Herpeso diagnozė

Herpeso diagnozė pagrįsta klasikiniu viruso išskyrimu jautriose ląstelių kultūrose, imunofluorescenciniais ir serologiniais metodais, kolposkopiniu tyrimu bei šiuolaikinių molekulinės biologijos metodų (PGR, taškinės hibridizacijos) naudojimu, kurie leidžia diagnozuoti visą herpeso virusų grupę, įskaitant HHV-6 ir HHV-7 tipus.

Laboratoriniai herpeso infekcijos diagnostikos metodai

Pagrindiniai metodai, skirti išskirti HSV arba aptikti virusines daleles ir (arba) jų komponentus	Pagalbiniai metodai, skirti aptikti antikūnus prieš HSV žmogaus kūno biologiniuose skysčiuose
HSV išskyrimas jautriose ląstelių ir gyvūnų kultūrose Tiesioginė ir imuninė elektroninė mikroskopija Tiesioginiai ir netiesioginiai IPA variantai IFA Molekulinės biologijos metodai Latekso agliutinacijos reakcija	Neutralizavimo reakcija RSC Antikūnų prieš HSV-1,2 nestruktūrinius baltymus nustatymas

Nustatyta, kad 76 % pacientų lytinių organų pūslelinę (GH) sukelia HSV-2, o 24 % – HSV-1 tipas. Be to, GH kaip monoinfekcija pasireiškė tik 22 % pacientų, 78 % atvejų buvo aptikta mikrobų asociacija. 46 % asmenų buvo nustatyta dviejų patogenų sukelta parazitocenozė, įskaitant chlamidijas, kurios aptiktos 40 % atvejų. Gardnerella, Trichomonas ir gonokokai tepinėliuose buvo aptinkami rečiau.

27 % pacientų parazitocenozę atstovavo trys patogenai, 5,2 % – keturi patogenai. Be to, dažniausiai buvo pastebėtas chlamidijų derinys su gardnerella ir Candida grybeliais. Šie duomenys pagrindžia išsamaus bakteriologinio pacientų, sergančių GH, tyrimo poreikį, siekiant nustatyti patogeninių agentų derinius, taip pat išsamų mišrių urogenitalinio trakto infekcijų patogenezės tyrimą, kuris leistų diferencijuoti kompleksinį herpeso infekcijos gydymą.

Medžiagos, tirtos HSV išskyrimui, priklausomai nuo herpetinių pažeidimų lokalizacijos

Pažeidimų lokalizacija	Pūslelių turinys	Ląstelių grandymas				CSF	Bronchų aspiratas	Biopsija	Kraujas
		1	2	3	4
Oda	+								+
Akys			+						+
Genitalijos				+					+
Išangė	+				+				+
Burna	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Plaučiai		+					+		+
Kepenys								+	+
Įgimtas herpesas	+	+	+				+		+

Citomegalovirusinės infekcijos laboratorinės diagnostikos metodai

Metodai	Laikas, reikalingas rezultatams gauti	Pastabos
VIROLOGINIAI
Elektroninė mikroskopija	3 valandos	Nelabai prieinama
Viruso išskyrimas ląstelių kultūroje (VCI)	4–20 dienų	Standartinis, lėtas
Ankstyvojo AG imunofluorescencinis dažymas naudojant monokloninius antikūnus	6 valandos	Mažiau konkretus
CITOLOGINIS	2–3 valandos	Mažiau konkretus
SEROLOGINIS
RSC	2 dienos	Standartinis
RGA	1 diena	Darbo jėgos imlus
RIFAS	6 valandos	Paprasta, konkreti
NRIF	6 valandos	Sunku
RIMP	6 valandos	Sunku
ELISA (IgM, DO)	6 valandos	Greita, paprasta
Imunoblotas	6 valandos	Brangus
MOLEKULINĖ BIOLOGIJA
MG	5–7 dienos	Brangus, daug darbo reikalaujantis
PGR	3 valandos	Brangus

