos ir specializacijos. Todėl šiuolaikinėse farmakogenomikai laikomi atskirai ligos molekulinius prietaisus, ir liga ląstelių programavimas. Ir naujų vaistų, skirtų ištaisant diferencijavimo, platinimo ir organogenezės programą, taip pat organų ir audinių regeneracijos vardą dauguma veiksmų. Suaugusiųjų organizmo per ESRT tampa įmanoma kontroliuoti kamieninių / kamieninių ląstelių transplantacija į smegenų, kepenų, blužnies, kaulų čiulpuose ir kitų organų žmogaus elgesį remontas sugadintas gavėjo neparenchiminių organus mokėtinus į diferenciacijos ir specializacijos donoras mezenchiminių ląstelių išlikusių matrica. Iš esmės, totipotency programa pradeda dar kiaušialąstės genomų lygio, zigotos ir blastomeres, tačiau šios ląstelės dar nėra įmanoma klonuoti ir persėti į kiekiais būtinas praktinis ir praktinių medicinos poreikius. Todėl, ESC yra unikalus šaltinis genetinės informacijos, kurioje yra trimatis linijinis apribojimas žemėlapį embriono ir kodus specializuotų ląstelių linijų gastrulation metu.

Beveik neribotas galimybės regeneracinės ESC dėl to, kad jų genomą, priešingai nei genetinio aparato diferencijuotų somatinių ląstelių, palaiko pluripotency. Vienas pasireiškimas ramybės būseną įsišaknijusi ESRK genetinės informacijos vadinamasis minimalus fenotipas - ant išreikšti ribotą skaičių receptorių ESC paviršiaus, todėl dislokuoti labai mažai programų bendrauti transsignalizatsii branduolinę aparatą ląstelės savo mikroaplinka. Prieš užmigdymo genų, atsakingų už specializuotų ląstelių linijų ir diferenciacijos ląstelių apribojimo fone, aktyvuota tik apie 30 iš 500 genų, kurių produktai suteikia bendravimo ląsteles supančią mikroaplinka. Naudojant serijinės analizės genų ekspresijos parodyta metodą, kad iš pagrindinių funkcinių genomo dėžės energiją ir medžiagų apykaitą somatinių ląstelių ir ESRT praėjusių nustatoma labai mažą kiekį mRNR receptorių, G-baltymais, antra pasiuntiniai, transkriptazds reglamentuojančių bendrumas, kofaktoriais išraišką ir represijas tai yra, visa sistema transmembraninis reguliavimo signalų į ląstelę. Taip atsitiko dėl transsanalizacijos genų trūkumo ar labai mažo jų išsiskyrimo. Per diferenciacijos indukuojama ESC 18 operacijos genomo yra sustabdytas sinchroniškai veikianti genai fono aktyvavimo transsignalizatsii 61 geno, kontroliuojantis ląstelių adhezijos receptorių, neląstelinių matricos komponentų sintezę, apribojimas transkriptazds messendzhernyh elementus ir signalų perdavimo sistema, skirta branduolinės vieneto su plazmos ląstelės membranos receptorių. Tuo pačiu metu užblokuotas genų, atsakingų už baltymų slopintuvų sintezės, taip pat genų ekspresiją koingibitorov teikiant totipotency genomų hESCs.

Genetiniai žymenys buvo nustatyti visų trijų embrioninių lankstinukų ląstelėms. Identifikavimo ektoderminiuose ląstelių sluoksnis vykdoma genų ekspresijos mazginis, oct3 ir FGF-5, mesodermal ląstelės - genas brachyury, zeta globino, Endoderma - ne gata-4 genų ekspresiją. Įprastu embriogenezės, gastrulation metu buvo pastebėtas aktyvų migraciją nesubrendusių populiacijų kamieninių ir kamieninių ląstelių, lokaliai paskiriant sritis veido kaulų kaukolės, kai kurių smegenų, periferinės nervų sistemos, širdies laidžiosios sistemos ir užkrūčio liaukos audinio dalių, kurios yra suformuotos iš klonų perkeltų ląsteles. Ląstelių ženklinimo ankstyvieji genai gemalų sluoksnių lengviau topografinių analizė migracijos kamieninių ląstelių besivystančio embriono. Ji yra nustatyta, visų pirma, kad užpildai embryocarcinoma P19 išraiškos pirmojo genas Mezoderma brachyury ląstelės pradeda per genų ekspresijos audinių plazminogeno aktyvatoriaus, A-fetoproteino, keratino 8, ir keratino 19, kuri yra žymenys anksti Mezoderma migracijos populiacijų sumažinimo. Vadinasi, ir audiniuose mesodermal kilmės formavimas prasideda tik po to, migracijos ir nusodintuvas punktas mesodermal kamieninių ląstelių proceso.

Su labai ribotas fenotipo savybes ir daugumos blokus transsignalizatsii ESRK dėlto išreikšti keletą receptorių molekules, kurios gali būti naudojamos siekiant juos nustatyti nėra. Pažymėtina, kad antigenai yra markerius ESC žmonėms ir primatų buvo įprasta. Dažniausiai naudojamas ženklinimo hESCs pažymėtų antikūnų antigenų membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unikalių lipidų antigenai, atstovaujančios sudėtingą glikolipidas GL7 su sialo rūgšties), taip pat aukštos polimerų glikoproteinai TRA-1-81, TRA-1-60. Be to, hESCs išreikšti konkrečią embriono antigeną SSEA-1 ir endogeninio šarminės fosfatazės, taip pat tam tikrą transkripcijos faktorius Oct4. Pastaroji reikia išlaikyti hESCs platinimo mechanizmus - specifinis transkripcijos faktorius Oct4 genas aktyvuoja fibroblastų augimo faktoriaus 4 genų ekspresijos išraišką ir stabilizuoja boksas atsakingas už neapribojantis DNR Reduplikācija nesubrendusiose ląstelių. Svarbiausi ląstelėje žymeklis baltymai yra Oct3, Oct4, TCF ir Groucho, susijęs su baltymų chromatino duslintuvus.

Beveik iš karto po ilgalaikių išaugintų ESRT mėginimų yra nesėkmingas ir organizmas pirmą kartą buvo parengta kultūros kamieninių ląstelių, išskirtų iš pelės blastocistų, ir pirminės embrioninių ląstelių kultūroje pradėjo scenos ESRK pluripotency pajėgumo tyrimams, kai vartojamas ankstyvosiose stadijose embriono vystymuisi. Buvo parodyta, kad tuo morulė ir blastocistos PGCs galėtų suformuoti chimerinius embrionų, kai donoras PGCs palikuonių aptikti visose somatinių audinių ir net lytinių ląstelių. Taigi, Developmental Biology, naudojant ESC skriptų "tiltą" tarp eksperimentinių tyrimų in vivo ir in vitro, kuris žymiai padidėjo mokytis procesai žymes pirminius audinius ir organus, jų diferenciaciją ir embriono organogenezę galimybę.

Jis yra gerai nustatyta, kad in vivo embriogenezės metu ESK integruota į ląstelių masės ankstyvo embriono, ir jų dariniai yra visuose organų ir audinių. PGCs kolonizuoti mikrobų liniją chimerinis ląstelėse, palikuonys, kurie sudaro visą kiaušinį ir spermos. Embrioninės kamieninės ląstelės yra clonogenic - pavieniai PGCs gali sukurti genetiškai identiškas turinčių ląstelių molekulinių žymenų, tarp kurių yra oct4 genų ekspresiją ir šarminės fosfatazės, aukštą telomerazės aktyvumą, taip, taip pat išraiška konkrečių embrioninių antigenų kolonija.

