Laboratorinė tuberkuliozės diagnozė

Tuberkuliozė yra liga, kurią sunku diagnozuoti šiuolaikinėmis sąlygomis ir mokslo laimėjimais. Laboratorinė tuberkuliozės diagnozė yra pagrindinė kitų diagnostikos metodų dalis, antra, tik rentgeno tyrimų metodika.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]

Klinikinis kraujo tyrimas

Pacientams, sergantiems tuberkulioze, bendrosios kraujo analizės pokyčiai nėra patognomoniniai. Esant ribotoms ir neaktyvioms tuberkuliozės formoms, eritrocitas normaliai yra hipochromingas. Kai masyvūs infiltratai arba kazeozinio pneumonija, o paplitimas pseudotuberkuliozė, konkrečių žarnyno pažeidimų, taip pat dėl didelio plaučių ar pooperacinio kraujavimo ir atkreipkite dėmesį erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytoze ir ypač poikilotsitozas patenkina daug rečiau, dažniausiai su sunkia anemija. Retikulocitų skaičius pakopoje tuberkuliozės kompensuojamas svyruoja nuo 0,1 iki 0,6%, su subcompensated - nuo 0,6 iki 1,0% ir 1% yra būdingas dekompensacijq retikulocitų.

Kai tuberkuliozės kai kuriais atvejais gali būti vidutinio leukocitozė (iki 15 tūkstančių leukocitų.), Mažiau spinduliuotės, kuri pasitaiko 2-7% pacientų, sergančių ribotų ir lengvas procesas vyksta formų ir 12,5% - Griaunamojo ir laipsnišką plaučių tuberkuliozės .

Dažniausiai pasikeičia leukocitų formulė. Pažymėkite santykinę ir absoliučią neutrofiliją, vidutinį leukocitų formulės poslinkį į kairę prieš promielocitus. Mielocitai labai retai pasireiškia nesuklijusi tuberkulioze. Didinti neutrofilų su nenormaliu grūdų pacientams haemogram tuberkuliozės skaičių visada parodo, kad proceso trukmę: pacientams, sergantiems sunkia tuberkuliozės beveik visi neutrofilų yra nenormalus grūdus. Kai tuberkuliozė protrūkis baigiasi, branduolinis poslinkis palyginus greitai pasiekia įprastą. Patobulintas neutrofilų išsiskyrimas paprastai išlieka ilgiau nei kiti hemogramos pokyčiai.

Eozinofilų kiekis periferiniame kraujyje taip pat skiriasi priklausomai nuo proceso fazės ir organizmo alerginės būklės. Jų kiekis mažėja iki aneozinofilijos sunkių ir užsitęsusių ligos protrūkių atveju, ir, atvirkščiai, didėja, kai rezorbuojasi infiltratai ir pleuros ertmės, taip pat ankstyvosios pirminės tuberkuliozės formos.

Daugumai pirminės tuberkuliozės formų yra limfopenija, kuri kartais pasireiškia keletą metų net ir po konkrečių pokyčių randų. Antrinei tuberkuliozei paūmėjimo fazėje, priklausomai nuo proceso sunkumo, gali lydėti arba įprastas limfocitų skaičius, arba limfopenija.

Ji užima ypatingą vietą, nustatantį eritrocitų nusėdimo greitis papildomi bandymai įvertinti tuberkuliozės procesą (TVA), kurio vertė yra įvertinti srauto tuberkuliozės procesą ir nustatyti savo aktyvias formas. Padidėjimas ESR parodo, kad patologinės proceso (infekcinės-uždegiminė, pūlingo septinio, hemoblastosis, Hodžkino ir kt.), Buvimą ir tai rodo, kad jos sunkumą, bet normalaus lygio esr ne visada nurodo patologijos nebuvimą. Pagreitis eritrocitų nusėdimo prisidėti prie kraujo lygių globulinų, fibrinogeno, cholesterolio padidėjimą ir sumažinti kraujo klampumą. Eritrocitų sedimentacijos sulėtėjimas yra būdingas būklėms, kurioms būdingas hemokoncentracija, padidėjęs albuminų ir tulžies rūgščių kiekis.

Pacientų, sergančių tuberkulioze, hemograzė keičiasi gydymo metu. Hematologiniai poslinkiai išnyksta kuo greičiau, tuo sėkmingesnė terapinė intervencija. Tačiau reikėtų nepamiršti įvairių antibakterinių vaistų poveikio hemopoeizei. Jie dažnai sukelia eozinofiliją, kai kuriais atvejais - leukocitozę, dažniau leukopeniją iki agranulocitozės ir limfoidine ir retikuline reakcija. Norint įvertinti paciento klinikinę būklę, proceso dinamiką ir gydymo efektyvumą būtina sistemingai atlikti hematologinę kontrolę ir teisingai išnagrinėti gautus duomenis.

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]

Klinikinė šlapimo analizė

Esant šlapimo sistemos tuberkuliozei, šlapimo tyrimas yra pagrindinis laboratorinės diagnostikos metodas. Jūs galite stebėti leukocituriją, eritrocitūrą, proteinuriją, hipoizostenuriją, tuberkuliozės mikobakteriją, nespecifinę bakteriuriją.

Leukociturija - labiausiai paplitęs simptomas tuberkuliozės šlapimo sistema prieš chemoterapiją ir nėra konkretus tik išimtiniais atvejais, pavyzdžiui, visiškai išnykimo iš šlapimtakių spindyje. Nechyporenko testas (nustatymas leukocitų 1 ml šlapimo skaičiaus) padeda objektyviau įvertinti laipsnį leukocyturia nefrotuberkuloze su, ir kai kuriais atvejais ją nustatyti esant normaliam šlapimo. Tačiau reikia atsižvelgti į tai, kad leukociturija gali pasireikšti ūminiu ir lėtiniu pyelonefritu, cistitu, uretritu, inkstų ir šlapimo akmenimis.

Eritrocitrija. Taip pat leukociturija. Yra laikomi vienu iš labiausiai paplitusių genitologinės sistemos tuberkuliozės laboratorinių požymių. Hematurijos dažnis priklauso nuo proceso paplitimo, jis didėja, kai inkstuose išsivysto destruktyvus tuberkuliozės procesas. Eritrocitrija be leukociturijos yra labiau būdinga inkstų tuberkuliozės ankstyvosioms stadijoms. Hematūrija, kuri vyrauja per leukocituriją, yra svarbus argumentas dėl inkstų tuberkuliozės, diferenciacijos su nespecifiniu pielonefritu.

[17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]

Biocheminis kraujo tyrimas

Kai tuberkuliozė, kai kurių biocheminių parametrų pasikeitimai visų pirma priklauso nuo proceso fazės, komplikacijų ir įvairių ligų. Pacientams, sergantiems neaktyvia plaučių ir kitų organų tuberkulioze, bendras kraujo serumo baltymų ir baltymų kiekis nekeičiamas ir nustatomas jų normalus kiekis.

Ūminėse ligos formose, taip pat lėtinių tuberkuliozės formų paūmėjimų ir progresavimo metu sumažėja albumino-globulino koeficientas.

Svarbu vertinant funkcinę būklę organinės žalos ir kepenų tuberkuliozės ir jo komplikacijų yra iš viso kraujo serume ir tiesioginio bilirubino, AST (ACT), alaninaminotransferazės (ALT) nustatymas. Dinaminis aminotransferazių kiekio nustatymas. Bilirubino gydymas tuberkulioze sergantiems pacientams, ypač sunkiomis formomis, yra privalomas tuberkuliozės pacientų biocheminio tyrimo komponentas ir atliekamas kas mėnesį.

Inkstų funkcinės būsenos įvertinimas apima kreatinino koncentracijos serume nustatymą ir glomerulų filtracijos greičio apskaičiavimą pagal Cockcroft-Gault formulę. Apskaičiuojant glomerulų filtracijos greitį naudojant Reberg mėginį, gaunami ne tokie tikslūs rezultatai.

Pagrindinis tuberkuliozės pacientų dinaminių biocheminių tyrimų tikslas - stebėti proceso eigą, laiku nustatyti vaistų šalutinį poveikį ir tinkamai ištaisyti atsiradusius homeostazinius sutrikimus.

[28], [29], [30]

Biocheminių tyrimo metodų taikymas ekstrapusinės tuberkuliozės metu

Labiausiai informatyvus rodiklis yra tuberkulo rūgšties rūgšties kiekis biologiniuose skysčiuose, tačiau jo apibrėžimas yra susijęs su techniniais sunkumais (dujų chromatografijos ir masių spektrometrijos poreikis).

Perspektyvinis adenozino deaminazės - fermento, nustatyto skysčiuose, aktyvumo matavimas: sinovinė, perikardo, ascitinė arba stuburo. Pagrindiniai adenozino deaminazės gamintojai yra limfocitai ir monocitai. Adenozino deaminazės aktyvumo nustatymas biologiniuose skysčiuose palengvina tuberkuliozės sinovito, limfinių mazgų tuberkuliozės, tuberkuliozės meningito, tuberkuliozės serozito diagnozę.

Kai kurie biocheminiai rodikliai dėl jų nespecifiškumo nustatomi tik biologiniuose skysčiuose, arti pažeidimo dėmesio. Nustatykite indikatorių lygį, reaguodama į poodinę ar intraderminę tuberkulino injekciją (paprastai iki 48 ir 72 valandų po jo). Po to, žymeklio lygio prieaugis (%) apskaičiuojamas atsižvelgiant į pradinį lygį.

Optimalus organų specifinio transamnidazės fermento aktyvumo nustatymas šlapime, kurio išvaizda pastebima, kai paveikiami įvairios gamtos inkstai. Transamidinozės tyrimas pagrįstas tik tuomet, kai tuberkulino injekcija yra poodinė, siekiant sustiprinti vietinį uždegiminį procesą. Iš pradžių nustatykite transamidino aktyvumą šlapime ir 24-72 valandas po 50 TE tuberkulino įvedimo. Fermentijos padidėjimas 2 ar daugiau kartų leidžia 82% atvejų diferencijuoti inkstų aktyvią tuberkuliozę nuo lėtinio pielonefrito paūmėjimo.

Su tuberkulino tuberkulino tyrimo sąlygomis nustatoma haptoglobino ir malono dialdehido koncentracija kraujyje su moterų lytinių organų tuberkulioze. Po oda švirkščiamas tuberkulinas 50 TE dozėje ir po 72 valandų atliktas antrasis biocheminis tyrimas. Tuberkuliozės etiologijos atveju haptoglobino koncentracijos padidėjimo laipsnis yra ne mažesnis kaip 28%, o malondialdehido lygis yra 39% ar didesnis. Taip pat naudojamas adenozino deaminazės aktyvumas peritoninėje sistemoje, gautame iš Douglaso erdvės. Punktas pakartotinai apžiūrimas praėjus 72 valandoms po tuberkulino intraderminės injekcijos 0,1 TE ir 0,01 TE dozėmis į vidinių lytinių organų projekciją priekinėje pilvo sienelėje. Palaikant tuberkuliozės procesą, adenozino deaminazės aktyvumas padidėja 10% ar daugiau palyginus su pradine.

Kai akis paveikta, tiriama židinio reakcija, kuri atsiranda akyje, reaguojant į antigeninę stimuliaciją. Nepageidaujama išsivystyti ryškus atsakas kartu su regimųjų funkcijų sumažėjimu. Kadangi minimalių židinių reakcijų vertinimas dažnai yra sunkus, išvados objektyvumui rekomenduojama orientuotis lygiagrečiai ir haptoglobino ar adenozino deaminazės kraujo serume augimo laipsniu.

Visi biocheminiai tyrimai turėtų būti atliekami kartu su kitais metodais.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]

Kraujo krešėjimo sistemos tyrimai

Aktualumas mokslinių tyrimų būklę kraujo krešėjimo sistemos TB sukelia A sergančių pacientų plaučių tuberkuliozės skrepliavimas krauju ar kraujavimas iš plaučių, taip pat hemocoagulation komplikacijų chirurginio gydymo tuberkuliozės skaičius akivaizdoje. Be to, latentinis intravaskulinės hemokoaguliacijos srautas, kuris natūraliai serga tuberkulioze, veikia ligos eigą ir chemoterapijos veiksmingumą.

Pacientams, sergantiems plaučių tuberkuliozės paplitimo eksudacinė uždegimas komponento stebėtą mažėja kraujo antikoaguliantų veiklos. Pacientams, sergantiems mažai išplitusios konkretaus pažeidimo plaučiuose su Produktyvių hemocoagulation intravaskulinės uždegiminį komponentą vyrauja silpnai išreikštas. Pacientams, sergantiems plaučių tuberkulioze su hemoptysis ir plaučių hemoragija valstybinės kraujo krešėjimo sistemos yra skirtingos: pacientams, sergantiems mažo kraujo netekimas yra vienodame aukštyje gemoptoe arba iš karto po jo nutraukimo yra staigus kraujo krešėjimo gebėjimą dėl sunkių intensyvinimo trombinoobrazovaniya išlaikant padid ÷ jo "struktūrinę" krešėjimą. Pacientams, sergantiems masyvi kraujo netekimo stebimas sumažėjimas krešėjimo ties mažinant fibrinogeno koncentracija sąskaita. XIII faktoriaus aktyvumas, trombocitų skaičius. Ne chirurginio gydymo etape pacientams, sergantiems ribotų formų plaučių tuberkuliozės su dideliais pažeidimų sistema homeostazės įvyksta. Pacientai, kurių plačiai procesą su pnevmon- arba plevropnevmonektomii vykdymo dažnai plėtoti DIC, kuri gali imtis formos "antros ligos."

Stebėti kraujo krešėjimo būklę pacientų su plaučių tuberkuliozės turėtų būti atliekamas nustatymo dalinio aktyvuoto tromboplastino laiko (DATL), fibrinogeno, trombino laikas, protrombino indeksą ir kraujavimo laikas ir krešėjimo laiką.

[38], [39], [40], [41], [42], [43]

Hormoniniai tyrimai

Šiuolaikiniai eksperimentiniai ir klinikiniai stebėjimai rodo, kad yra specifinių tuberkuliozinio plaučių uždegimo hormoninio būklės pokyčių. Jis įrodė, kad disfunkcija hipofizės-antinksčių, hipofizės skydliaukės sistemų ir kasos funkcija kartu su gydymo anti-TB korekcija prisidėti prie aktyvavimo fibrogenezėje ir remontui ne locus konkretaus uždegimas.