Herpes zoster viruso diagnostikos metodai

Diagnostiniai metodai	Laboratoriniai metodai
NETIESIOGINĖ
Pasirinkimas	Audinių kultūra, vištų embrionai, laboratoriniai gyvūnai, bendra kultūra su permisinėmis ląstelėmis arba helper virusais
Izoliatų identifikavimas	Neutralizavimo reakcija, RSC, IF, PIEF, izoliatų nusodinimo reakcija, agliutinacija, IF
TIESIOGINIS
Citologija	Tepinėliai: spalvinė imunofluorescencija
Histologija	Ląstelės patomorfologija
Struktūra	Embrioninė mikroskopija, imunoelektroninė mikroskopija
Antigenų nustatymas	JEI, PIEF, RIM, IFA
Vietinės antikūnų gamybos nustatymas	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekulinės biologijos metodai	Molekulinė hibridizacija, PGR

Herpes zoster viruso sukeltos infekcijos laboratorinė diagnostika

Diagnostinės problemos	Metodai	Laukiami rezultatai
Ūminė pirminė infekcija	1	Aptikimas per 2 valandas
	2	Antikūnų kiekis lėtai kyla
	3	Pasireiškia 3 dienas po užsikrėtimo
Ūminė reaktyvuota infekcija	1	NUU aptikimas po 2 valandų
	2	Antikūnų kiekis lėtai kyla
	4	Pasireiškia praėjus 4 dienoms po bėrimo atsiradimo

1. VEGF pūslelių nustatymas skystyje;
2. serologija: CSC, ELISA, skirta aptikimui
3. serologija: ELISA, skirta IgM aptikimui;
4. serologija: ELISA, skirta IgA, IgM aptikimui.

Metodai, skirti nustatyti imuninį atsaką į herpes zoster viruso infekciją

Požiūris	Metodas
Antikūnų titro padidėjimo nustatymas antrame serume	RSK, RTGA, RPGA, IF neutralizacijos reakcija, RIM, ELISA
Ig G, Ig A klasėms būdingų antikūnų nustatymas pirmame serumo mėginyje	ELISA, IF, RIM, latekso agliutinacija

Pacientų serologinio herpesviruso infekcijų tyrimo (ELISA) rezultatų interpretavimas

Infekcijos / žymens pavadinimas	Vidutinės infekcijų ribinės vertės
	Analizės rezultatai	Interpretacija
Citomegalijos anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV IgM (100–300 %)	Teigiamas 1–6 Teigiamas 6–10 Teigiamas >10 Neigiamas Teigiamas 100–300 Neigiamas <90 Abejotinas 90–100	Remisija Ligos paūmėjimas Ūminė ligos fazė Nėra infekcijos (ligos) Ūminė ligos fazė Pakartokite analizę po 2–3 savaičių
Herpes simplex 1, 2 serotipai. Iš viso anti-HSV 1/2 (100–900 %).	Teigiamas 100–400 Teigiamas 400–800 Teigiamas >800 Neigiamas <100	Remisija Ligos paūmėjimas Ūminė ligos fazė Infekcijos (ligos) nėra

Lentelėje pateikiami pagrindiniai herpesviruso infekcijų laboratorinės diagnostikos metodai, taip pat rekomenduojamos biologinės medžiagos, kurios tiriamos izoliuojant HSV, atsižvelgiant į herpetinių pažeidimų lokalizaciją.

Patikimas herpes simplex ir CMV virusų išskyrimas užkrečiant jautrias ląstelių kultūras. Taigi, atliekant 26 pacientų virusologinį tyrimą atkryčio laikotarpiu, HSV buvo išskirtas jautrioje Vero ląstelių kultūroje 23 atvejais (88,4%). Užkrėstose kultūrose buvo pastebėtas HSV būdingas citopatinis poveikis – daugiabranduolių milžiniškų ląstelių susidarymas arba apvalių ir padidėjusių ląstelių sankaupos klasterių pavidalu. 52,1% atvejų viruso citopatinio poveikio židiniai buvo aptikti jau praėjus 16–24 valandoms po užsikrėtimo. Praėjus 48–72 valandoms po užkrėstų kultūrų inkubacijos, specifinį ląstelių sunaikinimą sukeliančių medžiagų procentas padidėjo iki 87%. Ir tik 13% atvejų teigiami rezultatai buvo aptikti praėjus 96 valandoms ar daugiau po užsikrėtimo arba pakartotinio persėjimo metu.