Ištirti embriogenezės mechanizmus per iš hESCs chimerization morulė techniką, sukuriant biologinę struktūrą, kuri yra už sluoksnis tetraploidiniai blastomeres gaunančių ir donorų PGCs yra vartojamas į. Taigi, trophoblast suformuota iš palikuonių tetraploidas blastomeres gavėją, kuris leidžia implantacijos ir placentation, ir donoro PGCs veikia kaip vidinis ląstelių masės, kuri yra suformuota iš perspektyvaus gemalų linija pirminių kūno ir kamieninių gametas. Tyrimas ESRK vertė yra ne tik tuo, kad, kai in vitro su jų genomo manipuliavimo saugomi pluripotency, bet taip pat dėl to, kad nors išsaugoti gebėjimą dalyvauti formuojant hESCs pirminė lytinių ląstelių chimerinio embriono. Parodyta, kad tik vienas palikuonis genetiškai modifikuotų PGCs kolonizuoti visus pirminius ir mikrobus formavimo audinio chimerinį embrioną, gautas agregacijai ar coculture ląstelių su 8-ląstelių embriono. Kai persodinami į pelės morulė ESRT transfekuotų su žaliai fluorescuojančio baltymo geno, fluorescencinės palikuonių ląstelių buvo rasta visų tirtų audinių besivystančios embriono (Shimada, 1999). Transplantacija ESC į morulė gali sukurti perspektyvias pelėms, kurio kūnas susideda tik iš palikuonys paaukoti ESC, kuris atveria galimybes iš terapinio klonavimo variantų. Dabar toks metodiškas požiūris buvo sėkmingai taikomas išstudijuoti Developmental Biology problemų, visų pirma, ji gali analizuoti genetinius mechanizmus nukenksminimo X chromosoma ar epigenetinio nestabilumo hESCs. Transplantacija ESK pradžioje embriono yra naudojamas Žemės ūkio biotechnologijos, taip pat kaip ir eksperimentinio genų terapijos.

Genetiškai modifikuotų ESC transplantacijos yra naudojamos testuojant mutavusių genų tikslines ląsteles. In vitro kultivuoti ESK naudojami biotechnologijose, kad būtų sukurtos nikotinės pelės. Šiam tikslui, homologinės rekombinacijos būdu į būti pašalintas iš ESRT tyrimas genų (nokautas) ir selektyvūs laikmenos išskirti ląsteles, neturintiems šios geną. Tada nikotyvo ESC švirkščiama į blastocistą arba sujungiama su morula blastomerais. Tokiu būdu gauti chimeriniai anksti embrionų yra persodinami į recipientą moterų ir naujagimio pelių parinktas tarp individų su lytinių ląstelių, nullizigotnymi šio geno. Naudojant šią technologiją, buvo sukurtos daugybinių pelių pelenų linijos, kurios plačiai naudojamos eksperimentinėje biologijoje ir eksperimentinėje medicinoje. Per šias biologinių modelių mokėsi tam tikrų genų embriono vystymasis vertę, taip pat jų vaidmenį ligų ir patologinių būklių žmonėms mechanizmus. Be to, nikotoninių gyvūnų linijos yra naudojamos naujų genų terapijos metodų ikiklinikinių tyrimų etape. Pavyzdžiui, naudojant genų transfekcijq į ESK normalaus alelį mutantas geno veiksmingai valdyti ištaisyti mutaciją, streikų hemopoetiniu sistemą. Užsienio genų įvedimas į ESRT leidžia greitai sukurti eilutes homozigotines transgeninių laboratoriniams gyvūnams. Tačiau reikėtų pažymėti, kad technika nukreiptas rekombinacijos genų išbraukta patikimai dirbo dar tik santykinai ESC pelėms. Naudojant pelių ESRT dvigubas nokautas įdiegta funkcinį vaidmenį zona klasteris genų chromosomos 7 (Copy genomo regione 19-ąją žmogaus chromosomų) ir proksimalinės dalį 11 chromosomos (Copy žmogaus 5d chromosomą) - išbraukti iš šių genų ESK pelės leido įvertinti žmogaus analogų funkciją.

Kad talpa funkcija tyrimai žmogaus embrioninių genų transfekciją esant geno, kuris laboratorinės gyvūnai leidžiama hESCs ypač šifravimo paaiškinti į kortelėje geno vaidmenį ir sudarančių kardiogeninis Mezoderma PAX-6 geną - į embriogenezę akies. Yra pirmasis genų nesubrendusių plinta kortelės ESC teratokarcinoma ir blastocista pelės patvirtino didžioji represijų ESK transsignalizatsii genų. Iš mutantas ESRT 60-80 ir 20-30 ląstelių įprastas paruošiamasis implantacijos pelės embrionų derinys veda į chimeriniais embrionų vystymąsi, kurioje Žymės Institucijos yra sudaryta iš donorų ir paramą gaunančių ląstelių, kuri leidžia mums nustatyti nežinomų genų gastrulation ir organogenezės vaidmenį. Funkcinis žemėlapis genų besivystančių pelės embrionų padidintais informaciją apie genų SF-1 kortelėje vaidmenį antinksčių ir lytinių organų primordia, masės-1 genas - inkstuose klavišą "Tab myoD šeimos genų - į skeleto raumenų genų šeimos kortelėje gata-1-4 - į restrikcijos brendimo užuomazgos eritro ir limfopoezės.

Režisierius ne motinos ir tėvo alelių iš genų hESCs naudojant vektorinę rekombinazę tarnavo per anksti embriogenezė ir technologijos nukreipti žmogaus nežinomų genų pelės ESRT prisidėti prie naujų mutantas genų, atsakingų už sunkių paveldimų ligų vystymuisi atradimas paaiškinti įvairių genų funkcijas. Naudojant nokautas metodas apibrėžta obligatiniams reikšmę kai kurių genų dedeklėms embriono audinių: Gata-4 - už infarkto, gata-1 - į eritroidai hemopoetiniu audinių, myoD - skeleto raumenų, kurie brachyury - už Mezoderma apribojimo transkriptazds hnf3 ir hnf4 - už kepenų kamieninės ląstelės, skuduro-2 - žymes klonų T ir B limfocitų (Repin, 2001). Dvivietis išbraukta iš genų hESCs atvėrė priėjimą prie funkcinio vaidmens genų germinaciniame sluoksniais, segmentavimo ir homeosis ir ESC transplantacijos suteikta galimybė gauti perspektyvius tarprūšinių hibridinius embrionus galimybė tyrimas. Su patobulinta metodų transplantacijos donoro PGCs vienoje 8-ląstelių embrioną įrodyta, kad chimerization ląstelių lygiu daugelio organų gavėjo embriono. Atkreipkite dėmesį, kad mobilieji kopūstai randama žmogaus audinių gavėjas pelėmis organų pavartojus žmogaus kraujodaros kamieninių ląstelių į blastocistos. Buvo nustatyta, kad pelių embrionų per kraujo organų cirkuliuojančių daugiapotencinės hESCs formavimas. Tai yra įmanoma, kad jų biologinė funkcija yra būsimo vaisiaus imuninės sistemos organizacija. Su ESC in vitro atgaminti tinkamus modelius žmogaus genetine liga: dviguba Išjungtoms modelių Distrofija geną pelių progresuojančios raumenų distrofijos, išjungimo atm geno (valdymo signalas sintezė kinazės chromatino) - ataksija-teleangektaziyu. Šiuo atveju, mirtina liga paveldima vaikams dėl defektų DNR remonto plėtoja degeneracija Purkinje ląstelių smegenėlių, kuris yra lydimas į užkrūčio involiucija dėl iš proliferuojančias ląstelių mirtį. Klinika, patofiziologiniu ir patomorfologija ataksijos-teleangek- tazii atgaminti per įvedimo į ESC nenormalus genetinės informacijos iš pelių chimerų atitinka tiems žmonėms. Be to ataksija-teleangektazii naudojant PGCs ir pelç sukūrė eksperimentinį modelį, kai paveldimas homozigotinės žmogaus ligų, susijusių su sutrikimais angliavandenių ir lipidų metabolizmui, katabolizmas amino rūgščių, pašalinus vario ir bilirubino, kuris gerokai padidino eksperimentinės medicinos galimybę ikiklinikinių bandymų naujų metodų gydant atitinkamas ligas teises.