Funkcinės būklės hipofizės-skydliaukės sistemos yra įvertinant pagal kraujo serume trijodtironino (T turinio ₃ ), tiroksino (T ₄ ), hipofizės skydliaukę stimuliuojančio hormono (TSH). Buvo nustatyta, kad slaptasis hipotireozė aptinkama 38-45% pacientų, sergančių plaučių tuberkulioze, ir dažniausiai tai yra diagnozuotas išplitusia ir Fibro-duslūs formų procesą. Tomis pačiomis formomis dauguma žymiai sumažintas lygiai tiek T ₃ ir T ₄, ir tada atvyksta šių hormonų disbalanso didinant T santykį formos ₄ / T _-ų.

Antinksčių funkcija yra vertinamas pagal kortizolio lygio kraujo serume, ir endokrininės kasos funkciją - koncentracija imuno-reaktyvaus insulino. Ūminėje infekcinės ligos fazėje padidėja endogeninio kortizolio ir insulino poreikis. Hiperinsulinemija taip pat liudija kūno audinių atsparumą insulinui, būdingą bet kokiam aktyviam uždegiminiam procesui, ypač specifiniam. Nustatymas glyukokortiko idnoy-antinksčių funkcija su aktyviu plaučių tuberkuliozės atskleidžia Cushing buvimą daugumai pacientų. Normalus kortizolio koncentracija kraujyje paciento su infekcinių uždegimo ūminiu laikotarpiu turėtų būti laikoma santykinės nesėkmės gliukokortikoidų funkcija antinksčių žievės, kuri gali tarnauti kaip turintis dozės vartoti tinkamą pakeitimo terapija gliukokortikoidais pagrindu.

Beveik trečdalis pacientų, sergančių plaučių tuberkulioze, gali nustatyti, kad jų insulinsemijos lygis yra gana žemas ir artėja prie apatinės normos ribos, o 13-20% stebimas reikšmingas hiperinsulinizmas. Tiek santykinis hipoglikemijos, tiek hiperinsulinizmas yra didelės rizikos veiksniai, dėl kurių įvairaus laipsnio angliavandenių apykaitos sutrikimai. Šie kasos B ląstelių funkcinės veiklos pokyčiai reikalauja reguliariai stebėti glikemiją pacientams, sergantiems tuberkulioze, ir laiku užtikrinti cukrinio diabeto prevenciją. Be to. Tai yra papildomas pateisinimas, ar tikslinga naudoti fiziologines insulino dozes sudėtingoje tuberkuliozės gydymo metu.

Apskritai, žemesnių lygių skydliaukės hormonai ir jų disbalanso hypercortisolemia ir hyperinsulinism didžiausią nepasiekiamoje pacientams, sergantiems sunkia eiga tuberkuliozės procesas, turintis didelę plaučių pažeidimų ir sunkių tuberkuliozės simptomai intoksikacijos.

Mikrobiologinė tuberkuliozės diagnozė

Mikrobiologiniai tyrimai reikalingi pacientams, sergantiems tuberkulioze, patikrinimo diagnozei, stebėsenai ir chemoterapijos korekcijos vertinant gydymo rezultatus, kitaip tariant identifikavimo, nuo paciento tuberkuliozės registravimo prieš išimdami jį iš registro.

Visos epidemiologinės programos ir projektai remiasi bakterijų ekskrementų skaičiaus įvertinimu, kuris negali būti atliekamas nenaudojant laboratorinių metodų mikobakterijų tuberkuliozei nustatyti. Tyrime vadinamųjų neorganizuotų gyventojų bakterijų įsibrovėlių procentas siekia 70 ar daugiau, todėl laboratorijos metodai yra pakankamai veiksminga priemonė identifikuoti tuberkuliozės pacientus iš šios populiacijos grupės.

Tradiciniai tuberkuliozės diagnozavimo mikrobiologiniai metodai yra bakteroskopijos ir kultūros tyrimai. Šiuolaikiniai metodai mano, kad mikobakterijos tuberkuliozės auginimas automatizuotose sistemose, nustatant PGR. Tačiau visi šie metodai būtinai derinami su klasikiniais bakteriologiniais metodais.

Diagnostikos medžiagos rinkinys

Laboratorinių tyrimų efektyvumas labai priklauso nuo diagnostinės medžiagos kokybės. Atitiktis diagnostinės medžiagos surinkimo, laikymo ir transportavimo taisyklėms ir tiksliam paciento vertinimo algoritmo įgyvendinimui turi tiesioginės įtakos rezultatams ir užtikrina biologinį saugumą.

Bandant tuberkuliozę, naudojamos įvairios medžiagos. Atsižvelgiant į tai, kad TB logkih- labiausiai paplitusi forma tuberkuliozės pakitimai, pagrindinė medžiaga tyrimų apsvarstyti skreplių ir kitų rūšių nuimamais tracheobronchial: viršutinių kvėpavimo takų išskyros, gautus po aerozolių įkv ÷ pus: bronchų nuplovimas; bronchoalveolinis skalavimas; medžiaga gaunama bronchologija ir plaučius transtracheal biopsijos iš bronchų aspiratų, gerklų tamponai, eksudato iš žaizdų ir tepinėlius al.

Tyrimo veiksmingumas padidėja, jei atliekamas kontroliuojamas paciento surinkimas iš medžiagos. Tam skiriamas specialiai įrengtas kambarys arba perkamos specialios kabinos. Medžiagų surinkimas yra pavojinga procedūra, todėl būtina rinkti medžiagą moksliniams tyrimams, laikantis infekcinio saugumo taisyklių.

Mycobacterium tuberculosis tyrimo medžiaga surenkama steriliuose buteliuose su sandariai įsukamais dangteliais, kad būtų užkirstas kelias aplinkos taršai ir apsaugota surinkta medžiaga nuo užteršimo.

Diagnostinės medžiagos surinkimo buteliukai turi atitikti šiuos reikalavimus:

• turi būti pagaminti iš smūgiui atsparios medžiagos;
• turėtų automatiškai išsilygsti autoklave;
• pakankamo kiekio (40-50 ml):
• turėti plačią atvartą riebalų rinkimui (skersmuo ne mažesnis kaip 30 mm);
• būti lengva tvarkyti, skaidrus ar permatomas, kad galėtumėte įvertinti surinkto mėginio kiekį ir kokybę atverdami dangtį.

Norint gauti optimalius tyrimų rezultatus, turi būti laikomasi šių sąlygų:

• Rinkti medžiagą prieš pradedant chemoterapiją;
• tyrimo medžiaga turi būti renkama iki rytojaus vartojimo maisto ir vaistų;
• moksliniams tyrimams pageidautina surinkti ne mažiau kaip 3 rytinio skreplius. Surinkti skreplius 3 dienas iš eilės;
• surinkta medžiaga turi būti kuo greičiau pristatyta laboratorijai:
• tuo atveju, kai iš karto neįmanoma medžiagą pristatyti į laboratoriją, ji laikoma šaldytuve esant oro temperatūrai 4 ° C ne ilgiau kaip 48 valandas;
• Transportuodami medžiagą, būtina atidžiai stebėti buteliukų vientisumą.

Teisingai surinkta skrepliacija yra gleivinės arba gleivinės. Optimalus ištirto skrandžio kiekis yra 3-5 ml.

Skrepliai renkami prižiūrint gydytojui. Asmenys, atsakingi už skreplių rinkimą, turėtų laikytis tam tikrų taisyklių įgyvendinimo:

• būtina paaiškinti pacientui tyrimo tikslą ir būtinybę neuždengti seilių ar nagų gleivių, bet giliųjų kvėpavimo takų turinį. Tai gali būti pasiekta dėl produktyvaus kosulio, kuris įvyksta po kelių (2-3) gilių įkvėpimų. Taip pat būtina įspėti pacientą, kad jis turėtų nuplauti burną vandeniu, pašalinti pagrindinę mikrofloros dalį, augančią burnos ertmę ir maisto likučius, kurie trukdo tyrinėti skreplių;
• medicinos darbuotojas, dalyvaujantis riebalų surinkime, be chalatą ir skrybėlę, privalo dėvėti kaukę, gumines pirštines ir gumos prijuostę;
• stovi už paciento, rekomenduojama išlaikyti butelį kuo arčiau jo lūpų ir iš karto atskirti jam skreplių skrepliai, nes ji, todėl būtina numatyti, kad oro srautas nukreipiamas nuo sveikatos priežiūros paslaugų teikėjas:
• Užbaigus riebalų rinkimą, sveikatos priežiūros darbuotojas atsargiai uždarė buteliuką dangčiu ir įvertinti surinkto skrepliaus kiekį ir kokybę. Tada butelis yra paženklintas etiketėmis ir dedamas į specialų biksą, skirtą transportuoti į laboratoriją.

Jei pacientas negamina skreplius, naktį prieš ir anksti ryte dėl surinkimo medžiagos būtina suteikti jam atsikosėjimą :. Kurioje pateikiamas Marshmallow (mukaltin), bromheksinas, ambroksolio, ir tt šaknų ekstraktas dieną - ar taikyti dirgina įkvėpti naudojant įrangą įdiegta į kambarį rinkti skreplius Tokiu būdu surinkta medžiaga nėra saugoma ir turėtų būti ištirta surinkimo dieną. Siekiant išvengti "išpūtimo" laboratorijoje kryptimi turėtų būti specialus ženklas.

Jei šioje vietoje mikrobiologiniai tyrimai nevykdomi, surinkta diagnostinė medžiaga turėtų būti centralizuotai pristatyta į laboratoriją, su sąlyga, kad medžiaga laikoma tarp šaldytuvo pristatymų arba konservantų. Transportavimo dėžėse pristatykite medžiagą į laboratoriją, kurią galima lengvai dezinfekuoti. Kiekviename pavyzdyje turi būti atitinkama etiketė, o visa partija turėtų būti užpildyta kartu pateikiama forma.

[44], [45], [46], [47]

Pacientų tyrimo būdai ir dažnumas

Pradiniame, vadinamojoje diagnostikoje, tiriant pacientą tuberkuliozei, būtina 2 ar 3 dienas ištirti mažiausiai 3 skreplių porcijas. Surinkti prižiūrint medicinos personalui, kuris padidina mikroskopijos efektyvumą.

Pirminį tuberkuliozės patikrinimą turėtų atlikti visos sveikatos priežiūros sistemos medicinos diagnostikos įstaigos. Neseniai, siekiant pagerinti pradinio tyrimo efektyvumą, buvo organizuoti vadinamieji mikroskopijos centrai, kuriuose įrengti šiuolaikiniai mikroskopai ir įranga epidemijos saugai.

Anti-TB priemonėse naudojamas atrankinis testas, kurio metu krūtinės tyrimas arba kita diagnostinė medžiaga yra mažiausiai 3 kartus per 3 dienas. Gydymo metu mikrobiologiniai tyrimai reguliariai atliekami bent kartą per mėnesį intensyvios chemoterapijos fazėje. Pereinant prie gydymo fazės, tyrimai atliekami rečiau - su 2-3 mėnesių intervalu, o tyrimo dažnumas sumažėja iki dviejų.

Neutraliosios tuberkuliozės diagnostinės medžiagos rinkimo ypatumai

Žanras patologinę medžiagą su ekstrapulmonine formų TB - Mycobacterium tuberculosis mažos koncentracijos jame, kuris reikalauja daugiau jautrių metodų mikrobiologinių tyrimų, visų pirma apie sėja būdai terpėje.

Urogenitalinės sistemos tuberkulioze šlapimas yra labiausiai prieinama studijų medžiaga. Šlapimo surinkimą turėtų atlikti specialiai parengta slaugytoja.

Išorinės genitalijos plaunamos vandeniu su muilu arba silpnu kalio permanganato tirpalu. Išorinė šlaplės atidarymo vieta yra kruopščiai apdorojama. Steriliu buteliuku renkama vidutinė ryto šlapimo dalis: vyrams, žinoma, moterims, naudojant kateterį. Šlapimas iš inkstų dubens surenkamas steriliuose vamzdeliuose, kuriuose yra viena ar dvi inkstes, o pastaruoju atveju - būtinai atskirai nuo kiekvieno inksto. Nedidelis šio šlapimo kiekis yra centrifuguojamas, tiriamos nuosėdos.

Vyrams, spermatozoidams, puncetiniams mielėms, prostatos paslaptis yra centrifuguojama, kad susidarytų nuosėdos. Prostatos masažas gali paskatinti išskirtų sekų, turinčių mikobakterijos tuberkuliozę, sekreciją, kai vyrai patiria specifinį genitalijų srities procesą.

Moterų menstruacinis kraujas surenkamas čiupdamas arba naudojant "Kafka" dangtelį. Gauta medžiaga išsiskiria iš raudonųjų kraujo kūnelių, plaunama distiliuotu vandeniu, po to centrifuguojama. Nagrinėjamas nuosėdos.

Iš gimdos kaklelio kanalo paskirstomos kai kurios Kafka talpos ar dangtelio, ty pageidautina kauptis 1-2 ml patologinės medžiagos.

Medžiaga, gaunama operatyviai intervencuojant inkstus, genitalijas. Su biopsija, išmetimas iš endometriumo, homogenizavimas. Norėdami tai padaryti, jis dedamas į sterilų skiedinį ir kruopščiai susmulkinamas steriliomis žirklėmis. Į šį srutų buvo įtraukta sterilų upės smėlio, kurio kiekis yra lygus savo svorio, ir tada pripildyti 0,5-1.0 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo, ir viskas buvo trinama tol, kol klampios masės su izotoninio natrio chlorido tirpalo (4-5 ml) Be to. Tada masė leidžiama nusistoti 1-1,5 minutės, supernatantas tiriamas.

Kaulų ir sąnarių tuberkuliozė. Piktatas (abscesų pusė), gautas steriliu švirkštu, dedamas į sterilius indus ir nedelsiant pristatomas į laboratoriją. Sterilus pipetą, anksčiau sudrėkintą steriliu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, paimkite 2-5 ml pusės, perkelkite į granulių butelį ir įpilkite dar 2-3 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo. Butelis uždarytas kamščiu ir 8-10 minučių sukrėstas šokėjos aparatu. Nagrinėjama homogenizuota suspensija.

Fistulinėse osteoartikuliarinės tuberkuliozės formose randamas pūslė nuo fistulės. Labai didelė iškrovimo jėga paimama tiesiai į mėgintuvėlį. Jei trūksta pusės, fistulas praplaunamas steriliu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, o tyrimo metu nuskalaamas bandymo mėgintuvėlyje ar tampono įmirkytas pusės gabalas.

Chirurginės medžiagos, gautos chirurginės intervencijos kaulų ir sąnarių metu, gali sudaryti iš žaizdos-nekrozės masės, granuliacijos, rando audinio, kaulinio audinio, sinovijos membranos audinio ir kitų substratų. Jo gydymas atliekamas, kaip ir inkstų tuberkuliozė.

Mikroskopinis sinovijų skysčio tyrimas 3% natrio citrato tirpale (1: 1 santykis), siekiant išvengti koaguliacijos, atliekamas iškart po punkcijos.