Generalizuotos herpeso infekcijos laboratorinės diagnostikos metodai

Pagrindiniai metodai, skirti aptikti (izoliuoti) herpeso virusus, jų daleles ir jų komponentus

Pagalbiniai metodai, skirti aptikti antikūnus prieš herpeso virusus biologiniuose skysčiuose, aptikti fermentinius pokyčius kraujo serume

Herpes virusų išskyrimas jautriose ląstelių ir gyvūnų kultūrose. Tiesioginė ir imuninė elektroninė mikroskopija. Tiesioginiai ir netiesioginiai imunoperoksidazės metodo variantai. Tiesioginiai ir netiesioginiai fluorescencinių antikūnų metodo variantai. Kietosios fazės fermentinio imunofermentinio tyrimo variantai. Molekulinės (DNR-DNR) hibridizacijos metodo variantai. Polimerazės grandininė reakcija. Latekso agliutinacijos reakcija.

Neutralizavimo testas, Komplemento fiksacijos testas, Latekso agliutinacijos testas, Netiesioginė fluorescencinių antikūnų metodo versija, Netiesioginė imunoperoksidazės metodo versija, Kietosios fazės fermentinio imunofermentinio tyrimo variantai, Imuninio blotavimo metodas, Radialinis komplemento fiksacijos metodas, Alanino ir aspartato aminotransferazės lygių nustatymas.

Serologiniai metodai naudojami infekcinei mononukleozei (EBV sukeltai infekcijai) diagnozuoti. Paul-Bunnell reakcija su avinų eritrocitais, diagnostinis titras 1:28 ar didesnis vienkartiniame kraujo serumo tyrime arba 4 kartus padidėjęs antikūnų kiekis tiriant porinius serumus. Naudojama Hoff-Bauer reakcija su 4 % formalinizuotų arklių eritrocitų suspensija. Rezultatas įvertinamas po 2 minučių; sergant infekcine mononukleoze, reakcija yra labai specifinė.

Šiuo metu kuriamas fermentinio imunofermentinio tyrimo (EIA) metodas infekcinei mononukleozei diagnozuoti. Šiuo atveju IgG ir IgM antikūnai paciento serume nustatomi inkubuojant jį su EBV užkrėstais limfoblastais, o vėliau gydant fluorescenciniais antikūnais. Ūminiu ligos laikotarpiu antikūnai prieš viruso kapsidės antigeną nustatomi 1:160 ir didesnio titro.

Naudojant daugybę importuotų komercinių tyrimų sistemų, ELISA gali aptikti: antikūnus prieš EBV apvalkalo antikūnus, antikūnus prieš ankstyvąjį EBV antigeną, bendrus antikūnus prieš ankstyvąjį EBV antigeną, nustatytus ūminėje ligos fazėje tiek branduolyje, tiek ląstelės citoplazmoje, ir ribotus antikūnus prieš ankstyvąjį EBV, nustatytus ūminėje ligos fazėje tiek branduolyje, tiek ląstelės citoplazmoje, ribotus antikūnus prieš ankstyvąjį EBV antigeną, nustatytus ligos įkarštyje tik ląstelės citoplazmoje, ir antikūnus prieš EBV branduolio antigeną. Šių tyrimų sistemų naudojimas leidžia diferencijuoti daugelio su EBV susijusių ligų diagnostiką.

Po teigiamo ELISA testo, kuris atskleidžia antikūnus prieš EBV, atliekama patvirtinamoji imunoblotavimo reakcija, kurios metu nustatomas antikūnų prieš atskirus EBV žymenų baltymus (p-baltymus) buvimas: p23, p54, p72 (šio baltymo buvimas rodo EBV dauginimosi galimybę), p 138. Minėti laboratoriniai metodai taip pat naudojami gydymo veiksmingumui stebėti.

Virusologinių metodų jautrumas yra 85–100 %, specifiškumas – 100 %, tyrimo trukmė – 2–5 dienos. Praktiniame darbe dažnai naudojamas tiesioginės imunofluorescencijos metodas (DIF) su polikloniniais arba monokloniniais antikūnais prieš HSV-1 ir HSV-2. DIF metodas gana lengvai atkartojamas įprastoje klinikinėje laboratorijoje, nėra brangus, jautrumas viršija 80 %, specifiškumas – 90–95 %. Imunofluorescencinės mikroskopijos metu nustatytas citoplazminių intarpų buvimas, morfologiniai požymiai, užkrėstų ląstelių procentas tepinėliuose-grandose iš šlaplės, gimdos kaklelio kanalo, gimdos kaklelio, tiesiosios žarnos.