[12], [13], [14], [15]

Kamieninių ląstelių citocharidų panaudojimas

Hibridinis ląstelės, gautas lydant somatinių ląstelių hESCs, yra tinkamos ir perspektyvus modelis studijuoja kamieninių ląstelių pluripotency ir pakeisti diferencijuotų ląstelių chromosomų. Tsitogibridy gautas ESC susijungimo su diferencijuotų ląstelių suaugusio gyvūno, suteikti galimybę mokytis tarp skirtingų "amžius" genomų santykius: kuria unikalią situaciją, kai homologinį chromosomos, gautos iš ląstelių įvairiuose etapuose diferenciacijos ir įvairaus brandumo, yra toje pačioje branduolį, kur jie gali lengvai transdeystvuyuschimi pasidalinti reguliavimo signalus. Sunku numatyti, kaip reaguos tsisregulyatornye epigenetinius sistema homologinių chromosomų Yn metu esamas Atskirtas plėtros, reaguojant į poveikio transdeystvuyuschih signalus iš embrioninių susijusių genomų atžvilgiu. Be to, hibridinių ląstelių įvyksta atskyrus vaiko chromosomos, kad leidžia mokytis, tačiau tik tuo atskiras chromosomų lygio genomų sąveiką, t.y., potencialiai nustatyti konkrečių chromosomų dalyvauja pluripotency priežiūros, arba priešingai, diferenciacijos rezultatas.

Kadangi pirmasis eksperimentinio modelio studijuoti genomų įvairaus "istorijos kūrimo" sąveiką naudojamas tsitogibridy gautas sujungus teratokartsinomnyh pliuripotencinių ir diferencijuotus somatinių ląstelių. Kai kuriais atvejais tokios hibridinės ląstelės išlaiko pliuripotencines savybes pakankamai aukštu lygiu. Visų pirma, in vivo somatinių hibridinės teratokartsinomno-ląstelės buvo sukeltas vystymąsi tikras teratomas, kurių sudėtyje yra darinių visų trijų lytinių sluoksnių, in vitro pakabų kultūrų suformuotų embryoid įstaigos. Net šiame tarprūšinis tsitogibridov pažymėjo vaisiaus antigenų buvimą tais atvejais, kai somatinių partneris susijungimo su teratokarcinoma ląstelės limfocitai arba timocitų tipo. Pažymėtina, kad tsitogibridy Susijungimų teratokartsinomnyh ląstelių fibroblastų, derančių su fibroblastų fenotipo.

Svarbiausia yra tai, kad nustatyta, kad in-teratokartsinomno somatinių hibridiniai ląstelės atsirado ženklai Už genomo pakeisti diferencijuotų ląstelių, pasižyminčių kelių atskirų genų ar neaktyvus X chromosomų somatinių partneriu suaktyvėjimo. Taigi, tyrimų tipo tsitogibridah teratokartsinomno-somatinių ląstelių rezultatai rodo, kad hibridiniai ląstelės dažnai lieka pluripotency ir pakeisti genomo, yra požymių, somatinių partneriu.

Eksperimentuose gauti embriono vidurūšinė hibridinių ląstelių lydant splenocitus su pelės ESRT suaugusiųjų gyvunams savybių, tokių tsitogibridov, atskyrimas analizės tėvystės chromosomų ir vertinama pluripotency hibridinis genomų. Už tarprūšiniams hibridinių ląstelių pagamintų sintezės teratokarcinoma ląstelių su somatinių ląstelių, paprastai pasižymi mažu atskyrimo chromosomos, turinčios tetraploidines arba beveik tetraploidines kariotipų. Pavyzdžiui chromosomų tsitogibridah kompozicija buvo pastebėta, kad sintezės pirminių embrioninių ląstelių limfocitų. Tuo pačiu metu, tarprūšinį hibridą ląstelių, gautų kaip pele limfocitų teratokartsinomnyh audinės susijungimo, buvo intensyvus segregacija chromosomų somatinių partneris.

Kokybiškai naują etapas atskyrimo tėvinių chromosomų hibridus tyrimo priėjo po to, kai mikrosatelitiniai analizės metodu, naudojant polimerazės grandininę reakciją, pagal kurią kiekvienas pelės chromosomos rasti kelis šimtus žymekliai vystymosi, leidžianti patikimai atskirti bet homologinių chromosomų poros hibridinių ląstelių.

Sujungiant ESK (naudojant HM-1 ląstelių trūksta gipoksantinfosforiboziltransferazy veiklos, 2n = 40, XY, izoliuota nuo blastocistos pelių kamieno 129 / 01a) su splenocitų, iš pelių congenic linijos DD / c nepavyko gauti hibridinių klonų rinkinį morfologiškai turėjo panašumo į hESCs. Visi klonai buvo izoliuotas selektyvios terpės, kurioje augimas yra įmanoma tik su aktyvaus ląstelių gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforezės analizė parodė, visų klonų Alelių variantas gipoksantinfosforiboziltransferazy būdinga pelių DD / c buvimą. Naudojant citogeninis analizę, buvo nustatyta, kad keturi buvo trys hibridiniai klonai okolodiploidny nustatyti chromosomų. Vienas beveik tetraploidas klonas pateikta dviejų populiacijų hibridinių ląstelių, iš kurių vienas buvo tetraploidas, o antrasis, mažesnis - Diploidas.

Analizė MIKROSATELITŲ, suteikiant galimybę diskriminuoti bet homologinių chromosomų pelės 129 / 01a, o DD / c pora, hibridiniame klonų su okolodiploidnym rinkinio parodė, kad klonai įvyko du atskirus preferencinio eliminacijos autosomes somatinių partnerio. Dauguma autosominiu klonai HESS2 ir HESS3 turėjo žymekliai linija 129 / 01a, ty daugiapotencinės partnerių. Išimtis buvo chromosomų 1 ir I: klonai HESS2 ir HESS3, kartu su žymenų HM-1 ląstelių, nedidelio skaičiaus žymenų metu somatinių partnerio. Šie rezultatai gali atspindėti nepilną segregaciją chromosomų 1 ir ir somatinių partnerį ir yra suderinamas su citogenetiniais duomenų, kad trisomija chromosomų, kad pasitaiko 30-40% HESS2 ir HESS3 ląstelių klonai. HESS4 klonas skyrėsi žymiai chromosomų sudėtį: daug autosomes Šiame klone kilęs iš genomo ESK (chromosomos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ir 17), bet chromosomos 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ir 19 buvo pristatyti homologai abiejų tėvų. Kiekybinė santykis mikrosatelitinius žymenų šie homologinės chromosomos beveik atitiko 1: 1. Tai leido autoriai teigti, kad viena homologas yra kilęs iš ESC ir kita genomo - iš diferencijuotų ląstelių. Kai kuriose klonas subklonais HESS4 pastebėtas tik simbolinį buvimą chromosomų 18 ir 19 somatinių partneriu. Rezultatai rodo, kad ląstelės klonuoti HESS4, papildomai prie chromosomų atskyrime somatinių partnerio, ten buvo vienas panaikinimas arba abu pirmiau chromosomų pliuripotencinių genomo homologai, ty, buvo dvipusis segregacija chromosomų abiejų tėvų - reiškinys yra gana neįprasta, nes tsitogibridov būdinga segregacija chromosomų tik vienas iš tėvų.

Be to, po 20 ištrauka, visų hibridinių ląstelių klonai yra tik X chromosomoje žymenų somatinių partneriu, tai yra, klonai buvo pakeistas X chromosoma ESC ant X chromosomos iš somatinių partneriu. Tai patvirtina "in situ" hibridizacijos duomenys, naudojant pelės X chromosomos specifinį pelių X chromosomos specifinį FITC žymenį: teigiamas signalas buvo aptiktas tik vienoje chromosomos. Reikėtų pažymėti, kad ankstesnėse auginimo stadijose (iki 15-osios ištraukos) pagal citogenetinius duomenis daugelyje ląstelių buvo dvi X chromosomos. Todėl atrankinės žiniasklaidos panaudojimas leidžia manipuliuoti chromosomų sudėtį hibridinių ląstelių ir režisierius pasirinkti klonai vežančių vieną chromosomų somatinių partnerių ESRT fone genomą.

Kaip unikalus bruožas genomo tsitogibridov yra tėvų genomus lokalizacija į vieną branduolį, žinoma, kelia išlaikant pliuripotencinių embrioninių genomo ESRK-somatinių ląstelių hibridų savybes į glaudų ryšį su diferencijuotų ląstelių genomą sąlygų klausimą. Morfologiškai ESC ir somatinių ląstelių citohibridas primena ESC tėvų liniją. Kvalifikacija pluripotency parodė, kad visi klonai okolodiploidnym rinkinys chromosomos galėjo susidaryti pakabos kultūras embryoid organų, kurie susiję su trijų sluoksnių lytinių dariniai.