Limfmazgių tuberkuliozė. Taip pat išnagrinėta pusė, išgaunama per limfmazgių punkciją. Kaip pusės abscesų. Tirti limfmazgių audiniai, gauti per chirurgines intervencijas, biopsijas, kaip ir su kitomis tuberkuliozės formomis.

Tyrimas dėl išmatų masės dėl mycobacterium tuberculosis yra labai retas dėl beveik visiško teigiamų rezultatų trūkumo.

[48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Mycobacterium mikroskopija

Skreplių mikroskopija yra gana greitas, paprastas ir nebrangus metodas, kuris turėtų būti taikomas visais atvejais, kai įtariama tuberkulioze. Be to, šis tyrimas atliekamas siekiant įvertinti chemoterapijos veiksmingumą ir nustatyti, ar gydymas yra nesėkmingas, jei nėra kultūrinio tyrimo.

Naudojami du mikroskopinio tyrimo metodai:

• tiesioginės mikroskopijos metodas, kai tepinėlis yra pagamintas tiesiai iš diagnostinės medžiagos;
• nuosėdų, pagamintų iš dezaktyvuojančios apdorotos kultūros medžiagos, mikroskopijos metodas.

Pirmasis metodas naudojamas tose laboratorijose, kuriose atliekami tik mikroskopiniai tyrimai (bendrosios medicinos tinklo klinikinės ir diagnostikos laboratorijos).

Geriausi mikroskopinio tyrimo rezultatai gaunami koncentruojant diagnostinę medžiagą (pvz., Centrifuguojant).

Atliekant mikroskopiją, 1 ml skreplių turi būti daugiau kaip 5000 mikrobų ląstelių, kad būtų galima nustatyti 50% tikimybę mycobacterium tuberculosis. Plaučių tuberkuliozės formų pacientų skrepliai paprastai yra daug rūgščiai atsparių bakterijų, todėl jas galima patikimai nustatyti bakterioskopija. Šio metodo diagnostinis jautrumas gali būti patobulintas, tiriant kelis vieno paciento skreplių mėginius. Neigiamas bakteroskopinio tyrimo rezultatas neatmeta tuberkuliozės diagnozės, nes kai kurių pacientų skrepliai turi mažiau mikobakterijų nei galima nustatyti mikroskopu. Blogas riebalo tepalo paruošimas taip pat gali sukelti neigiamą bakteroskopinio tyrimo rezultatą.

Labiausiai paplitęs riebalų rūgščių mikobakterijų aptikimo būdas tepinėjant yra pagal Ciol-Nelsen spalvą. Šis metodas pagrįstas karbolio fuksino į mikrobų ląstelę įsiskverbimu per membraną, kurioje yra vaško lipidų sluoksnis, tuo pačiu metu kaitinant ir stipriai paveikus fenolį. Tolesnis tepalo spalvos pasikeitimas su 25% sieros rūgšties arba 3% druskos rūgšties tirpalu lemia spalvos pasikeitimą visose rūgštingose struktūrose. Išblukę tepalo elementai dažomi 0,3% metileno mėlynojo tirpalo. Mikobakterijos nesuvokia įprastų anilino dažų, dėl kurių rūgštingos mikobakterijos dažomos tamsiai raudonos spalvos, o kiti mikrobai ir ląstelių elementai - mėlyni.

Už tepinėliais sutepa Cylio-Nelsenu naudoti šviesos abiakį mikroskopą su imersijos alyvos objektyvo (90- arba 100 kartų išaugo) ir okuliaro į 7- arba 10 kartų priartinimas. Ištirkite 100 regos laukų, kurių pakanka nustatyti, kad atsirastų vienos mikobakterijos tepiniuose. Jei tokio tyrimo rezultatas yra neigiamas, patvirtinimui rekomenduojama peržiūrėti dar 200 regos laukų. Įrašykite rezultatus, nurodydami aptiktų rūgščiųjų bacilų (KUM) skaičių.

Be šios technikos, fluorescenai naudojami fluizuojančiai mikroskopijai, todėl galima pasiekti geriausius rezultatus. Naudojant šį metodą mikroskopijos efektyvumas padidėja 10-15%. Gydant mikobakterijas su liuminescenciniais dažais (auraminu, rodaminu ir kt.), Šios medžiagos taip pat jungiasi prie vaško tipo mikrobų ląstelių struktūrų. Kai apšviestas spalvotas ląsteles su įdomiu šviesos šaltiniu (tam tikru ultravioletinių spindulių spektru), jie pradeda švyti ant oranžinės arba ryškios raudonos šviesos ant juodo ar tamsiai žaliojo fono. Dėl matomo vaizdo didelio ryškumo ir kontrasto bendras mikroskopo padidinimas gali būti sumažintas 4-10 kartų, matymo laukas plečiasi ir preparato žiūrėjimo laikas mažėja. Be to, dėl daug didesnio lauko gylio galite padidinti tyrimo komfortą.

Jei toje pačioje srityje yra naudojama fluorescencijos mikroskopija, įtrūkimai praleidžia gerokai mažiau laiko, nei naudojant šviesos mikroskopą "Tsiol-Nelsen" dažymas. Jei darbo dienai mikroskopas tiria maždaug 20-25 tokius tepinatus, tada fluorescencijos mikroskopijos pagalba jis gali ištirti daugiau kaip 60-80 mėginių tuo pačiu metu. Patyrę mikroskopai žino, kad ląstelių spalva su auramino ir rodamino mišiniu tam tikra prasme yra būdinga rūgštiniams bacilams, kuri šiuo atveju atrodo kaip auksinės lazdos. Saprofitai dažomi žalsvai spalvos.

Kitas svarbus privalumas iš fluorescencinio mikroskopijos metodu - gebėjimas aptikti pakitusi mikobakterijų, neteko prie nepalankių veiksnių, įskaitant intensyvios chemoterapijos, kislotousotoychivosti nuosavybė ir negali aptikti su šiuo dažymo Ziehl-Nelsenu įtakos.

Fluorescencijos mikroskopijos metodo trūkumai apima palyginti didelę mikroskopo kainą ir jos veikimą. Tačiau centralizuotose arba kitose didelėse laboratorijose, kai apkrova viršija 3 laboratorijos technikų, dirbančių su trim tradiciniais mikroskopais, normą, pigiau naudoti vieną fluorescuojantį mikroskopą.

Bakterioskopiniai metodai turi gana aukštą specifiškumą (89-100%). Apie 97% teigiamų rezultatų, gautų naudojant bet kurį mikroskopijos metodą, vienareikšmiškai patvirtina sėjos rezultatai.

Reikėtų pažymėti, kad, kai mikroskopiškai tiriant patologinės medžiagos tepinėlį, neįmanoma nustatyti rūšies, kuriai būdinga nustatyta greita mikobakterija. Mikroskopija metodas leidžia pateikti nuomonę tik dėl buvimo ar nebuvimo rūgšties mikroorganizmų preparato, kuris gali būti paaiškinti egzistavimo pobūdį daug morfologiškai panašus į tuberkuliozės mikobakterijų sudėtingų nontubercular rūgšties atsparių mikroorganizmų.

Mikroskopijos rezultatai vertinami pusiau kiekybiniuose vienetuose.

Norint palyginti skirtingų mikroskopijos metodų rezultatus, pateikiami empiriniai koeficientai. Pavyzdžiui, palyginti tepinėliais dažytų su liuminescencinių dažų rezultatus, duomenų tyrimas šviesos mikroskopu (1000 kartų priartinimas), būtina padalinti rūgšties atsparių bakterijų aptiktą fluorescencijos mikroskopu skaičių, atitinkamas koeficientas 250 kartų priartinimas - iki 10, 450 kartų - iki 4, iš 630 kartų - iki 2.

Išskirtinės tuberkuliozės mikroskopijos ypatumai

Tiesioginė mikroskopija atliekama, taip pat po sodrinimo paruoštų tepinėlių mikroskopija, po to užtepami Tsiol-Nelsen dažikliai arba liuminescenciniai dažai. Tiesioginė tepinėlis mikroskopija yra neveiksminga dėl mažos mikobakterijų koncentracijos medžiagoje, todėl racionaliau naudoti sodrinimo metodus. Veiksmingiausias yra centrifugavimas. Jei biologinė medžiaga yra klampus, centrifugavimas yra taikomas su tuo pat metu suskystinimo ir homogenizavimo medžiaga, kuri yra atliekamas naudojant didelio greičio centrifugų su išcentrinės jėgos 3000 g ir hipochlorito sprendimus. Kitų sodrinimo metodų, tokių kaip mikroplastika, šiuo metu nėra naudojami dėl biologiškai pavojingų aerozolių susidarymo.

[58], [59], [60], [61], [62]

Kultūrinis tuberkuliozės diagnozavimo metodas

Sėjimo metodas arba kultūros metodas yra jautresnis nei tepinė mikroskopija, ir turi daug privalumų prieš pastarąjį. Tai leidžia aptikti keliasdešimt perspektyvių mikobakterijų bandymo medžiagoje ir turi didelę diagnostinę vertę. Tai ypač svarbu tiriant medžiagą iš naujai diagnozuotų ar gydytų pacientų, kurie išsiskiria nedidelį kiekį mikobakterijų.

Palyginti su mikroskopu, kultūros tyrimai leidžia padidinti tuberkuliozės sergančių pacientų skaičių, diagnozuotą daugiau kaip 15-25%, taip pat anksčiau nustatytas tuberkuliozės nustatymas, kai liga vis dar gali būti gydoma. Labai svarbus kultūrinio testo pranašumas yra galimybė gauti sužadinimo kultūrą, kurią galima atpažinti ir ištirti atsižvelgiant į jautrumą vaistams, virulentiškumą ir kitas biologines savybes.

Auginimo metodų trūkumai apima jų trukmę (medžiagų laukimo laikas pasiekia 10 savaičių). Didesnė kaina, diagnostinės medžiagos apdorojimo sudėtingumas.

Diagnostikos medžiagos gydymo priėmimo principai

Tyrimų su tuberkulioze metu negalima naudoti įprastų mikrobiologinių metodų. Taip yra dėl to. Kad mikobakterijos tuberkuliozė auga labai lėtai, o daugelyje klinikinių mėginių yra sparčiai augančių pyogeninių ir puvinio mikroorganizmų, grybų. Jų spartus augimas turtingose maistingųjų medžiagų terpėje trukdo mikobakterijų vystymuisi ir neleidžia izoliuoti tuberkuliozės sukėlėjo, todėl prieš sėją diagnostinė medžiaga turi būti paruošta. Be to, mikobakterijos, išsiskiriančios iš paciento kvėpavimo takų, paprastai yra apsuptos dideliu gleivių kiekiu, todėl sunku sutelkti dėmesį. Atsižvelgiant į tai, prieš sodinant skreplių ir kitas panašias medžiagas, jų skystinimas reikalingas dezaktyvacijai.

Visi plovikliai ir dekontaminai turi daugiau ar mažiau ryškų toksinį poveikį mikobakterijoms. Apdorojimo metu gali mirti iki 90% mikobakterijų. Išlaikyti pakankamai iš mikobakterijų gyventojų, nepagailės reikia naudoti apdorojimo metodus, kurie leidžia, viena vertus, siekiant slopinti sparčiai auganti koloretalių bakterijas ir puvėsių, o kita vertus - išsaugoti mikobakterijų esančių medžiagų gyvybingumą.

Priklausomai nuo medžiagos, jos laipsnio homogeniškumo ir taršos išankstinio apdorojimo naudojant įvairius dekontaminuojančią: Skreplių - 4% natrio hidroksido tirpalo, sprendimai trohzameschonnogo natrio fosfato 10%, benzalkonio chlorido, trinatrio fosfato, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteino natrio hidroksidas), kurio galutinė koncentracija yra 1% NaOH, šlapime ir kitų skystų medžiagų - sieros rūgšties tirpalu 3%, dėl užterštų mėginių, riebalų, kurių sudėtyje yra medžiagų - tirpalo oksalo rūgšties iki 5%. Be to, kai kuriais atvejais naudojami fermentai, aktyviosios paviršiaus medžiagos (plovikliai). Taikymo Tween ploviklių ir kai kurių kitų mikobakterijų mirtis lydi mažiau ląstelių (40-50% išgyventi). Tačiau jie gali būti naudojami tik skystoms medžiagoms. Didžiausias pasaulyje pasiskirstymas buvo NALC-NaOH. Pagamintas rinkiniuose. Šis metodas leidžia paskirstyti daugiau nei 85% mikobakterijų ląstelių populiacijos. Sudėtingesni yra audinių turinčių kietųjų medžiagų dezaktyvacija, nes sunku suprasti medžiagos sklaidos laipsnį homogenizavimo proceso metu. Pavyzdžiui, valymo biopsijos limfmazgiai dažnai lydi padidėjęs dažnis užteršimo pašaliniais floros. Šiuo atveju galima naudoti 1% etono.

Nehomogeninė medžiaga homogenizuojama su stiklo karoliukais, esant dezaktyvavimo medžiagoms. Skystos medžiagos iš anksto centrifuguojamos ir apdorojamos tik nuosėdos.

Sėjos ir inkubavimo metodai

Po pirminio apdorojimo medžiaga yra centrifuguojama, tuo būdu nusodinus mikobakterijas ir padidinant jų kiekį nuosėdose ("dumblo praturtėjimas"). Gautos nuosėdos neutralizuojamos ir inokuliuotos (inokuliuotos) su tankiomis maistingųjų medžiagų terpėmis arba mėgintuvėliu su skystu (pusiau skystu) terpiu. Iš likusios nuosėdos tepinėliai paruošiami mikroskopiniam tyrimui. Sėjimo technologija turėtų užkirsti kelią diagnostinės medžiagos kryžminiam užteršimui.

Siekiant patikimos klinikinės mikrobiologinio tyrimo rezultatų interpretavimo, turi būti laikomasi šios taisyklės: mikroskopiniai ir kultūriniai tyrimai turi būti atliekami lygiagrečiai iš to paties diagnostinės medžiagos pavyzdžio.

Inokuliuojami vamzdeliai horizontalioje padėtyje dedami į termostatą 37 ^° C temperatūroje 2 dienas. Tai užtikrina tolygesnę medžiagų įsisavinimą į kultūros terpę. Po 2 dienų vamzdeliai perkeliami į vertikalią padėtį ir hermetiškai užsandarinami gumos arba silikono kištukais, kad būtų išvengta džiovinimo.

Augalai inkubuojami 37 ^apie C 10-12 savaites reguliariai kas savaitę peržiūrai. Kiekvienai peržiūrai registruojami šie parametrai:

• vizualiai stebimas laikotarpis nuo sėjos augimo dienos;
• augimo tempas (CFU skaičius);
• pasėlio užteršimas pašaline mikroorganizmų flora ar grybais (tokie vamzdeliai pašalinami);
• matomas augimo stygius. Vamzdžiai paliekami termostatu tol, kol bus rodomas kitas vaizdas.