PIF metodas suteikia idėją apie ląstelių morfologines savybes ir HSV antigenų lokalizacijos pokyčius. Be tiesioginių herpeso virusų sukelto ląstelių pažeidimo požymių (specifinės liuminescencijos nustatymas), pagal PIF duomenis yra ir netiesioginių herpeso infekcijos požymių:

• branduolinės medžiagos sankaupa, kariolemmos atsiskyrimas;
• vadinamųjų „skylių“ branduolių buvimas, kai iš ląstelės branduolio lieka tik viena kariolemma;
• intranuklearinių intarpų buvimas - Cowdry kūnai.

Atliekant PIF tyrimą, gydytojas gauna ne tik kokybinį, bet ir kiekybinį užkrėstų ląstelių būklės įvertinimą, kurį panaudojome antivirusinio gydymo acikloviru (AC) veiksmingumui įvertinti. Taigi, naudojant PIF metodą dinamikoje buvo ištirti 80 pacientų, sergančių paprastuoju lytinių organų pūsleline (GH). Paaiškėjo, kad jei prieš gydymą acikloviru 88 % pacientų tepinėliuose buvo didelis užkrėstų ląstelių procentas (50–75 % ir daugiau), tai po vieno acikloviro kurso 44 % pacientų tepinėliuose buvo aptiktos sveikos ląstelės, 31 % atvejų buvo pastebėtos pavienės užkrėstos ląstelės, o 25 % pacientų buvo iki 10 % užkrėstų ląstelių.

Užkrėstų ląstelių kiekis pacientų, sergančių lytinių organų pūsleline ir gydytų acikloviru, tepinėliuose (PIF reakcija)

Ligos laikotarpiai	Procentinė dalis tepinėliuose
	Užkrėstos ląstelės					Normalios ląstelės
	Daugiau nei 75%	50–75 %	40–50 %	10%	Pavienės ląstelės regėjimo lauke
Recidyvas (prieš gydymą)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remisija (po gydymo)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Daugelį metų taikant PIF ir taškinės hibridizacijos metodą, pastebėta, kad tyrimo rezultatai beveik 100 % atvejų sutampa. Pažymėtina, kad siekiant padidinti herpeso diagnozės patikimumą, ypač esant subklinikinėms ir mažai pasireiškiančioms herpeso formoms, darbe rekomenduojama naudoti 2–3 laboratorinės diagnostikos metodus, ypač tiriant nėščias moteris, moteris su nepalankia akušerine istorija ir asmenis, kuriems nustatyta nenustatyta ginekologinė diagnozė.

Taigi, atliekant urogenitalinio trakto virusinių ir bakterinių infekcijų PGR diagnostiką, būtina įvertinti teigiamus rezultatus, gautus atsižvelgiant į anamnezę, specifinių klinikinių ligos simptomų buvimą (arba nebuvimą). Jei PGR metodu nustatoma chlamidija, tokiu atveju yra didelė infekcijos tikimybė ir atitinkamai gali būti sprendžiami gydymo klausimai. Aptikus mikoplazmas (ureaplazmas), kurios yra oportunistiniai mikroorganizmai, diagnozei patvirtinti reikalingi papildomi kultūriniai tyrimai, t. y. paciento medžiagos sėjimas į jautrias ląstelių kultūras. Tik gavus teigiamus kultūrinės analizės rezultatus, galima kalbėti apie laboratorinį mikoplazmozės diagnozės patvirtinimą. Tas pats metodas prireikus leis nustatyti išskirtų mikoplazmų jautrumą dažnai vartojamoms vaistų formoms (antibiotikams, fluorokvinolonams ir kt.).

Galima vienu metu užsikrėsti keliais Herpesviridae šeimos virusais. Dažnai nustatydavome vieno paciento užsikrėtimą HSV-1, HSV-2 ir CMV virusais. Pacientai, kuriems pasireiškė klinikiniai ir laboratoriniai antrinio IDS požymiai (onkohematologiniai, onkologiniai, ŽIV infekuoti pacientai), žymiai dažniau užsikrėtė keliais herpeso virusais. Taigi, įrodyta, kad ŽIV infekcijos progresuojantys klinikiniai ir imunologiniai sutrikimai lydimi molekulinės hibridizacijos metodu aptinkamų herpeso virusų skaičiaus padidėjimo. Šiuo atveju prognostiškai reikšmingiausiu galima laikyti kompleksinį vienalaikį HSV-1, CMV ir HHV-6 tipo DNR nustatymą.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]