Daugelyje hibridinių ląstelių buvo ECMA-7 antigenas, ankstyvojo pelės embriono savybes žymintis žymiklis, taip pat buvo aktyvus šarminės fosfatazės aktyvumas. Daugiausia įtikinamų duomenų apie dideles hibridinių ląstelių pliuripotencines savybes buvo gauta eksperimentuose, siekiant gauti injekcijų chimerų seriją, kurioje yra hibridinių HESS2 klonų ląstelės. Biocheminių žymenų analizė parodė, kad donorų hibridinių ląstelių palikuonys buvo rasti daugelyje chimerinių audinių. Todėl hibridinės ląstelės, gautos ESC ir somatinių diferencijuotų ląstelių sintezėje, išlaiko didelį pliuripotencialą, įskaitant galimybę formuoti chimeras, įterpiant į blastocistų ertmę.

Klonai HESS2 ir HESS4 žymiai skiriasi tėvų chromosomų sudėtimi, tačiau jie turėjo panašių pluripotentinių savybių. Galima tikėti, kad hibridinio genomo pliuripotency pasireiškia dominuojančia savybe, tačiau yra įmanoma, kad ne visos embrioninio genomo chromosomos dalyvauja pliuripotencijos palaikymo procese. Jei ši prielaida yra teisinga, galima tikėtis, kad tam tikros hibridomos genomo chromosomų pašalinimas iš daugybės potencialių partnerių nebus keičiamas jų pliuripotento statusas. Šiuo atveju tėvų chromosomų išskyrimo analizė embrioninėse hibridinėse ląstelėse leistų glaudžiai nustatyti chromosomas, atsakingas už embrioninių ląstelių pliuripotyvumo kontrolę.

Serovo O. Ir kt (2001) nustatė, tarp 50 palikuonių, gautų sukryžminus chimerų su normaliomis pelėmis, kurios turės genotipas pelėms 129 / 01a ir vykdant X chromosomos DD pelėms. Autoriai mano, kad tai priežastis mažina pliuripotencialą hibridinėse ląstelėse po somatinio genomo įtakos. Alternatyvus paaiškinimas gali būti neigiamas poveikis trisomija tam tikrą autosomes ir sekso chromosomų disbalanso (XXY pastebėtas ląstelių iki 15 ištrauka) į hibridinių ląstelių ne ištrauka iš mejozės. Yra žinoma, kad XXY ląstelės negali praeiti per mejozę ir formuoti gametas. Trisomija taip pat gali sukelti hibridinių ląstelių proliferacinio aktyvumo mažėjimą, todėl selektyvus pranašumas chimerų vystymuisi gali priklausyti recipiento embriono ląstelėms. Tai reiškia, kad norint tinkamai įvertinti hibridinių ląstelių pliuripotencinį potencialą, būtina gauti hibridinius klonus su įprastiniu diploidiniu chromosomų rinkiniu.

Eksperimentuose serova O. Ir kt (2001) pirmą kartą įrodė, kad perprogramavimo X chromosomą į somatinių ląstelių hibridinės ląstelės genomo galimybę. Ši išvada išplaukia iš autoriai analizuoti chimerų išraiška HPRT genų (X-chromosomos žymuo): iš Alelių buvimas variantai HPRT DD / c pelių buvo aptikta visų tirtų chimerinis audiniuose. Reikia pabrėžti, kad po hibridinių ląstelių blastocistos ertmės tsitogibridy kritimas neselektyvaus sąlygų įvedimas ir X chromosomos į hibridinių ląstelių genomą išsaugojimo reiškia, kad jis tapo obligate komponentas jo genomą ir neturi diskriminuoti jį iš Y chromosoma pliuripotencinių partneriu.

Apibendrinant analizės į somatinių daugiagalių embriono genomą hibridiniame ląstelių sąveika rezultatus, autoriai daryti išvadą, kad, kai kuriose tsitogibridah pluripotency atrodo kaip dominuojančia bruožas. Hibridinio genas gali atskirų chromosomų perprogramuoti, diferencijuotos ląstelės, kurios, tačiau, netrukdo atvirkščią poveikį somatinių genomo pluripotency embriono genomą. Hibridinių ląstelių auginimui diferencijavimo indukcija vyksta daug dažniau nei pirminėje ESC NM-1 pirminėje eilutėje. Panašus poveikis pastebimas pirminių kolonijų formavime: daugelis pirminių embrioninių hibridinių ląstelių kolonijų atsiskleidžia ir dauginasi ankstyvosiose formavimo stadijose su dideliais nuostoliais.

Taigi, tsitogibridy pagal ESC susijungimo su somatinių ląstelių, nepaisant glaudaus kontakto su diferencijuotų ląstelių genomą išlaikyti pluripotency kaip Unikalios embriono genomą. Be to, tokiose hibridinėse ląstelėse yra galimybė perprogramuoti atskiras chromosomas, kilusias iš difuzinių ląstelių. Neaišku, kaip visiškai išlieka embrioninio genomo pliuripotencinės savybės hibridinėse ląstelėse, ypač jų gebėjimas dalyvauti formuojant embrionų kelią chimerose. Dėl to būtina gauti embrionines hibridines ląsteles su įprastiniu kariotipu. Bet kokiu atveju, kad pliuripotencinių embrioninių hibridiniai ląstelės gali būti tikras modelis genetinio identifikavimo chromosomų dalyvaujančių pluripotency ar jos kontrolę, kaip dvišalis segregacija tėvų chromosomų potencialiai suteikia tokią galimybę priežiūra.

Ne mažiau patrauklus yra tyrimo reiškinys, Serov, G. Ir kt (2001) apibūdinama kaip "chromosomų atminties." Į hibridinių genomo homologinės chromosomos yra du alternatyvius konfigūracijas: homologų somatinių partneris kartą atlikta diferenciacija, o homologai pliuripotencinių partneriu, šis procesas dar tik prasideda. Todėl svarbu išlaikyti didelį pliuripotencinių savybes hibridinių ląstelių rodo, kad "daugiapotencinės" konfigūravimo homologai ESC gana stabilus hibridinių genomų, nepaisant transdeystvuyuschih veiksnių sklindančius iš somatinių partneriu poveikį. Iš anksčiau aprašytų funkcijų perprogramavimo diferencijuoti homologinis genomo chromosomų plėtros chimerų metu neatmeta galimybės, kad pirmieji formavimo etapai, in vitro ir kultivavimą tsitogibridov jie išlaiko savo būklės diferenciacijos in vivo metu įgytą. Pagal pastaraisiais duomenimis, kai perduodant embriono hibridinių ląstelių ne-selektyvios terpės, kurioje yra intensyviai tik pašalinimo chromosomos somatinių partneris, t.y., hibridinių ląstelių genomo lengvai diskriminuoja jo homologą po to kultivuoja in vitro 10-15 ištraukas. Taigi, embrioninės hibridiniai ląstelės sudaro daug žadančią eksperimentinį modelį Tyrimo ne tik iš pagrindinių savybių embriono genomą kaip pluripotency, bet taip pat savo alternatyvas - embriono diferenciaciją.

Terapinis embrioninių kamieninių ląstelių transplantacijos veiksmingumas

Prieš analizuojant ESC transplantacijos ir jų darinių terapinį veiksmingumą apibendriname minėtą medžiagą. Įranga ESC požiūriu visiškai įgyvendinti embriogenezės in vitro yra nepakankamas, nes defektų šiuo atveju dėl nebuvimo mezenchiminių kamieninių ląstelių, kurios atsiranda organizmui savarankiškai ir nepriklausomai nuo hESCs. Genetinis stiprumas ESK mažiau genetinio potencialo zigotų todėl tiesiogiai klonavimo embrionų ESRT nenaudojamas. Unikalus biologinis potencialas hESCs kaip tik ląstelių, kurioje plėtros programos yra visapusiškai naudojamos nuosekliai įgyvendinti, nustato taikymo genų funkcijos tyrimų studiją. Naudojant ESK atliekamas dekodavimo Pirmasis signalas derinius, kad aktyvuoti išraišką pradžioje ir pabaigoje genų, kodavimo trijų gemalinių sluoksnių plėtrai. Išsaugoti genomo pluripotency ESRT in vitro daro juos unikalus įrankis remonto regeneracijos, kuri gali automatiškai kompensuoti ląstelių nuostolių pažeistų organų ir audinių. Idealiame hipotetinį variantą galima manyti, kad "... į donorų PGCs transplantacijos organizmo recipiento perduodami kompaktiškai supakuoti programas, esant palankioms sąlygoms, yra realizuota naujos tkani'7 statybos, galintis" ... Efektyviai integruoti į gavėjo kūno, morfologinė, tiek funkcinis, tiek funkcionalus. "