Maistingosios medžiagos

Mikobakterijų auginimui naudojamos įvairios maistinės medžiagos; tankus, pusiau skystas, skystis. Tačiau nė viena iš žinomų maistinių medžiagų neturi savybių, kurios užtikrintų visų mikobakterijų ląstelių augimą. Atsižvelgiant į tai, rekomenduojama naudoti 2-3 skirtingos sudėties maistingąsias terpes, kad būtų galima tuo pačiu metu padidinti efektyvumą.

PSO rekomenduoja Levenstein-Jensen aplinką kaip standartinę terpę pirminio tuberkuliozės sukėlėjo izoliavimo ir jos jautrumo vaistui nustatyti. Tai tanki kiaušinių aplinka, kurioje mikobakterijų augimas gaunamas 20-25 dienomis po baktericoziškai teigiamos medžiagos sėjos. Bakterektografiškai neigiamos medžiagos augalai reikalauja ilgesnio inkubacinio laikotarpio (iki 10-12 savaičių).

Mūsų šalyje siūloma E.R. Finn kiaušinių aplinka Finn-II. Tai skiriasi tuo, kad vietoj L-asparagino jis naudoja natrio glutamatą, kuris skatina kitus būdus sintetinti mikobakterijų aminorūgštis. Augimas šiai terpei pasirodė šiek tiek anksčiau, o mikobakterijų pasiskirstymo dažnis yra 6-8% didesnis nei Lowenstein-Jensen terpėje.

Siekiant pagerinti ekstrapolinės tuberkuliozės bakteriologinės diagnostikos veiksmingumą, patartina įtraukti modifikuotą "Finn-II" terpę į maistinių medžiagų terpę. Siekiant paspartinti augimą, į Finn-II maistingą terpę papildomai dedamas 0,05% natrio tioglikolato, kuris sumažina deguonies koncentraciją. Siekiant apsaugoti fermentą iš Mycobacterium sistemų toksinių produktų lipidų peroksidacijos maistinėje vidutinės Finn-II vartojamas antioksidantas α-tokoferolio acetato nuo 0,001 mikrogramų / ml koncentracijai. Diagnostikos medžiagos sėklos atliekamos pagal standartinę procedūrą.

Rusijos anti-tuberkuliozės laboratorijose taip pat naudojami kiti tankio maistingųjų medžiagų terpės modifikacijos; pasiūlė G. G. Mordovijos maistinių medžiagų terpė "Naujas", sukurta V.A. Anicic maistingųjų medžiagų laikmenos A-6 ir A-9 ir tt

Atsižvelgiant į tai, kad chemoterapijos procesas žalą įvairių metabolinių sistemų mikrobų ląstelių, kai mikobakterijų gyventojų praranda gebėjimą normaliai vystytis tradicinėse maitinamosios terpės ir reikalauja osmotiškai subalansuotą (arba pusiau skystos) terpės.

Diagnostikos medžiagos sėklų rezultatų įvertinimas ir registravimas

Kai kurie mikobakterijų štamai ir rūšys auga lėtai, augimas gali atsirasti net iki 90-osios dienos. Tokių pasėlių skaičius yra nedidelis, tačiau tai leidžia išlaikyti pasėlius termostatu 2,5-3 mėnesius.

Virulentinės mycobacterium tuberculosis kultūros paprastai auga tankioje kiaušinėlių aplinkoje, įvairaus dydžio ir rūšies R formos kolonijose. Kolonijos sausos, raukšlėtos, dramblio kaulo, šiek tiek pigmentuotos. Kitose terpėse mikobakterijos tuberkuliozės kolonija gali būti drėgnesnė. Po chemoterapijos ar gydymo metu gali būti skiriamos sklandžios kolonijos su drėgnu augimu (S formos).

Kai izoliuoja pasėlius, naudojamas specialių tyrimų rinkinys, skirtas išskirti mycobacterium tuberculosis nuo ne tuberkuliozės mikobakterijų ir rūgščiai atsparių saprofitų.

Teigiamas atsakas pateikiamas po privalomos mikroskopinės spalvotosios Tsiol-Nelseno tepinėlių išaugintų kolonijų tyrimo. Į augimo mikobakterijų į dėmę atveju aptikti ryškiai raudonos lazdos gulėti atskirai arba grupėmis, formavimo sankaupas į veltinio arba apvijų forma. Jaunų kultūrų, ypač, išskirtų iš ilgalaikio gydymo pacientams, sergantiems chemoterapija, mikobakterijos skiriasi išreikštą polimorfizmas, iki buvimo strypo formos, kartu su trumpais, beveik coccoid arba pailgos versijų, kad panašūs grybiena.

Mikobakterijų augimo greitis nustatomas pagal šią schemą: (+) - 1-20 ksv in vitro (trūksta bakterijų išsiskyrimo); (++) - 20-100 CFU in vitro (vidutinio bakterijų išsiskyrimo); (+++) -> 100 CFU in vitro (gausu bakterijų išsiskyrimu). Tuberkuliozės laboratorinėje diagnozėje nepakanka atsakyti, ar mikobakterija nustatoma vienu ar kitu būdu. Turėti išsamų supratimą apie mikobakterijų populiacijos mastą ir pobūdį, jo sudėtį ir savybes. Būtent šie duomenys leidžia mums teisingai suprasti proceso būklę, suplanuoti taktiką ir laiku ištaisyti gydymą.

Pastaraisiais metais paspartėjo mikobakterijų augimas, agaro pagrindu pagamintos maistingųjų medžiagų terpės su įvairiais augimo priedais ir specialaus dujų mišinio naudojimas. Norint gauti mikobakterijų augimą šiuose terpėse auginimo metu sukurta atmosfera su dideliu kiekiu anglies dioksido (4-7%). Šiuo tikslu naudojami specialūs CO ₂ inkubatoriai. Tačiau labiausiai išvystytos automatizuotos mikobakterijų auginimo sistemos: MGIT-BACTEC-960 ir MB / Bact.

Vienas tokios sistemos - MGIT sistema (mikobakterijų augimo nurodant vamzdelis), kuris reiškia, kad aukštųjų technologijų plėtrai ir yra skirtas greitam bakteriologinio diagnozuoti tuberkuliozei ir Mycobacterium jautrumo pirmos eilės vaistais, o kai antros eilės vaistų. MGIT sutelkia dėmesį į tai, kaip naudoti "VASTES-960" įrenginį. Mikroorganizmai auginami specialiose mėgintuvėse su skystu maistiniu terpiu, paremtu modifikuotu Middlebrook-7H9 terpėje. Siekiant skatinti mikobakterijų augimą ir pašalinti pašalinės mikrofloros augimą, naudojamas MGIT augimo papildas ir PANTA antibakterinių vaistų mišinys.

Mikroorganizmų augimas įrašomas optiškai. Jis yra pagrįstas fluorescencija, kuri atsiranda, kai augimo metu mikobakterijos sunaudoja deguonį. Iš deguonies priklausomas fluorochrominis dažiklis yra specialaus mėgintuvėlio apačioje ir padengtas silikono sluoksniu. Reprodukcijos mikobakterijos veda prie deguonies kiekis vamzdelyje mažėjimo ir sumažinti koncentraciją, kuri sukelia padidėja fluorescencija, kuris tampa matomas apšvitinamas ultravioletiniais spinduliais vamzdžių ir automatiškai užregistruotas fotosensorius įmontuotą prietaisų VASTES-960. Luminescencijos intensyvumas užregistruojamas augimo vienetais (GU augimo vienetai). Augimo duomenys įrašomi kompiuteryje, kur juos galima automatiškai išsaugoti. Kompiuterių analizė augimo kreivių gali suteikti informacijos apie iš Mycobacterium baseinai įvairovė, įskaitant nontubercular buvimą, o taip pat padeda įvertinti augimo savybes mikobakterijų.

Įvedus tokias sistemas, mikobakterijų augimo laikas žymiai sumažėjo, vidutiniškai 11 dienų VASTES-960 ir 19 dienų MB / Bact lyginant su 33 dienomis standartinėje tankioje maistinėje terpėje. Reikėtų pažymėti, kad šioms sistemoms reikalingas aukštos kvalifikacijos personalas. Medžiagos sėjos į skystą terpę būtinai lydės sėjos į Levenstein-Jensen terpę, kuri atlieka rezervinį vaidmenį tais atvejais, kai mycobacterium tuberculosis nesukelia kitokios terpės.

[63], [64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71]

Mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymas

Mikobakterijų spektras ir jautrumo nustatymas kovos su tuberkulioze vaistais yra labai kliniškai svarbūs, taip pat epidemiologinis tuberkuliozės plitimo ir atsparumo vaistams įvertinimas. Be to, atsparumo vaistams stebėsena leidžia įvertinti visos tuberkuliozės programos veiksmingumą, nes tai yra integralus visų kovos su tuberkuliozės veiklos komponentų rodikliais rodiklis.

Daugialypis ir laiko jautrumas vaistams:

• prieš gydymo pradžią, kad nustatytumėte gydymo strategiją ir taktiką:
• kai izoliuotas nuo įvairių medžiagų (skreplių, BAL skysčių, šlapimo, eksudatų, skysčių ir kt.) ligų, tiriamos visos izoliuotos padermės:
• intensyvios gydymo fazės pabaigoje, nesant klinikinei ir radiologinei dinamikai:
• jei būtina keisti gydymo tvarką šiais atvejais:
  • skreplių tepinėlių nebuvimas;
  • kultūros atkūrimas po nešvarumų tepimo;
  • drastiškas CMU skaičiaus padidėjimas tamponu po pradinio nuosmukio. Gerai žinoma, kad tuberkulioze sergančio paciento medžiaga izoliuota nuo mikobakterijos tuberkuliozės padermių, kurios yra nevienalytės pagal jautrumą vaistams. Štamų jautrumas anti-tuberkulioziniams vaistams gali skirtis priklausomai nuo vaistų spektro, laipsnio, dažnumo ir atsparumo pasireiškimo dažnumo.

Atsparumo Mycobacterium tuberculosis narkotikų laipsnis buvo nustatomas pagal nustatytus kriterijus, kurie yra sutelktas į klinikinę reikšmę ir stabilumo priklauso nuo anti-TB narkotikų, jo farmakokinetikos, į pažeidimo koncentracijos veikla. Didžiausia terapinė dozė ir pan.

Mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymas šiuo metu atliekamas mikrobiologiniais metodais:

• Absoliučios koncentracijos (skiedimo metodas tankiose arba skystose maistinėse terpėse),
• proporcijos
• atsparumo koeficientas.

Paprastai stabilumas pasireiškia kaip vizualiai pastebimų kolonijos augimo Mycobacterium tuberculosis, tačiau yra būdų, kad sukelti ankstyvuoju augimo dalijant ląstelių Mycobacterium į spalvinę reakciją forma. Šie metodai sutrumpina bandymo laiką nuo 3-4 iki 2 savaičių.

Kaip suvienija Rusijoje buvo pratęstas, rekomenduojama PSO komiteto chemoterapijos metodas absoliučių koncentracijos, kuri yra iš metodiniu požiūriu, yra paprastas, bet jis reikalauja didelio tikslumo ir standartizavimą laboratorinių procedūrų. Vaisto jautrumo tyrimas susideda iš mėgintuvėlių, turinčių maistingą terpę, modifikuotą anti-TB vaistais. Nustatytas susideda iš 2-3 vamzdžių su skirtingų koncentracijų kiekviena iš narkotikų naudojamas, viena kontrolės mėgintuvėlius be vaisto į aplinką ir vienas vamzdelis, kuriame 1000 mcg / ml natrio Sali tsilovokislogo arba 500 ug / ml paranitrobenzoynoy rūgšties nontubercular aptikti mikobakterijų augimui.

Norėdami paruošti žiniasklaidos su preparatais rinkinį, naudojama Modified Levenstein-Jensen terpė (be krakmolo), kuri pilama į kolbas. Kiekvienoje kolboje pridedamas tam tikras atitinkamo prieštuberkuliozinio preparato praskiedimo tūris. Kolbos turinys kruopščiai sumaišomas, supilamas į mėgintuvėlius ir sulenkiamas 40 minučių tempiant 85 ° C temperatūroje. Rekomenduojama medieną suvynioti elektriniame maišytuve su automatine temperatūros reguliavimu. Trečiadienį su anti-TB vaistais

1 serija gali būti laikoma šaldytuve 2-4 ° C temperatūroje 1 mėnesį, o antros eilės preparatai - ne daugiau kaip 2 savaites. Medžiagos laikymas preparatuose kambario temperatūroje yra nepriimtinas. Ruošiant anti-tuberkuliozės vaistų tirpalus, atsižvelgiama į jų aktyvumą, apskaičiuojant koncentraciją, pakoreguotą pagal nespecifinės preparato dalies molekulinę masę, grynumą ir kt. Nustatant vaisto jautrumą, naudojamos tik chemiškai grynos medžiagos.

Metodo principas yra nustatyti antituberkuliozinio vaisto, kuris slopina didelę mikobakterijų populiacijos dalį, koncentraciją. Jei teisingai atliekamas, šis metodas yra patikimas.

Prieš bandymą būtina įsitikinti, kad izoliuota mycobacterium tuberculosis kultūra neturi pašalinės mikrofloros. Iš mikobakterijų kultūros 0,9% natrio chlorido tirpale paruošiama homogeninė suspensija mililitre, kurioje yra 500 milijonų mikroorganizmų viename mililitre (optinis drumstumo standartas - 5 vienetai). Gauta suspensija praskiedžiama 0,9% natrio chlorido tirpalu (1:10) ir į kiekvieną kultūros terpės rinkinio mėgintuvėlį įpilama 0,2 ml suspensijos. Sėkluoti vamzdžiai dedami į termostatą 37 ° C temperatūroje ir laikomi horizontalioje padėtyje 2-3 dienas, kad kultūros terpė nuožulniame paviršiuje būtų vienodai užkrečiama su mycobacterium tuberculosis suspensija. Tuomet vamzdeliai perkeliami į vertikalią padėtį ir inkubuojami 3-4 savaites. Rezultatai užfiksuojami po 3-4 savaičių.

Kadangi išsiskyrimo iš medžiagų iš medžiagų, esančių maistinių medžiagų terpėje, trukmė yra mažiausiai 1-1,5 mėnesio, šio medikamento jautrumo nustatymo šio metodo rezultatai gali būti gauti ne anksčiau kaip po 2-2,5 mėnesių nuo medžiagos sėjimo. Tai yra vienas iš pagrindinių metodo trūkumų.

