Molekuliniai genetiniai metodai, skirti diagnozuoti paveldimus ligas

DNR technologijos metodai yra naudojami nustatant konkretaus mutantinio geno chromosomos lokalizaciją, atsakingą už tam tikrų paveldimų patologijų formų kilmę. Nuo genas yra DNR segmentas, ir genų mutacijos - žala pirminės struktūros DNR (mutacija yra suprantama visų DNR sekoje, nepriklausomai nuo jų buvimo vietos ir įtaka individualios gyvybingumo), tada zondavimo preparatai metafazės pacientų chromosomų paveldima liga, galima nustatyti patologinio geno lokalizacija. Metodai molekulinės genetikos sukurti ligų diagnozavimo metodą ne pakitusios DNR struktūrą galimybę, jie leidžia nustatyti, paveldėtos sutrikimų lokalizacijos. Molekuliniai genetiniai metodai gali atskleisti mutacijas, susijusias su net vienos bazės pakeitimu.

Svarbiausias genas identifikavimo etapas yra jo izoliacija. DNR gali būti izoliuota nuo bet kokio tipo audinio ir ląstelių, turinčių branduolių. Šis DNR izoliacijos žingsniai yra greitai lizę ląstelių centrifuguojant su pašalinus fragmentų korinio organoidus ir membranų, fermentinio naikinimo baltymų ir jų ekstrahuojant iš tirpalo su fenolio ir chloroformo, DNR koncentraciją, nusodinant etanoliu.

Genetinėse laboratorijose DNR dažniausiai išskiriama iš kraujo leukocitų, kurių metu pacientui steriliu vamzdeliu su antikoagulianto tirpalu (heparinu) įvedamas 5-20 ml veninio kraujo. Po to leukocitai atskiriami ir apdorojami pagal pirmiau aprašytus etapus.

Kitame etape krovimo paruošimo iki tyrimo - DNR "supjaustyti" į fragmentus vietose su griežtai konkretaus bazių seką, yra atliekami naudojant bakterijų fermentų - restrikcijos endonukleazių restrikcijos fermentais (). Restrikcijos fermentais pripažinti specifinės sekos, 4-6, ne mažiau kaip 8-12 nukleotidų į dvigrandę DNR molekulės ir jos atskirtų į fragmentus šių sekų lokalizuoti vietų, vadinamų restrikcijos vietos. Numeris gaminamas restrikcijos fragmentai DNR nustatomas pagal atsiradimo restrikcijos vietomis ir fragmentų dydžio dažnio - į šių vietų palei pradinio DNR molekulės ilgio pasiskirstymas pobūdžio. Kuo dažniau yra ribojimo vietos, tuo trumpesnės DNR fragmentai po apribojimo. Šiuo metu yra daugiau nei 500 skirtingų tipų restrikcijos fermentų bakterinės kilmės, ir kiekvienos iš šių fermento pripažįsta savo konkrečią seką nukleotidų. Ateityje restrikcijos svetaines galima naudoti kaip genetinius DNR žymenis. Gaunamos DNR restrikcijos fragmentai gali būti rūšiuojami pagal ilgį elektroforezės agarozės arba poliakrilamido gelyje, ir tokiu būdu gali būti nustatomas jų molekulinę masę. Paprastai DNR aptikimo gelio naudojamo konkretaus dažymo (paprastai etidžio bromido) ir peržiūrėti gelio perduodami lengvojo ultravioletinių. DNR lokalizacijos vietos yra raudonos spalvos. Tačiau, atsižvelgiant į keliose restrikcijos apdorojimo metu endonukleazės suformuota tiek daug fragmentai skirtingų ilgių, kad jie nesugeba būti atskirti elektroforezės, tai nėra įmanoma vizualiai identifikuoti atskirus DNR fragmentus electrophoregram (pagamintą vienodą spalvą visoje gelio ilgio). Todėl hibridizacijos metodas su paženklintomis DNR zondomis yra naudojamas norimų DNR fragmentų identifikavimui tokiu geliu.

Bet koks vieno grandies DNR arba RNR segmentas gali susieti (hibridizuoti) su savo papildoma grandine, o guaninas visada yra susijęs su citozinu, adeninu ir timinu. Tai dvigubos molekulės susidarymas. Jei vienpusis klonuotų genų egzempliorius pažymėtas radioaktyvia etikete, bus gautas zondas. Zondas sugeba rasti papildomą DNR segmentą, kuris tada lengvai atpažįstamas pagal radioautografiją. Radioaktyviosios zondas yra įtraukta į narkotikų ištemptas chromosomų leidžia lokalizuoti geną į tam tikrą chromosomos su DNR zondo galima nustatyti tam tikrų Padalintų į porcijas Southern blot. Hibridizacija atsiranda, jei DNR bandymo dalis turi įprastą geną. Tuo atveju, kai yra nenormalus seka nukleotidų, t.y., atitinkantys chromosomų struktūros jose mutantas geną, hibridizacija nebus, kuri leidžia nustatyti lokalizacijos anomaliąją geno.

Norėdami gauti DNR zondus, naudojamas genų klonavimo metodas. Metodo esmė yra tai, kad DNR fragmentas, atitinkantis bet geno ar regiono, genas įterpiamas į klonavimo daleles, paprastai bakterijų plazmidės (apskrito ekstrachromosominių DNR esančių bakterijų ląstelių ir vykdymo genus atsparius antibiotikams), o po to bakterijas turintys plazmidę su įmontuotu žmogaus genu, dauginamos. Dėl to, kad sintezės procesais ji yra įmanoma gauti plazmidę milijardus kopijų žmogaus geno arba jo dalies.

Be to, DNR kopijos, pažymėtos radioaktyvia etikete arba fluorochromais, naudojamos kaip zondai, siekiant ieškoti papildomų sekų tarp tirtų DNR molekulių rinkinio.

Šiuo metu yra daug įvairių metodų, naudojančių DNR zondus genų mutacijų diagnozei.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],