Natūralu, kad po ESC monodiferencijavimo metodų kūrimo prasidėjo in vitro ląstelių funkcinio aktyvumo tyrimas, gautas in vitro iš vieno specializuoto klono. Plaujantis ESO klonas generuoja migruojančių progenitorinių ląstelių populiacijas, kurios iš tiesų gali aktyviai integruotis į recipiento audinių pažeidimo zonas, kurios yra naudojamos regeneracinėje plastikoje. Nustatyta, kad Dopa neuronų transplantacija "substantia nigra" sumažina eksperimento hemiparkinsonizmo klinikines pasekmes. Donoro neuronų kamieninių ląstelių regioninės transplantacijos sumažina motorinių sutrikimų, kuriuos sukelia nugaros smegenų ir smegenų traumos ar smegenų uždegimas, laipsnį. Gauti ir pirmieji teigiami kamieninių ląstelių transplantacijos rezultatai demielinizuojančiose ligomis. Atrodytų, kad regeneracinė-plastikinė ESC galimybė atveria neribotas galimybes naudoti ląstelių transplantaciją praktinėje medicinoje. Tačiau, persodinus į nektopines zonas, ESK neišvengiamai virsta navikais. Sušvirkštus ESC į poodį imunodeficiento pelėms, susidaro teratomas. Kai ESK suspensija transplantuojama sėklidžių kapsulėje sinerginėse pelėse, taip pat susidaro teratoma, susidedanti iš skirtingų audinių, kurių ląstelės yra gaunamos iš visų trijų embrioninių lapelių. Tokiose teratomos procesuose sumažintas organogenezė yra labai retas.

Daugelyje darbų pateikiama informacija apie teigiamus ESCO pradinių darinių transplantacijos rezultatus, kai gyvūnai patiria eksperimentinę patologiją. Ląstelių neurotransplantation naudojant dariniai PGCs toliau plėtojama eksperimento ir pirmųjų klinikinių tyrimų korekcijos funkcinių sutrikimų smegenų ir stuburo smegenų traumos, gydymui siringomielijos ir išsėtinės sklerozės (Repin, 2001). Su technologijų neyronogeneza ESRT in vitro atėjimas, o ne naudojant embriono smegenų audinių transplantacijos sukurtus metodus dariniai neurospheres, gautus iš kultūrų embriono nervinio audinio. Tokie transplantacijos suspensijos yra daug homogeniškesni ir juose yra neuronų ir neuroglijų pirmtakų.

Be to, reguliariai mitybinės terpės su retinoinės rūgšties, esant 10 ug / ml doze 6 savaites embrioninių linijų (teratomas) NTERA-2 žmogaus -kartsinomy sudarė daugiau kaip 80% po mitozės neuronų. Visiškas vienodumas neuroninio populiacijos yra pasiekti srauto rūšiavimo pažymėti immunophenotypic žymenų subrendusių neuronų, kad gali atsikratyti liekanas teratokartsinomnyh ir nesubrendusių ląstelių. Po transplantacijos įvairiuose regionuose eksperimentinių gyvūnų smegenyse tokie neuronai yra ne tik išgyventi, bet ir įdėta regioninių neuroninius tinklus. Gyvūnams, kurių eksperimentinių modelių vietos defektų CNS neurotransplantation sumažina klinikinių pasireiškimų žmogaus patologijos, pavyzdžiui, galvos smegenų traumos, insulto, demielinizacijos ligų, paveldimas smegenėlių vystymosi defektų, ligų nusėdimo lipidų ir polisacharidų poveikio.

Siekiant optimizuoti centrinės nervų sistemos degeneracinių ligų regeneravimo procesus, kuriamos mielino gaminantys oligodendrocytai iš ESK. Pirmasis etapas tradiciškai apima ESK plitimą, dauginant transplantacijai reikalingų ląstelių skaičių. Antrame etape atliekama nukreipta ląstelių diferencijavimas į mielino gaminantį oligodendrocyto prekursorių populiaciją, kuri kontroliuojama selektyviais markeriniais antigenais.

Kai perspektyvos atidarytas naudoti išvestines ESRT plėtoti metodus korekcijos imunodeficitas sukelia genetinių defektų iš užkrūčio brendimui. Tyrimuose su nokautas (skuduro 1) pelių su sukeltos Genų defektas - pažeidimas rekombinacijos mechanizmas V (D) J genų lokusų TCR, dėl kurių funkcijos netekimo T-limfocitų, transplantacijos anksti dariniai PGCs užkrūčio liaukoje gyvūno susitraukia brendimą populiacijose paprastai imuninių klonų, atsakingų už ląstelinis imunitetas. Klinikinių bandymų transplantacijos iš anksto nustatytų formų in vitro hESCs gydyti mirtiną paveldimas anemija vaikams.

Prieštaravimai dėl greito įvedimo kamieninių ląstelių transplantacijos klinikos pateisina ribotą skaičių stabilių linijų žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių ir standartizacijos būtinybę. Norėdami padidinti standartizuotų ESC linijų ir suaugusiųjų kamieninių ląstelių grynumą siūloma naudoti metodą pasirinkę linijas ant molekulinės genetinės analizės trumpas tandemas DNR kartojasi pagrindu. Reikia taip pat patikrinti ESC linijas mažųjų chromosomų aberacijas ir genetinių mutacijų buvimą, už atsiradimo potencialą, kuris ląstelių kultūroje sąlygomis yra gana didelis. Darbo tęsiasi privalomi bandymai su visais PGCs ir regioninių pliuripotencinių kamieninių ląstelių tipų savybes, nes jų dauginimas in vitro gali sukelti naujų savybių nėra būdingų embrionines kamienines ląsteles į galutinį arba audiniuose. Visų pirma, manoma, kad ilgalaikis auginimas žiniasklaidoje su citokinų Hess arčiau vėžinių ląstelių, nes jie atsiranda panašūs kaitos kelius reguliuoja ląstelės ciklą su gebėjimu įgyvendinti neribotą skaičių ląstelių dalijimasis įsigijimo. Kai kurie autoriai, remdamiesi auglių vystymosi galimybėmis, mano, kad žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių ankstyvųjų darinių persodinimas yra neapdairumas. Jų manymu, yra daug saugiau naudoti išvestus ESC palikuonis, ty diferencijuotų ląstelių protėvių linijas. Tačiau patikimas būdas gauti stabilias žmogaus ląstelių linijas, kurios diferencijuos teisingą kryptį, dar nėra sukurtas.

Taigi literatūroje yra daugiau duomenų apie teigiamą terapinį žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių darinių transplantacijos poveikį. Tačiau daugelis šių darbų gali būti persvarstomi ir kritikuojami. Kai kurie mokslininkai mano, kad ankstyvųjų klinikinių tyrimų rezultatai yra preliminarūs ir rodo, kad kamieninės ląstelės gali turėti teigiamą poveikį klinikiniam ligos eigai. Todėl būtina gauti duomenis apie ilgalaikius ląstelių transplantacijos rezultatus. Kalbant apie argumentus, pateikiama klinikinės neurotransplantologijos plėtros stadija. Iš tiesų, literatūroje, iš pradžių dominuoja didelio efektyvumo smegenų persodinimas fragmentų embrionų Parkinsono ligos paskelbimo, bet tada ėmė atsirasti ataskaitas atimama gydomasis poveikis embriono ar vaisiaus nervinio audinio persodinami į pacientų protus.