Remiantis tam tikrais kriterijais, interpretuojami mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymo rezultatai. Ant kieto terpėje laikomas jautrus vaisto koncentracijos, kad yra įtrauktas į terpę, jei kolonijų mikobakterijų auginami in vitro su šio narkotiko skaičius yra ne daugiau kaip 20 gausiai augimo valdymo vamzdelio be narkotikų. Tik tada, kai yra daugiau kaip 20 kolonijų, kultūra laikoma atspari šiai koncentracijai. Praktiškai, gaunant augimą, bandymo mėgintuvėlius uždaro beveik 20 CFU. Būtina pranešti klinikiniam vienetui, kad jautrumas ar pasipriešinimas šiuo atveju yra ribinis, nes kartais jis gali paaiškinti klinikinių rodiklių neaiškią dinamiką.

Skirtingiems vaistams nustatoma tam tikra koncentracija, pagal kurią stebima mikobakterijų populiacijos kritinė dalis. Ši koncentracija vadinama "kritine". Kaip stabilumo kriterijus naudojamas mikobakterijų populiacijos augimas maistingųjų medžiagų terpėje su preparatu esant kritinei koncentracijai.

Remiantis vidaus TB praktika, nustatant atsparumą vaistams, jie neapsiriboja tik kritinių koncentracijų nustatymu. Taip yra dėl to. Kad išplėstas apibrėžimas lygis atsparumo vaistams leidžia gydytojas tiksliau poziciją taktika chemoterapija naudojant žinias skatinantys su narkotikais derinius veiksmų, kryžminamą tikimasi pasipriešinimą arba taikyti efektyviau vaistai grupė naudojamas anti-TB narkotikus.

Absoliučios koncentracijos metodas yra paprasčiausias, tačiau jis taip pat yra labiausiai jautrus klaidoms, padarytoms atlikus bandymą. Patikimesnis, ypač nustatant jautrumą antros eilės vaistams, ir bendras už Rusijos ribų yra proporcijų metodas. Jame atsižvelgiama į absoliutų koncentracijų metodo trūkumus, tačiau vykdant tai yra daug sunkiau.

Šis metodas labai panašus į absoliučią koncentracijos metodą. Tiriamųjų mėgintuvėlių paruošimas vaistiniais preparatais atliekamas taip pat. Kaip ir absoliutus koncentracijos metodas. Tačiau Mycobacterium tuberculosis suspensijos sėklos dozė yra 10 kartų sumažinta. Kuris pašalina kai kurių Mycobacterium tuberculosis štamų atsparumo savanoriui dažnį tokiems vaistams kaip etambutolis, protionamidas, kapreomicinas. Kaip kontrolinis, naudojami 2 arba 3 mėgintuvėliai, kurių sėjimo dozė yra lygi mėgintuvėliuose, nuosekliai atskiestos 10 ir 100 kartų. Stabilumo kriterijus yra vizualiai stebimas mikobakterijos tuberkuliozės augimas. Pirmosios serijos vaistams stabilumo kriterijus yra 1% pradinės populiacijos augimo perteklius, o antrosios eilės vaistai - padidėja 1 arba daugiau kaip 10% pradinio, priklausomai nuo pasirinktos kritinės koncentracijos.

1997 metais, darbo grupė PSO ir Tarptautinės Sąjungos geros tuberkuliozės atsparumas TB narkotikų identifikavimo jau pakoregavo šiuos kriterijus, siūlanti laikoma atsparus mikobakterijų, kuris auga ant kieto kiaušinio žiniasklaidos Lowenstein-Jensen ne šių koncentracijų:

• dihidrostreptomicinas - 4 μg / ml;
• izoniazidas 0,2 μg / ml:
• rifampicinas 40 μg / ml:
• Etambutolis - 2 μg / ml.

2001 m. Buvo pasiūlyta kritinė koncentracija šiems antrosios eilės vaistams (kritinei 1% daliai):

• kapreomicinas - 40 mkg / ml;
• protionamidas - 40 mikrogramų / ml;
• kanamicinas - 30 μg / ml;
• viomicinas - 30 mikrogramų / ml;
• cikloserinas 40 μg / ml;
• aminosalicilo rūgštis - 0,5 μg / ml;
• ofloksacinas - 2 μg / ml.

Augimo rezultatai vertinami po 4 savaičių kaip preliminarus ir po 6 savaičių auginimo - kaip paskutinės.

Norint nustatyti vaisto jautrumą pirazinamidui, kuris plačiai naudojamas šiuolaikinėje tuberkuliozės chemoterapijoje, rekomenduojama koncentracija yra 200 μg / ml. Tačiau iki šiol nėra visuotinai priimtino vaisto atsparumo vaistui nustatymo metodo kietose maistingosiose terpėse, nes jo antibakterinis aktyvumas pasireiškia tik rūgštinėje terpėje (pH <6), kurią techniškai sunku išlaikyti. Be to, daugelis mikobakterijų tuberkuliozės klinikinių kultūrų nenoriai auga kiaušinių aplinkoje, kurioje yra rūgštinė aplinka.

Siekiant įvertinti mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymo rezultatų kokybę, rekomenduojama kiekvieną naują Levenstein-Jensen terpės partiją stebėti lygiagrečiai nustatant standartinį muzikos štamo H37Rv jautrumą. Be to, yra tam tikrų mikrobiologinių kriterijų, kuriuos reikia išlaikyti, kad metodai duotų gerai atkuriamą ir teisingai interpretuotą rezultatą. Tai apima Mycobacterium tuberculosis kultūros gyvybingumą, homogeninės suspensijos ir suspensijos gavimo taisykles, mycobacterium tuberculosis kultūrų atrankos taisykles, pasirinktos bakterinės masės reprezentatyvumą. Atsparumo vaistui nustatymo patikimumas mažėja, kai labai mažai bakterijų išsiskyrimas.

Neseniai nustatyta, kad vaistų jautrumo nustatymo metodas naudojant automatines sistemas yra laikomas perspektyviu. Šioje srityje geriausiai tinka VASTES MGIT-960. Šiuo atveju mikobakterijos tuberkuliozės jautrumas vaistams yra nustatomas remiantis modifikuotu proporcijų metodu. Apibrėžimo procese palyginamas mikobakterijos tuberkuliozės augimo lygis kontroliniame mėgintuvėlyje ir mėgintuvėliuose su vaistiniais preparatais. Norėdami nustatyti jautrumą streptomicino izoniazidas, Reef-pitsinu ir etambutolio yra naudotas praturtinti priedų ir antibiotikų įtrauktas į rinkinį SIRE rinkinys. Norėdami nustatyti jautrumą pirazinamidui, naudokite PZA komplektą. Į suspensijos tyrimas Mycobacterium tuberculosis inokuliuojamas mėgintuvėlius su kitais vaistais, taip pat kontrolės vamzdžių žinoma, su paruošta suspensija, 100 kartų už visų narkotikų, išskyrus pirazinamido, kur suspensija yra praskiedimo 10 kartų. Stabilumo kriterijus yra mikobakterijų augimo rodiklio vertė 100 GU, kai kontrolinėje vamzdis 400 GU (cm. "Mikobakterijų izoliavimo metodai kultūra") augimas. Rezultatų apskaita ir aiškinimas atliekami automatiškai ir nustatomi pagal įvesties arba pasirinktos programos.

Kaip kritinė koncentracija, galutinė koncentracija yra naudojama mėgintuvėlyje su skystu maistingu terpėje. Šiuo metu buvo sukurtos kritinės koncentracijos tiek 1-osios, tiek antrosios eilės vaistams. Reikėtų pažymėti, kad mikobakterijų tuberkuliozės jautrumas cikloserinui ir aminosalicilo rūgščiai nustatomas tik kiaušinių medžiagų maiste.

Įmantrus darbas protokolas aprašyta sistema leidžia mokytis narkotikų jautrumą kaip paskirtosios kultūros (tanki maitinamosios terpės), ir taikant pirminį Mycobacterium MGIT-augimą in vitro. Pastarasis variantas žymiai sumažina laiką, kultūros, kuri leidžia jums gauti visą rezultatus Mycobacterium tuberculosis (įskaitant informaciją apie narkotikų jautrumas) kultūros po 3 savaičių nuo surinkimo medžiagos dieną, o tradicinis metodas yra įmanoma gauti tik 3. Mėnesį. Laikas rezultatus, kai pacientas yra intensyvaus gydymo fazėje, gali kompensuoti santykinio brangumo tyrimus.

[72], [73], [74], [75], [76], [77], [78], [79]

Mikobakterijų diferenciacija

Atsižvelgiant į tai, kad naudojamos maistingųjų medžiagų terpės nėra griežtai selektyvios. Paskirtoji atskirtų mikobakterijų diferenciacija yra pripažinta privaloma. Už diferenciacijos mikobakterijų poreikis yra dėl to, kad bruožai patologinių procesų, kurias sukelia genties numeris: skirtingų žinoma ir rezultatus tuberkuliozės ir mycobacteriosis, atsparumo gamtinių narkotikų buvimas Kai anti-TB narkotikų.

Jis pripažino, kad pirminis nustatymas Mycobacterium tuberculosis komplekso M. Nontubercular nuo mikobakterijų atlieka šias charakteristikas: augimas ant kietų maitinamosios terpės, pigmentacija, kolonijų morfologija, kad rūgšties atsparumo ir temperatūros optimalaus augimo akivaizdoje.

Deja, nėra vieno laboratorinis metodas patikimai atskirti M. Tuberculosis komplekso mikobakterijų iš kitų rūgštims atsparių bakterijų, vis dėlto iš pirmiau aprašytų su rezultatais pateikiamas toliau iš biocheminių bandymų skaičiaus funkcijų derinys leidžia Mycobacterium tuberculosis komplekso su M. Greičiausiai identifikuoti 95%.

Už Mycobacterium sudėtingos M. Tuberculosis diferenciacijos (M. Tuberculosis, bet ne M. Bovis, M. BovisBCG M. Africanum M. Microti M. Canettii ir kt) iš lėto augančios mikobakterijų naudojamas nontubercular pagrindinius biocheminius bandymus, kad aptikti šių simptomų buvimą:

• gebėjimas gaminti nikotino rūgštį (niacino testas):
• nitrato reduktazės aktyvumas;
• termostabili katalazė;
• augimas terpėje su natrio salicilatu (1 mg / ml).

Kaip papildomi bandymai, gali būti naudojamas augimas terpėje, kurioje yra 500 μg / ml paranitrobenzoinės rūgšties arba 5% natrio chlorido.

Daugelis bakteriologinių laboratorijų šiuos mikroorganizmus nustato tik komplekso lygmeniu, kuris yra dėl ribotų laboratorijų pajėgumų ir specialistų metodologinių gebėjimų.

Daugeliu atvejų, tačiau iš tikrųjų diferencijuoti M. Tuberculosis ir M. Bovis yra pakankamas šie bandymai: niacino, Nitratų buvimą, dalyvavimo registravimo ir pirazinamidazy augimo į terpę, kurioje 2 ug / ml hidrazido iš tiofeno-2-karboksirūgšties, kurios. Atsižvelgiama į tai, kad M. Tuberculosis komplekso mikobakterijos apibūdinamos tokiais simboliais:

• lėtas augimas (daugiau nei 3 savaites);
• augimo temperatūra 35-37 ^o C temperatūroje;
• pigmentacijos nebuvimas (dramblio kaulo spalvos);
• pažymėta rūgščiai greita spalva;
• teigiamas niacino testas;
• teigiamas nitratų reduktazės testas;
• termostabilios katalazės nebuvimas (68 ^° C).
• Augimo nebuvimas Levenstein-Jensen terpėje, kurioje yra:
  • 1000 μg / ml natrio salicilato,
  • 500 μg / ml paranitrobenzoinės rūgšties,
  • 5% natrio chlorido:
• augimas esant 1-5 μg / ml tiofen-2-karboksirūgščiai.

Izoliuotų mikobakterijų diferencijavimo svarba žymiai padidės, kai registruojami ŽIV / AIDS atvejai, susiję su tuberkulioze ar mikobakteriuze. Šiuo metu nėra absoliutaus tikrumo dėl praktinių regioninių laboratorijų pasirengimo tinkamai atlikti šį darbo apimtį.

[80], [81], [82], [83], [84], [85], [86], [87], [88]

Imunologinė tuberkuliozės diagnozė

Yra keletas universalių reiškinių, vaistų ir imunologinių tyrimų, kurie iš pradžių buvo randami būtent dėl tuberkuliozės ar imuninio atsako į mikobakterijas modelio. Jie apima BCG TUBERKULINIZACIJA, tokio reiškinio kaip odos DTH (tuberkulino - Pirquet ir Mantoux reakcija), reakciją su po oda tuberkulino įjautrintos gyvūnų (Koch reiškinys). Tuberkulioze taip pat buvo nustatytas vienas iš pirmųjų infekcinių ligų antikūnų. Žinoma, giliau gerų tuberkuliozė imuniteto mechanizmų supratimas ir jų genetinė kontrolė, tuo didesnė gali būti imunologinių metodų ir vaistų, kurie veikia imuninę sistemą, panaudojimas, siekiant išspręsti praktines problemas TB.

Šiuo metu svarbiausia ir sudėtinga praktinė problema yra tuberkuliozės aptikimas masinės visuomenės atrankos procese. Tačiau, nepaisant daugybės "sėkmės" (ribotos medžiagos) pranešimų, nėra tinkamo imunologinio metodo (atsinaujinančio "bet kokiuose ginkluose") ir šiuo tikslu tinkamas vaistas.

Klinikinėje praktikoje labai plačiai naudojami imunologiniai metodai, ypač serologiniai tyrimai (antigenų, antikūnų nustatymas) ir tuberkulinu provokuojantys tyrimai.

Pirmoje diferencinės diagnostikos imunologiniuose tyrimuose yra serologiniai metodai - antigenų ir antikūnų nustatymas skirtingose kūno aplinkose.

Antikūnų prieš mikobakterijų tuberkuliozę specifiškumas priklauso nuo antigenų, naudojamų imunologiniame tyrime. Siūlomas didelis kiekis antigenų, iš kurių pirmoji yra tuberkulino PPD:

• PAP ir kiti kompleksiniai preparatai iš kultūrinio skysčio;
• ultragarsinis suskaidymas;
• Tritono ekstraktas ir kiti kompleksiniai ląstelinių sienelių preparatai;
• 5 antigenas (Daniel);
• 60 antigenas (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• laido faktorius (trehalozė-6,6-di-mikolatas);
• fenolio ir kitų glikolipidų;
• lipopolisacharidai;
• fibronektiną surišantis antigenas;
• baltymai (dažniausiai rekombinantiniai); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA ir tt

Kaip metų tyrimų Rusijos ir užsienio mokslininkų rezultatas atskleidė pagrindinius įstatymus ir antikūnų serologinių diagnostikos tuberkuliozės efektyvumą: kuo daugiau sudėtingą antigeną, tuo didesnis jautrumas ir apatinę specifiškumą bandymą. Specifiškumas skirtingose šalyse skiriasi priklausomai nuo M. Tuberculosis infekcijos ir nontubercular mikobakterijų, vykdyti BCG vakcinacijos ir kitiems gyventojams. Be vaikų, informacija turinys serodiagnosis yra mažesnis nei suaugusiems. Pirminėje tuberkulioze (dažniau vaikams) IgM apibrėžimas yra labiau informatyvus. Su antriniu IgG. ŽIV infekuotiems pacientams infekcinė antikūnų nustatymo serodiagnozė yra mažesnė. Efektyvumas nustatymas antikūnų priklauso nuo klinikiniai aspektai "numeris: procesas veikla (buvimas ar nebuvimas" izoliacija "mikobakterijų buvimo irimo ertmes, kad infiltracijos laipsnių), iš proceso paplitimas, jo srauto trukmė.

Fermentinio imuninio tyrimo (ELISA) metodo jautris yra apie 70%. Nepakankamas tyrimo veiksmingumas yra dėl jo mažo specifiškumo. Anksčiau buvo apsvarstyta galimybė naudoti serologinį atranką didelės rizikos grupėse, ypač tarp asmenų, kuriems pasireiškia tuberkuliozės pokyčiai plaučiuose.

Norėdami padidinti specifiškumą IFA tęsti paiešką konkretesnių antigenų, įskaitant pagamintas genetinės inžinerijos: (Žr. Aukščiau) Esat-6, ir kt .. Griežtai specifinių antigenų (38 kDa, ESAT) naudojimas padidina specifiškumą. Bet žymiai sumažina analizės jautrumą. Kartu su IFA (eksperimentinė laboratorinių bandymų sistemas. Pvz Pathozyme IFA rinkinys) taip pat teikia rinkiniai su šoniniu imunochromatografiniu filtravimas (Mycodot), taip pat kitų panašių bandymų (dot-analizė membranos) su vizualiai vertinant bandymo rezultatus. Atliekant šiuos tyrimus, analizė atliekama 10-30 minučių; jiems nereikalinga speciali įranga, jiems reikia vizualiai įvertinti rezultatus, susijusius su tam tikru subjektyvumu. Šie metodai turi maždaug tokius pačius jautrumas ir specifiškumas charakteristikas (70% ir 90-93%, atitinkamai), kaip tradicinio ELISA.

Imuninės analizės metodų naudojimas turi tam tikrą papildomą vertę, į kurią atsižvelgiama taikomų metodų komplekse, diferencijuojant tuberkuliozės diagnozę, ypač diagnozuojant jo ekstrapolines formas. Veiksmingiausias ELISA metodas yra tuberkuliozės meningito diagnozė cerebrospinalinio skysčio tyrime. Šiuo atveju analizės jautrumas yra 80-85%, o specifiškumas yra 97-98%. Yra duomenų apie mikobakterijų tuberkuliozės antikūnų aptikimo ašarojančiame skysčiuose veiksmingumą nustatant tuberkuliozinį uveitą.

Gama interferono sintezės indukcija in vitro

Gama interferonas (IFN-γ) yra specifinis imuninės gynybos faktorius, įgytas aktyvuojant makrofagų fermentų sistemas. IFN-γ sintezės indukcija sensibilizuotais T limfocitais sukelia jų sąveiką su mikobakterijų antigenu.

Kaip antigenai naudojami kaip tuberkulino PPD. Ir specifinius antigenus, gautos genetinės inžinerijos, ypač antigenų ESAT-6 (anksti išsiskiria antigeną, turinti molekulinę masę 6 kDa) ir BP-10 (kultūra filtratas baltymų 10 kDa). Genetinė inžinerija arba rekombinantiniai antigenai BCG vakcinos ir kitų mikobakterijų ląstelėse nėra. Naudojant tuberkuliną, indukcijos bandymo IFN-γ rezultatai yra panašūs į tuberkulino odos tyrimo rezultatus (tiesioginė koreliacija). Naudojant genetiškai modifikuotus antigenus, tyrimo rezultatai yra specifiškesni ir nepriklauso nuo ankstesnio BCG skiepijimo. Bandydami vakcinuotus asmenis, kurie neturėjo sąlyčio su tuberkulioze, tyrimo specifiškumas yra 99%. Tyrimo jautrumas tuberkuliozės pacientams svyruoja nuo 81 iki 89%.

Testai ir diagnostikos įrankiai buvo sukurta remiantis trumpalaikiam auginimui, ląstelių ar viso kraujo vienabranduolėse ląstelių, išskirtų iš kraujo su antigenais Mycobacterium tuberculosis in vitro su vėlesniu nustatymo IFN- koncentracijos arba skaičiavimo T-limfocitų, kurie sintetinti IFN-gama skaičių. Iš interferono susintetintas vitro koncentracija buvo nustatyta IFA metodu, naudojant monokloninius antikūnus jungimuisi su IFN-. Tada, naudojant kalibravimo standartą IFN- lemia jos koncentracija mėgintuvėlį arba lėkštelės duobutes.

Atliekant Elispot testą, T-limokocitų, sintezuojančių IFN-γ, skaičius. Skaičiuojami ant plokštelės, padengtos IFN-γ antikūniais, paviršiaus.

Kūrėjai Diagnostiką nuo IFN-γ in vitro per indukciją, kuris Agentūros patvirtinta medicinai ir JAV produktai, teigia, kad testas yra neįmanoma atskirti latentinės tuberkuliozės infekcijos iš aktyvios tuberkuliozės. Todėl regionuose su aukštu infekcijos lygiu bandymas nėra tiesiogiai diagnozuotas. Tačiau mūsų šalyje ji gali būti naudojama siekiant diferencijuoti tuberkuliozės infekciją vaikams po vakcinacijos nuo alergijos ir įvertinti specifinį imunitetą gydymo procese.

Šiuo metu tiriama vidaus tyrimų sistema, skirta nustatyti IFN-γ sintezės indukciją specifiniais tuberkuliozės antigenais in vitro.

Imuninė būklė ir tuberkuliozės eiga, imunokorekcija

Žmogaus tuberkuliozės gydymo procese yra pokyčių antigenemija ir imuninės sistemos būklė.

Duomenys apie eksudatų ir audinių pokyčius iš esmės prieštaringi. Vienintelis dalykas, kurio galima pagrįstai pastebėti, yra tas, kad tuberkuliozės granulomos, kaip taisyklė, nustato daug aktyvintų T limfocitų.

Tikslinga apsvarstyti dar dvi nuostatas, kurios yra būtinos norint suprasti imunologinių mechanizmų vaidmenį gydant tuberkuliozę žmonėms:

• AIDS sergantiems pacientams yra ypač daug atsparumo daugeliui vaistų;
• su atsparumu daugeliui vaistų (be ŽIV infekcijos) imuniteto sutrikimai (ypač T-ląstelių ryšys) yra ypač reikšmingi.

Kai tuberkuliozė plačiai taikyti įvairius metodus imunomoduliacijai: tai visų pirma vaistai veikiantys pirmiausia T-ląstelių imunitetą ir iš vienabranduolėse phagocytes sistema (užkrūčio hormonai, izoforonas likopid, polioksidony ir kt.). Taip pat visas (susilpnintas) mikobakterijas ir jų komponentus.

Molekulinės ir biologinės tuberkuliozės diagnozė

Už MOLEKULINIAI infekcinių ligų diagnozavimo apima, daugiausia, metodai, pagrįsti manipuliuoti su genomo medžiagos bakterinių ir virusinių patogenų nustatyti konkrečią genetinę medžiagą - DNR segmentai, turinčią nukleotidų seką, specifinė tam tikros rūšies arba patogenų padermių analizuoti konkrečius DNR sekas genuose, kurie nustato patogeno jautrumą tam tikroms vaistinėms medžiagoms, taip pat funkcinei analizei tam tikrų ligos sukėlėjų genų veikla. Molekulinės biologijos metodai buvo plačiai mokslinių tyrimų ir praktinio taikymo diagnozuoti ir kontroliuoti įvairių bakterinės ir virusinės infekcijos po atidarymo 1985, Carrie Myullisom (laureatas 1989 m. Nobelio premijos) polimerazės grandininė reakcija.

Polimerazės grandininės reakcijos metodo principai ir galimybės

PCR leidžia milijoną kartų kelis valandas dauginti in vitro nukleotidų seką (DNR fragmentą iš patogeno). Reakcija, esant vienkartinėms DNR grandinėms, lemia ypač didelį tyrimo jautrumą.

Kai kurių DNR grandinės regionų nukleotidų seka nustato mikroorganizmo genetinį tapatumą, o tai paaiškina didelę PGR specifiškumą.

Šio metodo aptikimo ir tyrimo charakteristikas, kurias sukelia Mycobacterium tuberculosis biologinių savybių mikroorganizmo, turi labai lėto augimo vertė: padvigubėjimo laiko Mycobacterium tuberculosis DNR, kai kultivavimas vykdomas 12-24 valandų.

PGR metodo principas susideda iš amplifikacijos - kelis, milijonus kartų. Dauginant konkrečios DNR sekos pjūvius į vamzdelio mikromoaktyvumą, atliekant sekančias tris reakcijos stadijas, kurių kiekviena pereina kitokiu temperatūros režimu:

• I etapas - dvigubos DNR denatūracija kaitinant su jos grandinių skirtumais;
• II etapas - pradmenų (gruntuojančių oligonukleotidų) papildomas ryšys (hibridizavimas) su griežtai specifinių grandinių galinėmis sekcijomis, parinktas DNR fragmento dauginimui;
• III etapas - DNR fragmentų grandinės užbaigimas termostabilios DNR polimerazės pagalba.

In vitro amplifikavimui turi būti matricos DNR molekulės. Keturių rūšių dezoksinukleozidtrifosfatais (nukleotidų), kurių sudėtyje yra tinkamas azoto bazės: adenino (A) timino (T),, guanino (G), citozino (C); dirbtinai sintezuoti pirminiai oligonukleotidai (pradmenys), sudaryti iš 18-20 bazių porų; termostabilios DNR polimerazė fermentas, turintis optimali temperatūra 68-72 ^dėl C, ir magnio jonų.

PGR specifiškumas priklauso nuo DNR fragmento pasirinkimo. Atsižvelgiant į tai, sintezuojamos šoninių sėklų oligonukleotidai. Hibridizacijos ir DNR grandinės užbaigimo ypatumai priklauso nuo šių porų azoto bazių komplementarumo: adenin-timoino, guanino-citozino.

Siekiant nustatyti, genominę tuberkuliozės mikobakterijos kompleksą efektyviausias tikslinė amplifikacijos daugelyje pasirinktai DNR fragmentas IS6110 bandymo sistemose, kuri daugeliu padermių Mycobacterium tuberculosis genomo turi didelį skaičių (10-20) pasikartojimų, kuri suteikia, kartu su specifiškumo, didelio jautrumo ir tyrimo metodo. Tuo pačiu metu yra aprašytos Mycobacterium tuberculosis padermės su nedideliu pakartojimų skaičiumi arba IS6110 fragmento nebuvimu.

DNR molekulių išskyrimas iš biologinio mėginio

Kad būtų atlikta PGR, patogenų DNR molekulės turi būti izoliuoti iš biologinės medžiagos minimaliu tūriu, minimalus nespecifinės DNR kiekis ir įvairūs fermento - DNR polimerazės inhibitoriai.

Mėginių paruošimas turėtų būti atliekamas tokiomis sąlygomis, kad izoliuoti DNR molekules neleistų kryžmiškai užteršti mėginių. Norėdami tai padaryti, būtina apdoroti kambarį su ultravioletinių spindulių, grindų ir darbo paviršių stalviršių ir prietaisų su chloro turinčiais tirpalais. Taip pat privaloma naudoti švarias pirštines, vienkartinius bandinius ir patarimus automatinėms pipetėms.

Izoliuoti Mycobacterium tuberculosis iš klinikinių mėginių DNR (galvos ir stuburo smegenų skysčio, bronchų plovimo), kuriame yra ne daug ląstelių, ląstelių nuolaužų, arba jų druskas, pakankamą, kad centrifuguojamas mėginys 3-4 tūkstančiais. Rpm, įtraukti į dumblo 20-30 ul 2% tirpalo Triton X-100 ir pašildytas iki 90 ^apie C temperatūroje 30 min.

Už paruošimas skreplių mėginiai turi būti efektyvus suskystinimo, kuris paprastai naudojamas 4% natrio hidroksido tirpalo ir N-acetil-L-cisteino (NALC) jos į 50-80 mg per mėginio kiekis - priklausomai nuo mėginio klampumo. NALC tirpalas turi būti paruošiamas ex tempore, arba NALC milteliai gali būti tiesiogiai sutirštinti. Po skystinimo bandiniai centrifuguojami 15 minučių 3,5-4000 aps / min (3000 g) 50 ml buteliukuose su užsukamais dangteliais, E. E. Esant toms pačioms sąlygoms, kurios yra rekomenduojamos paruošti skreplius.

Už DNR ištraukimą iš granulių metodas yra naudojamas dažniausiai remiasi 5-6 molinio guanidino izotiocianato lizės reagentu kaip ir Mikroakyto dalelių ir silicio oksido ( "diatomitu") sorbing DNR molekulę naudojimo. Nespecifinių medžiagos, įskaitant galimų inhibitorių, tada plauti 2,5 molinio guanidino izotiocianato ir etanolio tirpalu, o po to DNR molekulė yra desorbuotų vandenyje, ir šių mėginių buvo naudojama atlikti PGR. Siekiant supaprastinti DNR ekstrakcijos technologiją, "diatominę žemę" dažnai pakeičia magnetinės mikroskopijos, padengtos silicio oksidu. Tokiu atveju vietoj centrifugavimo, kad nusodintumėte daleles, naudojamas specialus magnetinis stendas mikrotubams.

Rusijoje buvo sukurtas originalus imunomagnetinio mikobakterijų atskyrimo metodas, po kurio sekė patogeno išskyrimą. Už Mycobacterium tuberculosis imunomagnetiniam atskyrimo naudojant ferroparticles dydį 3-5 mikronų, padengtą su silicio dioksidu, prie kurio yra prijungti, cheminės klijavimui polikloninius (triušio) antikūnų prieš Mycobacterium tuberculosis. Skreplių mėginiai po šarminio lizės neutralizuojami rūgštiniu tris-HCl tirpalu ir inkubuojami su imunomagnetiniu sorbentu. Tada imunosferos dalelės surenkamos magnetiniu lazdele su keičiamu antgaliu, perduodamos į mikrotubą ir nusodinamos. įpilama 20-30 μl 2% Triton X-100 tirpalo ir 30 minučių pašildoma 90 ^° C ^{temperatūroje}. Supernatantas naudojamas kaip DNR šablonas PCR analizei.