Atliko pirmąjį klinikinių bandymų, kuriose įvertinamas transplantacijos neuroblast saugumą - dariniai PGCs NTERA-2 teratokarcinoma, nesubrendusių ląstelių, kurios daugintis kultūroje buvo atliktas saugojimo 100 milijoninė ląstelių masės. Dalis tokiu būdu gauto ląstelių buvo siekiama nustatyti ląstelių fenotipo ir priemaišų savybes, taip pat išbandyti galimą užteršimą virusų ir bakterijų. Iš kultūros terpė buvo pašalintas LIF ir tiektuvo sluoksnį stromos ląstelių ir vaisiaus sudarytos sąlygos nukreipta diferenciacijos hESCs į neuroblasts su citokinų ir augimo faktorių derinys. Tada išvalytas nuo nesubrendusių neuroblasts teratokarcinoma ląstelės pagal srauto ląstelių rūšiavimo. Po antrojo gryninimo ir charakterizuoti transplantuotų ląstelių neuroblasts fenotipo (10-12 milijonų) pakaba naudojant specialų švirkšto ir microcannulas stereotaxy ir pagal CT kontrolės suleidžiamas į branduolio basalis nuo pacientų smegenų (septintoji mėnesių po to, kai hemoraginio insulto atveju). Odnogodovoy po transplantacijos atrankos organų persodinimo iš neuronų insulto zonoje poveikį jokių neigiamų ir nepageidaujamų pasekmių. Pusė pacientų sirgo motorikos funkcijos pagerėjimu nuo 6 iki 12 mėnesių po transplantacijos. Teigiamų klinikinių pokyčiai buvo lydimas kraujo tiekimo insulto zonoje padidėjo po to, transplantacijos ląstelių: vidutinis absorbcijos didinant fluoresouojančio 2-deoxyglucose, pagal pozitronų emisijos tomografijos pasiekė 18%, ir kai kuriems pacientams - 35%.

Tačiau JAV nacionalinis sveikatos institutas atliko nepriklausomą neurotransplantacijos efektyvumo tyrimą Parkinsonizmo pacientams. Pirmosios grupės pacientai persodinami embrioniniu nervų audiniu, gamindami dopaminą, o antroji pacientų grupė buvo suklastota operacija. Rezultatai rodo, kad toks neurotransplantacija buvo lyginamas su klinikiniu veiksmingumu, nepaisant to, kad dopamino gaminantys embrioniniai neuronai išgyveno recipientų smegenyse. Be to, po 2 metų po transplantacijos vaisiaus nervinio audinio 15% pacientų nuolat diskineziją, kuri yra išvykęs į pacientų placebo grupėje (Kamieninės ląstelės: mokslo pažangą ir ateities mokslinių tyrimų kryptys Šalis Inst, iš sveikatos JAV ...). Tolesni ligos vystymosi stebėjimai šiems pacientams tęsiami.

Kai kurie autoriai priskiria prieštaringą literatūrą apie klinikinio veiksmingumo Neurotransplantation duomenų įvertinimu su kitokio požiūrio į pacientų grupių, netinkamas pasirinkimas objektyvių metodų vertinant jų būklę atrankos ir, svarbiausia, skirtingi terminai vaisiaus nervų audinių ir įvairių smegenų dalių, iš kurių audinys buvo pagamintas įvairių dydžių plėtros operacijos transplantacijos ir metodinės ypatybės.

Reikia pažymėti, kad bando nukreipti transplantacija pliuripotencinių embrioninių kamieninių ląstelių dryžuotojo kūno regione žiurkių su eksperimentinio kūno gemiparkinsonizmom smegenų kartu ESC proliferaciją ir diferenciaciją į jų dopaminerginių neuronų. Ji turi būti laikoma, kad naujai suformuota neuronai veiksmingai integruotas į neuronų tinklo, kaip ESRT po transplantacijos buvo stebimas korekciją anomalijų elgesio ir variklio asimetrijos į apomorfinas testą. Tuo pačiu metu kai kurie gyvūnai mirė dėl transplantacijos ESK transformacijos smegenų auglyje.

Ekspertai iš JAV nacionalinio ir medicinos akademijos specialistai Nacionalinių sveikatos institutų manyti, kad klinikinę potencialas hESCs nusipelno rimto dėmesio, tačiau primygtinai dėl pasiūlymo dėl išsamaus tyrimo jų savybes, komplikacijų ir ilgalaikių pasekmių eksperimentų su tinkamų biologinių modelių ligų tikimybę reikia (Kamieninių ląstelių ir būsimoji regeneracinė medicina Nacionalinė akademija Spauda, kamieninės ląstelės ir būsimos mokslinių tyrimų kryptys., Nat.Inst., Sveikatos JAV).

Iš šio požiūriu svarbu, kad lyginamoji histologinis tyrimas eksperimentinės teratoma gautas transplantacijos sėklidžių srutų PGCs su teratomas, kurios buvo sukurtos dėl persodinimo pradžioje gemalas, tarp kurių taip pat dalyvauja ESRK parodė, kad ESK, nepriklausomai nuo jų kilmės ar sąveikos su Tos ar kitos aplinkinės ląstelės taip pat supranta jų tumorigeninius potencialus. Ji įrodyta, kad tokie teratomas turi klonuotą kilmę, kaip iš auglio ESRT gali atsirasti, susidedanti iš visų trijų sluoksnių lytinių (.Rega, 2001) dariniai. Pažymėtina, kad kai persodinami į imuninės pelių klonuotų PGCs su normalaus kariotipo ir suformavo teratomas susidedančių iš tipų diferencijuotų somatinių ląstelių įvairovė. Šie eksperimentiniai duomenys yra idealus teratomo kloninės kilmės įrodymas. Nuo Developmental Biology perspektyvos, jie rodo, kad tai nėra kartotinis atsidavusių kamieninių ląstelių ir kamieninės ląstelės identitetą yra diferencijuotų išvestinių visų trijų gemalinių sluoksnių, teratoma komponentų šaltinis. Tačiau praktiškai ląstelių transplantacija Šių tyrimų rezultatai yra, jei ne pernelyg, tada įspėjamasis ženklas apie galimą pavojų, nes skiepijimo ESC arba pirmykščių gemalinių ląstelių skirtingų audinių suaugusių imuninės pelių neišvengiamai sukelia auglių iš transplantuotų kamieninių ląstelių vystymąsi. Navikinių degeneracija ectopically persodinami ESC kartu palydovinės gyventojų diferencijuotų ląstelių atsiradimą - iš dalies atskirti tikrai ESRT ir kamieninių klonai skirti linijas. Įdomu tai, kad transplantacijos hESCs skeleto raumenų ląstelėse netoli teratokartsinomnymi neuronų forma dažniau. Tačiau, administruojančių PGCs Macai kiaušinis ar blastocistos lydi visą integracijos ląstelėse be navikinių ląstelių susidarymą. Šiuo atveju ESK yra įtvirtintos beveik visuose embrionų organuose ir audiniuose, įskaitant seksualinius įsiminimus. Tokie allofennye gyvūnai buvo paruošiamas pajungiant teratokarcinoma ląstelę 129 ankstyvuoju embrionų ne 8-100 ląstelių. Be allofennyh pelėmis gyventojų geterogenomnyh ląstelių pagamintų donorės PGCs įvedami į kaulų čiulpų, žarnyno, odos, kepenų ir genitalijas, kuri leidžia jums sukurti eksperimente net tarprūšinis mobilieji chimerų. Kuo mažesnis ankstyvo embriono laikas, tuo didesnė ląstelių chimerization, aukščiausio lygio chimerization stebėtas kraujodaros sistemos, odos, nervų sistemos, kepenų ir plonojoje žarnoje allofennogo embrionų procentas. Suaugusiųjų organizmo audinių gali būti keliamas paduodant chimerization apsaugotas nuo sąlyčio su imuninės sistemos iš gavėjas gistogematicalkie kliūčių: transplantacijos pirminė gemalo ląstelės sėklidžių parenchima kartu įterpiant donoro kamienines ląsteles į gavėjas audinių germenativny sluoksnio. Tačiau, nepasireiškia ESRK transplantavus į blastocistos formavimo chimerinių primordia lytinių organų su kartos donorų pirminė lytinių ląstelių. ESRK pluripotency kuriant specialius reikalavimus, ir gali būti naudojamas klonavimui: ESRK transplantacijos pelių 8-16-ląstelių pelės embriono ląstelių, mitozės kur tsitokalazinom užblokuotas, prisideda prie normalaus embriogenezės su embriono donorų PGCs vystymosi.