Sudėtinga problema yra biopsijos pavyzdžių DNR išskyrimas iš mycobacterium tuberculosis DNA. Fermentų biopsijai fermento proteinazė K naudojama galutinai 200-500 mg / l temperatūroje, esant 56 ^° C temperatūrai per naktį. Be to, naudojamas vienas iš žinomų metodų. Pernelyg didelė nespecifinė DNR biopsijų PCR analizėje dažnai sukelia reakcijos slopinimą, dėl kurio reikia pakartotinai ekstrahuoti DNR.

Rezultatų aptikimo metodai

Pasibaigus reakcijai, amplifikuotas patogenų DNR fragmentas yra identifikuojamas įvairiais metodais.

Gelio elektroforezės metodas gerai žinomas. Gautas DNR fragmentas identifikuojamas teigiamą kontrolę, apimančią norimą specifinį DNR fragmentą arba pagal žinomo dydžio (nukleotidų porų skaičiaus) fragmentą, kuris nustatomas naudojant standartinį molekulinį žymeklį.

Esant konkrečiam dažikliui, etidžio bromidas yra įtrauktas į dvigubos jungties DNR. Sintezuotas DNR fragmentas aptiktas ultravioleto spinduliuotės šviesoje.

DNR fragmento dydis, nustatytas elektroforezėje nuo atstumo nuo pradžios, turi atitikti žinomą molekulinės masės žymeklį arba teigiamą kontrolę.

Kitus metodus, PGR rezultatus, remiantis vienos grandinės hibridizacijos PGR produktai su oligonukleotidu, papildo jo - DNR zondo pažymėtas biotinu, po to aptikimo per fermentinių reakcijų, pavyzdžiui, jungimosi prie streptavidino-biotinas šarminės fosfatazės.

Remiantis tokio tipo aptikimo metodu, buvo sukurtos PCR analizatoriai, kurių metu PCR rezultatai automatiškai nustatomi po to, kai po fermentinės reakcijos pasireiškimo nustatomas optinis tankis.

Šių metodų trūkumai yra tarpdanalioji tarša per gana trumpus DNR molekulių fragmentus. Kai molekulės patenka į naujus mėginius, jos tampa PGR matrica ir sukelia klaidingai teigiamus rezultatus.

Šiuo atžvilgiu, norint išvengti klaidingai teigiamų rezultatų, nustatomos griežtos patalpos atskyrimo ir izoliavimo taisyklės: ekstrahuoti DNR iš biologinių mėginių; patalpos, skirtos aptikti rezultatus (elektroforezė) iš švarios zonos. Šios patalpos yra galimo užteršimo zona. Kitas izoliuotas plotas - tai švarus patalpos, skirtos įvesti DNR mėginius, kurie turi būti bandomi vamzdeliuose su reakcijos mišiniu, skirtu PCR. Pagaliau daroma prielaida, kad pagrindinis prietaisas - DNR stiprintuvas - turėtų būti dedamas į atskirą, galbūt, biuro patalpą.

Apsaugoti nuo užkrėtimo pirmesnių reakcijų produktų - kai Likon-amp PGR sistemos bandymas, o ne dezoksinukleozidtimidina sudėtyje dezoksinukleoziduridin, kuri, kai in vitro sintezė grandinės įtrauktas, o ne tinkamoje padėtyje, t.y., Vietoj DNR esančio timino azoto bazė pakeičiama uracilu. Uracilo DNRglikozilazę pridedama į reakcijos mišinį į analitės, naikina tik užteršiančių fragmentai deoksiuridino, bet ne DNR gimtoji analizuojami. L; Paskesnis kaitinimas 94 ^o C iki inaktyvuoti fermentą ir neslopina PGR amplifikacija.

Yra bandymo sistema, pagrįsta izoterminiu rRNR amplifikavimu, kuriam pirmiausia atliekama DNR molekulių atvirkštinė transkripcija ir sintezė. Kuris, savo ruožtu, yra RNR molekulių sintezės matrica. RNR amplikonai aptinka naudojant akridino dėmės DNR zondą, kai hibridizuojamas reakcijos mėgintuvėlyje. Šis metodas, be didelio jautrumo, turi pranašumą: analizuojant vieną vamzdį, kuris apsaugo nuo užteršimo. Pasak autorių, šio metodo jautrumas kvėpavimo mėginiuose siekia 90%, o jo specifiškumas yra 99-100%.

Nauji aptikimo metodai diegiami realiuoju laiku. Šie metodai pirmiausia skiriasi tuo PGR, o jo rezultatai nustatomi vienu metu viename uždarame vamzdyje. Tai ne tik technologiškai supaprastina analizės metodą, bet ir užkerta kelią laboratorinių patalpų užterštumui ir bandinių su ankstesnės PCR produktais.

Realiu laiku PCR nustatymo rezultatų yra dėl to, fluorescencija vyksta per fluorogenic hibridizacijos zondo DNR su amplifitsi Rui-PGR per tam tikrą DNR fragmento. Struktūra fluorogenic DNR zondai sukonstruoti taip, kad fluorescencinis žymuo yra išleistas kaip fermentinės reakcijos rezultatas arba nutolusi nuo kvenčerio molekulės fluorescencijos tik pagal konkrečius hibridizacijos su norimą DNR molekulės būti amplifikuoto PGR metu. Kaip zondas molekulių hibridizuojama su padidėja fluorescencija skaičius yra proporcingas aptikto iš molekulių amplifikuoto produkto numeriu. Nuo kiekvieno ciklo skaičiaus PGR fragmentas DNR molekulės yra dauginama per pusę, ciklo numerį, kuriame fluorescencija nustatyta ir didina atvirkščiai proporcingas DNR molekulių skaičiaus pradinio bandinio. Jei reakcija vyksta pristatyti kaip kalibravimo kelias skirtingas žinomos koncentracijos molekulių, atitinkančių DNR fragmentą Mycobacterium tuberculosis, naudojant kompiuterinę programą gali būti apskaičiuota ir genomo DNR kiekį, kad į bandymo medžiagos.

Kiekvienas standartinis pavyzdys yra pasikartojantis. Kiekybinis kriterijus yra minimalus PGR ciklų, reikalingų nustatytos fluorescencijos pradžiai ir augimui, skaičius. Abscisoje - ciklų skaičius; ordinatė yra fluorescencijos reikšmė. DNR koncentracijos yra atvirkščiai proporcingos fluorescencijos atsiradimui reikalingų ciklų skaičiui. Dešiniajame stulpelyje (21-32) pažymėti atitinkamų koncentracijų cikliniai skaičiai. Skirtumai tarp 10 kartų DNR fragmentų koncentracijos 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 ciklus. Dviejų pacientų IS6110 fragmentų koncentracija buvo apie 10 ³ / ml ir 10 ⁴ / ml. Atsižvelgiant į Mycobacterium tuberculosis genomo analizuojamų fragmentų (6-20) kartotinių skaičių, mikobakterijų skaičius klinikiniuose mėginiuose yra atitinkamai apie 100 ir 1000 ląstelių.

PGR panaudojimas tuberkuliozės diagnozei

PGR metodas dažniausiai naudojamas pagreitintam tuberkuliozės diagnozavimui - mikobakterijos tuberkuliozės nustatymas klinikiniuose mėginiuose: skreplius. Bronchų plovimas, pleuros eksudatas, šlapimo, smegenų skysčio, punctates osteolizę, moterų lytinių organų takų aspiratai ir biopsijos kita. Į Nyderlanduose tyrimo apie 500 skreplių ir bronchų lavažo mėginiai iš 340 pacientų, sergančių diagnozuota plaučių tuberkuliozė buvo tiriamas siekiant palyginti PGR metodus, mikroskopija ir kultūros tyrimai, tepinėliai jautrumą. Analizės jautrumas buvo atitinkamai 92.6.88.9 ir 52.4%. Visų metodų specifiškumas buvo apie 99%.

Palyginamas Mycobacterium tuberculosis aptikimo efektyvumas, naudojant mikroskopinę tepinę medžiagą, sėją ant Levenstein-Jensen terpės, VASTES bandymo sistemos ir PGR analizės. PGR pasižymėjo 74,4% jautrumu, mikroskopija - 33,8%, sėjama į tankią terpę - 48,9%, o VASTES - 55,8%. Vidutinis Levenstein-Jensen terpės aptikimo laikas yra 24 dienos. VASTES - 13 dienų, PCR - 1 diena.

Taip pat aptariamos galimybės naudoti PGR kaip jautrų ir greitą būdą tuberkuliozės gydymo veiksmingumui stebėti.

Aptikta Mycobacterium tuberculosis DNR PGR su veiksmingos chemoterapijos nustatant ilgesnį laiką - vidutiniškai 1,7 mėnesio, palyginti su tepinėlio apibrėžtą fluorescencinių mikroskopija ir 2,5 mėnesius, palyginti su bakteriologinio tyrimo.

Neutralių tuberkuliozės formų diagnozė

Vertė kaip jautriai PGR metodas yra ypač didelis ekstrapulmonine formų, nes ji formuoja pagal šiuos klinikinius ir rentgenologiniai metodai tradicinių bakteriologinių metodų Mycobacterium tuberculosis nustatymo diagnostikos medžiagų neveiksmingas.

Į šlapimo mėginių tyrimo PGR rezultatai buvo teigiamas 16 iš 17 pacientų, sergančių aktyviu TB ir neigiamo šlapimo 4 pacientėms, neaktyvaus inkstų tuberkuliozės ir 39 pacientams, sergantiems šlapimo sistemos liga nontubercular.

Įtariamos tuberkuliozės atvejų buvo įrodyta, kad PGR tyrimo veiksmingumas kaulų čiulpų aspiratų tyrime pacientams, turintiems nežinomos kilmės karščiavimą. Vaikams buvo tiriami tuberkuliozinio limfadenito diagnozė, buvo ištirti 102 dūrių aspiratai ir 67 vaikas, kurių įtariamas tuberkuliozinis limfadenitas buvo biopsija. Gauti teigiami rezultatai: 71,6% realaus laiko PGR. Fluorescencinė mikroskopija - 46,3%. Kultūros tyrimai - 41,8%. Ištyrus 50 limfmazgių biopsijų pacientams, sergantiems "kačių įbrėžimo" liga, visi rezultatai buvo neigiami. Taigi buvo įrodyta 100% PGR analizės specifika. Tame pačiame darbe su limfmazgių punkcijos biopsija buvo įrodyta M. Avium aptikimo galimybė.

Kaip žinoma, moterų lyties organų nevaisingumo tuberkuliozės diagnozė yra viena iš sunkiausių diagnozės problemų. Kai tiriamas PGR biopsijos endometriumu, endometriumo ASPIRATAI skysti mėginiai iš Douglas vietą 14 (56%) 25 pacientų ištirtas laparoskopiškai įtariama tuberkuliozė, buvo gauti teigiami rezultatai. Naudojant tepinėlių mikroskopiją ir kultūrą, buvo gauti 1 ir 2 rezultatai atitinkamai. Šie atvejai taip pat buvo teigiami dėl PGR. Dauguma PCR teigiamų rezultatų buvo susiję su atvejais, kuriems būdingi tuberkuliozės požymiai pagal histologinį tyrimą; mažesnis skaičius - turint įtarimą dėl tuberkuliozės pagal laparoskopijos duomenis. Tik vienas teigiamas PGR tyrimo rezultatas buvo gautas, jei nėra tuberkuliozės laparoskopinių duomenų.

Diagnozuojant extra-plaučių tuberkuliozės formas, gydytojai dažnai kyla klausimas apie galimybę nustatyti patogeną bandant kraujo mėginius PCR metodu. Literatūros duomenys rodo, kad DNR nustatymas iš mycobacterium tuberculosis iš kraujo mėginių yra įmanomas, jei yra plačiai paplitusios ŽIV infekcijos formos. Mycobacterium tuberculosis DNR buvo aptiktas tik su generalizuota įvairių organų tuberkulioze pacientams, kuriems persodintas inkstas ir imuninės sistemos slopinimas.

[89], [90], [91], [92], [93], [94], [95]

Veislių identifikavimas mikobakterijų

PGR metodas gali būti gana veiksminga greito identifikavimo mikobakterijų iš tuberculosis komplekso ir kai mikobakterijų nontubercular rūšių gavusi pirminę augimą. Tokiu atveju naudojant PCR galima sutaupyti 7-10 dienų, reikalingų tolesniam kultūriniam identifikavimui teigiamo rezultato. Tyrimai PGR yra techniškai labai paprasta, nes ji nereikalauja sudėtingos mėginio paruošimo klinikinę medžiagą pasiekti aukštą jautrumą. Tyrime 80 teigiamų šio bandymo sistemos (MB Vasto. Organon įmonės) visi teigiami kultūros PGR buvo griežtai specifinė ir palaikius 1 dieną. Siekiant nustatyti kitas mikobakterijų rūšys į DNR patogeno kultūros, hibridizuoto su konkrečiais DNR zondais pažymėtų akridinas ir nustatytus pagal cheminės liuminescencijos išvaizdą per chemiluminometer arba ant nitroceliuliozės juostelių su vizualiai vertinant po hibridizacijos padermių preparato. Remiantis tokiu komplektu, nustatytas ribotas skaičius rūšių: mycobacterium tuberculosis complex. M. Avium, M. Avium kompleksas, M. Kansasii ir M. Gordonae.

A.Telenti ir kt. Taip pat sukūrė gana paprastą ir nebrangiai metodą rūšies identifikavimo kliniškai svarbių rūšių mikobakterijų PGR ir vėlesnio jų apdorojimo su dviem restrikcijos fermentais (fermentai, turintis savybės sumažinti DNR molekulę, esant konkrečiam kiekis). DNR fragmentas yra amplifikuojamas. Koduojanti šilumos šoko baltymas (65 kDa), ir po to yra veikiamas gautame PGR DNR fragmento nukleotidų 439 porų atskirai du fermentai - Bste II ir III Hae. Tada analizuojami naudojant agarozės gelio elektroforezės gauti du produktus, nustatant jų dydį (skaičius bazinių porų), naudojant standartinį rinkinį DNR fragmentų (molekulinės DNR-žymeklių) ilgio nuo 100 iki 1000 bazių porų. Kiekvienoje iš konkrečių tipų (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) aptikti du arba tris DNR fragmentai skirtingo dydžio kiekvienam restrikcijos fermentu. Gauta įvairių DNR dydžių derinys leidžia atskirti šias rūšis tarpusavyje.

Sukuriama biologinės DNR mikroskopijos technologija. Kuris padėtų nustatyti daugiau nei 100 mikobakterijų rūšių viename tyrime.

Rūšies identifikavimo taip pat gali būti atliekamas PGR amplifikacijos 16S rRNR kintamos srities, po to seka amplikonų, kai, palyginti su atitinkamu pirminės struktūros, kuri leidžia daugiau nei 40 rūšių mikobakterijų identifikavimą.

Naudojant PCR, taip pat galima atlikti rūšies identifikavimą Mycobacterium tuberculosis komplekse, įskaitant M. Bovis ir M. Bovis BCG diferencijavimą. Norėdami tai padaryti, analizuojamas kai kurių genų buvimas ar nebuvimas RD1 genomo regionuose. RD9 ir RD10. RD1 nėra M. Bovis BCG, bet yra virusulentiškose rūšyse, įskaitant M. Bovis.

Mycobacterium tuberculosis narkotikų jautrumo nustatymas PGR metodu

Tikslai molekulinės genetinių metodų narkotikų jautrumą arba atsparumą Mycobacterium tuberculosis sumažinti nustatyti mutacijas konkrečių nukleotidų sekų žinomų genų. Pagrindiniai metodai yra grindžiama arba tiesiogiai prochityvanii (sekos) šių sekų po sustiprinimu arba hibridizacijos biotino žymėto DNR fragmentų amplifikuotų per PGR DNR zondais. Abu alternatyvų susijusiai nustatyti nukleotidų keitimus su sekų, kurios naudojant DNR zondai veda į nesant arba nepilno hibridizacija nitroceliuliozės membranos, naudojant fermentą konjugatą (streptavidino-šarminės fosfatazės) - metodas Lipa-Rif-TB.

Metodas matuoti fluorescencijos in lokaliai fiksuotas ant microsections DNR zondai papildo žinomų mutacijos įvedamos PGR amplifikacijos genų regionuose, atsakingų už atsparumo arba narkotikų jautrumo, vadinamų mikrobiochipov metodas. Pagrindinis šio tyrimo algoritmas yra toks. Po to, kai DNR išskyrimą iš klinikinio mėginio arba kultūros mikobakterijų yra būtina atlikti PGR amplifikacija atitinkamų fragmentų rpoB geno, atsakingo už narkotikų jautrumą rifampicinas ar katG ir Inha genų, koduojančių baltymus Mycobacterium yra atsakingas už jautrumo izoniazido. PGR rezultatai buvo įvertintas agarozės gelyje elektroforezės, kuriame patvirtinti, kad atitinkamas DNR fragmentų pageidaujamo ilgio gavimą. Tada atliekamas antrasis PCR tyrimo etapas, kurio metu į DNR įvedama fluorescencinė etiketė. PGR rezultatai vėl patvirtina gelio elektroforezė. Po to, hibridizacija buvo atlikta (per naktį inkubacinis), išplaunant gaunamą medžiagą ant biochip, kuris yra didelis skaičius įtvirtintą jo nedidelis stiklo plokščių trumpų DNR grandinę (zondai), kurie papildo nukleotidų sekas narkotikų-jautrus tipo Mycobacterium tuberculosis ne galimų mutacijų kiekis. Taip pat su mutantinėmis sekomis, atsakingomis už atsparumą vaistams. Vieta DNR zondais ant lėkštės - griežtai apibrėžta, o fluorescencijos iškristi hibridizacijos lygiu, siekiant nustatyti rezultatą naudojant specialią skaitymo įrenginį įdiegta. Atsižvelgiant į tai, analizės rezultatai nustatomi naudojant specialią kompiuterinę programą.

Pastaraisiais metais buvo parengti alternatyvūs mikobakterijų tuberkuliozės jautrumo vaistams nustatymo metodai, pagrįsti realaus laiko PGR technologija, kurie leidžia atlikti šiuos tyrimus uždarojo mėgintuvėlio tyrimu.

Fig. 13-13 rodo analizės klinikinių izoliatų Mycobacterium tuberculosis rezultatą atsparumą rifampicino nustatyti PGR metodu realiu laiku: 218 - kontrolinį mėginį (jautri, rifampicino); 93 - teigiama Ser-Trp TCG-TGG mutacijos kontrolė; 4482 - teigiama Ser-Leu TCG-TTG mutacijos kontrolė; 162-322 - eksperimentiniai pavyzdžiai. 4 kanalų amplifikacijos kinetinių kreivių skaičiavimo rezultatas: 1 kanalas: 393 - teigiamas Ser-Trp TCG-TGG mutacijos kontrolė; kanalas 2: 4482 - teigiama Ser-Leu TCG-TTG mutacijos kontrolė; 162, 163, 172, 295 - eksperimentiniai pavyzdžiai; 4 kanalas: eksperimento metu dalyvaujančių mėginių amplifikacijos kinetinės kreivės. Teigiamas amplifikacijos reakcijos valdymas. Išvados: iš analizės rezultatai atskleidė šiuos mutacijas, kad nustatomas atsparumas rifampicino: į mėginių 162,163,172,295 - Ser-lėja TCG-TTG. Tas pats principas buvo naudojamas nustatant atsparumą vaistams izoniazidui genams katG ir inhA, kuris nustato dažniausiai pasitaikančias mutacijas.

[96], [97], [98], [99], [100], [101], [102], [103], [104]

Mycobacterium tuberculosis gripo identifikavimas

Labiausiai kruopščiai tiriamas identifikavimo metodas padermių Mycobacterium tuberculosis yra technika vadinama restrikcijos fragmentas, ilgis polimorfizmo (RFLP RFLP,. Arba anglų versija) ir kuri yra grindžiama fragmentirovanin (apribojimas) Mycobacterium tuberculosis DNR fermento Pvu II ir gauti fragmentai vėlesnį hibridizacija su tam tikrais konkrečiais sekas DNR jo pakartotinis elementas IS6110. Intrapecifinis kintamumas realizuojamas dėl skirtingo IS6110 pakartojimų skaičiaus ir jų buvimo DNR. Taip pat skirtingų atstumų tarp tam tikrų fermentų susiaurėjimo fermentų atakos taškų (restrikcijos svetainių) ir IS6110 elementų įvairovė. Ši technologija yra labai sudėtinga ir daug laiko. Po gydymo su DNR, išgautos iš Mycobacterium tuberculosis kultūros, gelio elektroforezės yra atliekamas su restrikcijos fermentu, o vėliau buvo perkelti DNR fragmentai skirtingų ilgių ant nitroceliuliozės membranos, hibridizacija buvo atlikta su fragmentais IS6110-elemento ir nustatėme, fermentiniais reakcijų. Gautas specifinis juostų modelis apibūdina konkretaus Mycobacterium tuberculosis štamo DNR. Kompiuterinės analizės pagalba atskleidžiama štamų tapatybė ar giminingumas. Nepaisant to, kad RFLP metodas yra labiausiai diskriminacinis, t. Y. Identifikuoja didžiausią skaičių skirtumų tirtų padermių, ji yra neveiksmingos su nedideliu skaičiumi (mažiau nei 5) IS6110-kartojasi Pastebėta, kad kai padermių. Fig. 13-14 rodo RFLP tipo štamų tipus.

Alternatyva gali būti spoligotyping metodas - tarpinio DNR sekų polimorfizmo analizė - tarpinis tarp tiesioginių DR reiškinių pakartojimų. Atliekant štamų spoligotinimą, PGR atliekamas su pradmenimis, ribojančiais DR regioną, po kurio susidaro skirtingo ilgio fragmentai, kurie hibridizuojasi su kintamais tarpiniais DNR regionais. Pateikiama DR regiono tarpinių sekų analizė. Pasak mokslininkų, paprastesnė, produktyvesnė ir tinkama pirminio štamų patikrinimui ir preliminarioms epidemiologinėms analizei, taip pat tyrimams tiesiogiai klinikinei medžiagai.

Akivaizdu, kad veiksmingesnis ir technologiškai prieinamas metodas yra VNTR (angliškų žodžių santrumpa) arba metodas kintamam skaičiui tikslių tandeminių repeticijų nustatymo Mycobacterium tuberculosis DNR. Šis metodas grindžiamas tik PGR metodu ir nereikalauja papildomų manipuliavimo. Kadangi tandemo pakartojimų skaičius skirtinguose štamuose ir skirtinguose lociose yra skirtingas, skirtingų dydžių fragmentai nustatomi ir analizuojami dėl gautos PCR produktų elektroforegramos. Pasak mokslininkų, naudojantis VNTR, vyksta didesnis stichinių diskriminacijos lygis nei RFLP metodu.

Pastaraisiais metais daug dėmesio buvo skiriama W-Pekino šeimos Mycobacterium tuberculosis (kartais vadinama Pekino paderme) štamų paskirstymu, kurie daugiausia yra atsparūs vaistams.

Pagrindiniai molekulinės biologijos tyrimų kokybės reikalavimai

[105], [106], [107], [108], [109], [110]

Pagrindiniai PGR reglamentavimo dokumentai

Užsakymai Rusijos Sveikatos apsaugos ministerija: №45 nuo 02.07.2000 g .. Numeris 109 iš 21.03.2003 g .. Numeris 64 iš 21.02.2000, gairių: 1.3.1888-04 "darbo organizavimas tyrimuose, naudojant PGR medžiaga užsikrėtę patogeniškumo biologinis patogeniškumo III-IV grupių veiksniai "; 1.3.1794-03 "Darbo organizavimas, tiriant I-II patogeniškumo grupių mikroorganizmų PGR medžiagą". 2003; 3.5.5.1034-01 "nukenksminimo medžiagos, užsikrėtę bakterija I-IV patogeniškumo grupėse, naudojant PGR," 2001 m priedėlio 11 vieningą instrukcijų ruošimas mikrobiologiniams tyrimams metodų nustatymo, diagnozavimo ir gydymo tuberkuliozės.

[111], [112], [113], [114]

Darbuotojai

Vykdymas molekulinės biologijos tyrimams gali turėti klinikinių laboratorinės diagnostikos, gydytojai bacteriologists, virusologų, gydytojai, biologai, klinikinės diagnostikos laboratorijoje, taip pat specialistų, turinčių vidurinį medicininį išsilavinimą gydytojai, išlaikė specializaciją ir aukštesnįjį mokymą nustatyta tvarka.

Laboratorinių patalpų įrengimas

Reikalingi šie laboratoriniai kambariai:

• Mėginių tvarkymo vieta yra laboratorija, pritaikyta dirbti su III-IV patogeniškumo grupių užkrečiamosiomis medžiagomis pagal 13.1888-04 metodologines instrukcijas.
• Zona reakcijos mišinių paruošimui PGR - laboratorijos patalpa, kuri užtikrina apsaugą nuo vidinės laboratorinės taršos - "švarios" zonos.
• • Jei analizuojant PCR produktus naudojamas elektroforezė arba hibridizacija. Laboratorijos patalpa, kurioje sandaugų DNR fragmentai yra ekstrahuojamas iš vamzdžių ir amplifikacijos, atitinkamai, gali patekti į aplinką, laikantis PGR laboratorijos reikalavimus (1.3.1794-03 gaires Orientavimo 1.3.1888-04) turi būti visiškai yra izoliuota nuo ankstesnėse pastraipose nurodytų patalpų. Ji turėtų būti pašalinti iš judėjimo zonos į zoną elektroforezė Mėginio tvarkymo ir "švarus" plotas jokių personalą, įrangą, bet medžiagų ir objektų, taip pat oro pernašos per ventiliacijos sistemą arba kaip juodraščius rezultatas. Ši zona nereikalinga fluorimetriniam PCR produktų aptikimui.
• Dokumentų ir rezultatų apdorojimo kambarys aprūpintas kompiuteriais ir būtina biuro įranga. Šiame kambaryje gali būti įrenginys, kuriuo galima aptikti PGR produktus neatveriant vamzdžio. - fluorescentiniai PGR detektoriai ir terminiai ciklai realiuoju laiku.

Sveikatos ir epidemiologiniai reikalavimai pirminiam skreplių gydymui yra panašūs į standartinius mikrobiologinius reikalavimus, taikomus dirbant su mikobakterijų tuberkulioze.

[115], [116], [117], [118], [119]

Laboratorinės įrangos PGR diagnostikos užbaigimas

Laboratorija apima įrangą šioms patalpoms.

• mėginio paruošimo patalpa turi tokią įrangą: II klasės apsaugos "SP-1.2" sluoksnis: kietojo kūno termostatas su "Eppendorf" tipo mėgintuvėlių kaitinimo dangteliu; mikrocentrifuga 13 000 aps / min; centrifuga (Vortex); šaldytuvas su temperatūros intervale nuo -20 ^iki C 10 iki ^apie C; "Rroline" serijos kintamo tūrio pipetės; siurblys su OM-1 spąstų kolbą; trikojis pipetėms; trikojis darbo stotis 200x0,5 ml; trikojo darbo stotis 50x1,5 ml; Laikoma, kad mėgintuvėliai laikomi 80x1,5 ml;
• Reakcijos mišinio paruošimo kambarys: apsauginė kameros PCR dėžutė ("Laminar-C 110 cm); centrifuga - voras; Proline serijos kintamo tūrio pipetės; trikojis pipetėms; trikojis darbo stotis 200x0,2 ml; Laikoma, kad mėgintuvėliai laikomi 80x1,5 ml; šaldytuvas su temperatūrų intervale nuo -20 ^iki C iki + 10 ^iš C;
• patalpas elektroforezei: kamera horizontaliai elektroforezei; maitinimo šaltinis; transiliuminatorius;
• DNR stiprintuvai arba nukleorūgščių analizatorius (PGR realiuoju laiku) su kompiuteriu ir programine įranga; gali būti dedamas į bet kurią laisvą kambarį. Jei naudojama realaus laiko PGR technologija. Patalpas elektroforezei nereikia.

[120], [121], [122], [123], [124]

Išorinė kokybės kontrolė

Kad būtų tikri gauti objektyviai patikimus rezultatus, laboratorijos turėtų dalyvauti laboratorinio tyrimo kokybės išorinio vertinimo sistemoje.

Kokybės kontrolės sistemos dalyviai gauna; 12 buteliukai liofilizuojant bakterinių ląstelių suspensijos, iš kurių du kuriuose yra E. Coli E. Kokoso pluošto, 3 buteliukai su Mycobacterium tuberculosis (nevirulentinį padermės), esant 10 ² / ml; 3 ampules su panašios padermės ląstelėmis, kurių koncentracija yra 10 ⁴ / ml; 2 ampulės su ne tuberkuliozės mikobakterijomis M. Avium-intracellulare ir M. Kansasii koncentracija 10 ⁵ / ml.

Paskirstyti išorės kokybės vertinimo bandymai iš anksto išbandomi dviejose nepriklausomose laboratorijose, turinčiose didelę patirtį šioje srityje.

[125], [126], [127], [128]