Todėl, alternatyva yra transplantacija alogeninių ESC terapinio klonavimo remiantis somatinių ląstelių branduolių transplantacijos į enucleated oocito sukurti blastocistos vidinį ląstelių masę, iš kurių po to skiriama liniją genetiškai identiški donorų PGCs somatinių branduolio. Techniškai ši idėja yra įmanoma, nes iš žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių linijų kūrimo galimybės nuo blastocistų gautų po transplantacijos somatinių branduolių į enucleated kiaušialąstėje kartą įrodė eksperimentus su laboratoriniais gyvūnais (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Ypač pelių homozigotinį mutacijos rag2, fibroblastai gautas auginant subepidermal audinio ląstelės buvo naudojamas kaip donorės branduoliai yra persodinami į enucleated oocituose. Po aktyvinimo, oocitų "Zigota" kultivuojamos, kol blastocistos formavimo, nuo vidinio ląstelių masės yra izoliuotas PGCs ir perduoti juos į liniją už mutantas genas nullizigotnyh ląstelių (rag2 ~ / ~). Remiantis homologine rekombinacija tokiose ESC, buvo ištaisyta viena alelio geno mutacija. Pirmoje eksperimentų serijoje iš hESCs rekombinantinis genas atsigavo buvo paruošti embryoid įstaigos, transfekuota ląsteles druskos su rekombinantinio retroviruso (HoxB4i / GFP) ir po to, kai dauginimas pelėms suleidžiamas venų rag2 ~ / ~. Antrojo rinkinio tetraploidinių blastomeres surenkami genetiškai modifikuotų hESCs ir transplantuotų juos į recipientą moterų. Gimusios imunokompetentės pelės tarnavo kaip kaulų čiulpų donorai, kurie persodinami į mutantines peles rag2 ~ / ~. Tiek serijos rezultatas buvo teigiamas: 3-4 savaites visų normalių brandžių kaulų čiulpais ir limfinių ląstelių pelėms buvo rasta pajėgi gaminti imunoglobulinų. Taigi, transplantacija į kiaušialąstės branduolius somatinių ląstelių gali būti naudojamas ne tik gaminti žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių linijų, bet ir dėl tsitogenoterapii - korekcija paveldimas sutrikimų naudojant ESC kaip transporto ištaisyti genetinę informaciją vektorių. Tačiau šiuo ląstelių transplantacijos kryptimi be biotinių problemų yra ir apribojimų. Neaišku, kaip saugiai transplantacijos būtų terapiškai klonuoti ląsteles su genotipo identiška konkrečiam pacientui genotipo, nes tokie ląstelės gali pristatyti mutacijas, kurios sukuria polinkį į tam tikras ligas. Normalus žmogaus kiaušiniai lieka neprieinami objektas, kadangi net ir tada, kai persodinti somatinių branduolius į enucleated gyvūnų kiaušialąstės tik 15-25% inžinerijos "zigota" plėtoti į blastocistos stadijoje. Nustatyta, kiek reikia blastocistui gauti vienos eilės pluripotentinių klonuotų ESC. Reikėtų pažymėti ir aukštą finansinių išlaidų, susijusių su terapinės klonavimo metodikos sudėtingumu, lygį.

Išvada, ESRT pluripotency genomo DNR hypomethylated yra kombinuotas su didelio telomerazės aktyvumo ir trumpą C ^ ląstelių ciklo fazės, kuri užtikrina intensyvų ir potencialiai begalinį dauginimasis, kurio metu PGCs išlaikyti Diploidas chromosomos ir "nepilnamečių" rinkinį fenotipo savybes. Klonų augimas PGCs kultūros netrukdo jiems atskirti į bet specializuotos ląstelės organizmo stotelėje linijos platinimo ir pridedant atitinkamus reguliavimo signalus. Apribojimas diferenciacija hESCs, atsižvelgiant in vitro somatinių ląstelių yra realizuotas be mezenchima dalyvavimo, aplenkiant Nohteyaov, yra organogenezė ir be embriono formavimas. Neeuropinis ESC vartojimas in vivo neišvengiamai veda prie teratokarcinomų susidarymo. ESRK transplantacija į blastocistos arba ankstyvą embriono lydimas jų susiejimas su embriono audinių ir jos stabilių chimerization organų.

Regeneracija ir plastikiniai technologijos grindžiamos ląstelių transplantacija yra sankirtos narių ląstelių biologijos, Developmental Biology, eksperimentinių genetikos, imunologijos, neurologijos, kardiologijos, hematologijos ir daugelyje kitų sričių Eksperimentinės ir praktinės medicinos interesų vieta. Svarbiausi eksperimentiniai rezultatai rodo, kad perprogramavimo kamienines ląsteles su savo savybių, kurios atveria perspektyvas kontroliuoti cytodifferentiation procesus su augimo faktoriais pakeisti kryptį galimybę - miokardo regeneracijos, restauravimo CNS pakitimai ir normalizuoti funkcija salelių aparato kasos. Tačiau, kad būtų plačiai įvedimas transplantacijos dariniai ESRK medicinos praktikoje yra būtina, siekiant ištirti žmogaus kamieninių ląstelių savybes išsamiau ir papildomi eksperimentai su PGCs eksperimentinių modelių ligų.

Bioetikos klausimai ir atmetimo alogeninių ląstelių transplantacijos problema gali išspręsti pastebėtas plastiškumą Regioninės suaugusiųjų kamieninių ląstelių genomą. Tačiau, pradinis informacija yra ta, kad kai persodinti kepenis izoliuotas ir gerai būdinga autologines hematopoetinės ląsteles, iš kurių yra naujų hepatocitų, įtraukiant į kepenų skiltelių, kurios dabar yra peržiūrimi ir kritikavo. Tačiau, paskelbtas duomenis, kad nervinių kamieninių ląstelių užkrūčio transplantacija yra naujų daigų donorų T-ir B-limfocitų formavimas, ir persodinti neuroninių kamieninių ląstelių smegenų kaulų čiulpų veda prie kraujodaros gemalų patyrė donoro mieloidinių ir eritropoeze formavimo . Todėl suaugusiųjų organų gali būti išsaugota kamieninės ląstelės, galinčių genomo perprogramuojant Esc talpos.

Šaltinis ESRT medicinos reikmėms lieka žmogaus embrionas, kuris lemia naujos kirtimo moralinių, etinių, moralinių, teisinių ir religinių klausimų neišvengiamumą tuo žmogaus gyvenimo kilmę. ESC atradimas suteikė galingą postūmį atšaukti griežtas diskusijas apie tai, kur guli ties linija tarp gyvųjų ląstelių ir materijos, substancijos ir asmenybės. Tuo pačiu metu nėra visuotinių normų, taisyklių ir įstatymų, susijusių su ESK naudojimu medicinoje, nepaisant pakartotinių bandymų juos kurti ir priimti. Kiekviena valstybė savo teisės aktuose išsprendžia šią problemą savarankiškai. Savo ruožtu gydytojai iš viso pasaulio ir toliau bando plėtoti regeneracinį plastiką per tokias diskusijas, visų pirma naudojant ne embrionines kamienines ląsteles ir suaugusiųjų organizmo kamieninių ląstelių atsargas.

Kai kuri iš embrioninių kamieninių ląstelių izoliavimo istorijos

Terato- (embrionų) ląstelės buvo išskirtas iš -kartsinomnye spontaniškai vyksta sėklidžių teratomas pelių kamieno 129 / centras-Sv, spontaniškai kiaušidžių teratomas pelės linijos Lt / Sv, ir iš teratomas, ektopichno šaltinis buvo persodintų ląstelių arba embriono audinį. Tarp tokiu būdu gautų terato- stabilių pelės linijų (embrionų) -kartsinomnyh kai kurių ląstelių yra daugiapotencinės, kiti buvo atliktas diferenciacijos tik ląstelių vieno konkretaus tipo, o kai kurie buvo bendrai negali cytodifferentiation.

Tuo metu pagrindinis dėmesys buvo mokslinius tyrimus, kurie parodė galimą grąžą terato- (embrionų) -kartsinomnyh ląstelių normalaus fenotipo po jų įvedimo į besivystančio embriono audinių, taip pat darbą sukurti in vitro genetiškai modifikuotų terato- (embrionų) -kartsinomnyh ląstelių, kurių pagalba buvo gautos mutantinės pelės, skirtos biologiniam žmogaus išangės patologijos modeliavimui.

Izoliuoti terato- linijas (embrionų) buvo naudojamas oro kondicionavimo -kartsinomnyh ląstelių suspensijos kultūroje. Į kultivavimo terato- (embriono) -kartsinomnye ląstelių, pavyzdžiui, ESRT, augti, kad sudarytų embryoid įstaigas ir reikalauti, kad būtų išversti į liniją privalomą disociacijos išlaikyti pluripotency ant tiektuvo sluoksnio embrioninių fibroblastų arba suspensija auginimo į apdorotų laikmenų. Terato- daugiapotencinės ląstelės (embrionų) - karcinomos linijos didelis, sferinės, turi aukštą aktyvumą šarminės fosfatazės, formos agregatų ir yra pajėgi daugiakryptės diferenciaciją. Kai įvedamas į blastocistos yra sujungti su morulae, todėl chimerinių embrionų formavimo, įvairių organų ir audinių, kurie yra dariniai rasti terato- (embrionų) -kartsinomnyh ląsteles. Tačiau didžioji dauguma tokių chimeriniais embrionų žūsta gimdoje, ir organų išgyventi chimeras naujagimių užsienio ląsteles ir retai aptinkami su mažo tankio. Tuo pačiu metu navikų (fibrosarkomos, rabdomiosarkoma ir kitų tipų piktybinės patinimas ir adenomos kasos) smarkiai didėja, ir neoplastinę degeneracijos atvejų dažnai atsitinka net gimdoje chimeriniais embrionų.

Dauguma terato embrionukarcinomos ląstelių įprastų embrioninių ląstelių mikropicinėje aplinkoje beveik natūraliai įgyja piktybines neoplastines savybes. Manoma, kad negrįžtama piktybinė liga atsiradusi dėl proto-onkogenų aktyvacijos struktūrinių pertvarkymų procese. Viena išimtis yra ląstelių linijos embriokartsinomnoy SST3, teratoma, gauto iš pelių sėklidžių (linijos 129 / SV-centras), kuri pasižymi dideliu galimybę integruoti į audinį ir organų vaisiaus be vėlesnio auglių susidarymo į chimerinių pelių. Terito embrionukarcinomos ląstelių linijų išvestinės medžiagos chimerų pelėse praktiškai nedalyvauja pirminių gonocitų formavime. Akivaizdu, kad tai susiję su aukšto dažnio bendri daugumai terato- (embriono) chromosomų aberacijos -kartsinomnyh linijų, kuriomis ląstelės pasireiškia kaip Aneuploidijos ar chromosomų anomalijos.

Keletas stabilios terato- linijos (embriono) -kartsinomnyh žmogaus ląstelė buvo paruošti pagal laboratorinėmis sąlygomis, besiskiriantis tuo, pluripotency, aukštos proliferacinė aktyvumą ir gebėjimą atskirti kultūros augimo metu. Visų pirma, žmogaus terato embriono-karcinomos ląstelių NTERA-2 linija buvo naudojama neuroninės citodiferencijos mechanizmams tyrinėti. Po šios linijos ląstelių transplantacijos į žiurkių priekinės dalies subventrikuliarinę sritį buvo stebima jų migracija ir neuronogenezė. Būta net bando persodinti neuronų terato- gautą auginant ląsteles (embrionų) -kartsinomnoy linija NTERA-2, pacientams, sergantiems smūgių, kurie, anot autorių, todėl klinikinėje tobulinti ligos. Tuo pačiu metu ligonių, sergančių insultu, piktybinės persodintos ląstelės terato embriono karcinomos linijos NTERA-2 nebuvo pastebėtos.

Pirmoje eilutėje nediferencijuotose pliuripotencinių embrioninių kamieninių ląstelių pelėms pradžioje 80-ųjų praėjusio šimtmečio gavo Evans ir Martin, pasirinkdami juos iš vidinės ląstelių masė yra blastocistos - embryoblast. Išskirtos ESC linijos ilgą laiką išsaugo daugybę potencialų ir sugebėjimą diferencijuoti į skirtingų tipų ląsteles, veikiant specialios kultūrinės terpės veiksnius.

Terminas "embriono kamieninės ląstelės" priklauso Leroy Stevens, kad tabako dervų poveikį naviko vystymosi dažnio tyrimas atkreipė dėmesį į spontaniškai sėklidžių teratokarcinoma linijinės (129 / V) pelių kontrolinės grupės atsiradimo. Sėklidžių teratokarcinoma ląstelės buvo būdingas didelis proliferacijos norma, ir skysčio kairiojo į pilvo ertmę su savaiminio diferenciacijos Neuronai, keratinocitų, chondrocitų, kardiomiocitų, taip pat plaukų ir kaulų fragmentų formavimo buvimą, bet be jokios tvarkingai cytoarchitectonics tinkama audinių nuoroda. Kai sodinimo į teratokarcinoma ląstelių kultūroje auginami nepritvirtinta prie pagrindo pliuripotencinių klonų ir tada formuojasi embryoid kūnai buvo skaldomas ir veikiamas spontaniškai dalijimosi Disorderly diferencijuoti į Neuronai, glia, raumenų ląstelių ir kardiomiocitų. Tiwn nustatė, kad teratokarcinoma pelės 129 / t yra mažiau nei 1% ląstelių, galinčiomis atskirti į specializuotos somatinių linija įvairovė, ir pati diferenciacija priklauso nuo veiksnių, kurie turi įtakos juos (sudėtis pilvaplėvės skysčio, įtrauktus produktus į brandžių ląstelių arba audinių kultūros). Leroy Stevenson prielaida apie tarp teratokarcinoma ląstelių buvimo embriono kamieninių seksualinė lytinių ląstelių buvo patvirtinta: suspensijos embryoblast priešimplantaciniu embrionų ląstelių suaugusiųjų pelės audinių suformuota teratokarcinoma, ir, atskirta nuo jų grynų ląstelių linijų po to, kai į pilvaplėvės ertmę su recipiento gyvūnai buvo diferencijuoti į neuronų, kardiomiocitų ir kitų somatinių kletki visų trijų embrioninių lankstinukų dariniai. Eksperimentuose in vivo transplantacijos ESK (gauta iš embryoblast, bet ne trofoblastų) pelių embrionų skirtingais etapais linijų 8-32 blastomere baigėsi gimimo Chimerinio gyvūno (ne naviko formavimui) organų, kuris nustato daigai donoro audinių. Chimerizmas buvo stebimas net lyties ląstelių linijoje.

Pirminės kamieninių lytinių ląstelių, išskirtas iš pelės embriono gemalų lyties, morfologijos, imunologinio fenotipo ir funkcinių savybių nuosekliai su hESCs, gautų iš teratokarcinoma Stevenson ir embryoblast. Ne chimerų, gimusių po administravimo hESCs į blastocistos, allofenny organų Morphogenesis pasižymi mozaikos kintamoji donoro ir recipiento struktūrinis ir funkcinis vienetų, kepenų, plaučių ir inkstų. Daugeliu atvejų buvo pastebėta kepenų žarnyno švirkštų arba kepenų lervų susidarymas, susidedantis vienu metu iš recipiento ir donoro ląstelių. Tačiau visada morfogenezės realizavimas įvyko pagal genetinę rūšies, kuriai priklausė gavėjas, programą, o chimerizmas buvo apribotas vien tik ląstelių lygiu.

Tada, buvo nustatyta, kad hESCs proliferacija be cytodifferentiation dėl finansuojančiojo Layer-kilęs mezenchiminių ląstelių (vaisiaus fibroblastų) įvyksta LIF privalomas pasirinktinio maitinamosios terpės, kurie selektyviai teikia tik išgyvenimo kamieninių ir kamieninių ląstelių buvimą, tuo tarpu didžioji dauguma iš specializuotų ląstelių elementų miršta. Su šių metodų 1998 m James Thomson pagalba buvo skirta penkių imortalizuotq linijas embrioninių kamieninių ląstelių iš vidinės ląstelių masė yra blastocistos asmeniui. Tais pačiais metais Jonas Gerhart sukūrė izoliuoti nemirtinga ESC linijas nuo seksualinio sluoksniuotos keturių-penkių savaičių žmogaus embrionų metodą. Dėl savo unikalių savybių, tik du metų embrioninių kamieninių ląstelių ir kamieninių ląstelių galutinis audinys pradėjo būti naudojamas regeneracinės medicinos ir genų terapijos praktikoje.