Difterijos priežastys ir patogenezė

Difterija yra toksigeninių infekcinių ligų pavyzdys. 1883 m. Klebsas įrodė, kad difterijos sukėlėjas yra Corynebacterium diphtheriae. Po metų Loeffleris nustatė, kad organizmą galima kultivuoti tik iš nosiaryklės ertmės, ir pasiūlė, kad vidaus organų pažeidimą sukėlė tirpus toksinas. Iki 1888 m. Roux ir Yersinas parodė, kad gyvūnams, kuriems buvo sušvirkštas sterilus C. diphtheriae filtratas, išsivystė organų patologija, nesiskirianti nuo žmonių difterijos; tai parodė, kad pagrindinis virulentiškumo veiksnys buvo stiprus egzotoksinas.

Difterija dažniausiai yra viršutinių kvėpavimo takų infekcija, sukelianti karščiavimą, gerklės skausmą ir negalavimą. Dėl bakterijų augimo, toksino gamybos, audinių nekrozės ir šeimininko imuninio atsako bendro poveikio infekcijos vietoje (-ose) dažnai susidaro stora, pilkšvai žalia fibrino membrana – pseudomembrana. Pripažinimas, kad sisteminį organų pažeidimą sukelia difterijos toksinas, paskatino sukurti tiek veiksmingą antitoksinu pagrįstą terapiją ūminei infekcijai gydyti, tiek labai veiksmingą toksoidinę vakciną.

Nors imunizacija toksoidais difteriją pavertė reta liga tose vietovėse, kuriose visuomenės sveikatos standartai reikalauja vakcinacijos, difterijos protrūkiai vis dar pasitaiko neimunizuotose ir imunodeficito turinčiose grupėse. Priešingai, plačiai paplitę difterijos protrūkiai, pasiekę epidemijos mastą, įvyko tose vietovėse, kuriose aktyvios imunizacijos programos buvo sustabdytos.

Kitos korinebakterijų rūšys

Be C. diphtheriae, C. ulcerans ir C. pseudotuberculosis, C. pseudodiphtheriticum ir C. xerosis kartais gali sukelti nosiaryklės ir odos infekcijas. Pastarosios dvi padermės atpažįstamos pagal gebėjimą gaminti pirazinamidazę. Veterinarijoje C. renale ir C. kutscheri yra svarbūs patogenai, atitinkamai sukeliantys pielonefritą galvijams ir latentinę infekciją pelėms.

Priežastys

Difterijos sukėlėjas Corynebacterium diphtheriae yra plonas, šiek tiek išlenktas lazdelė su lazdelės formos sustorėjimais galuose, nejudantis; jis nesudaro sporų, kapsulių ar žvynelių ir yra gramteigiamas.

Be toksino, difterijos korinebakterijos savo gyvybinių procesų metu gamina neuraminidazę, hialuronidazę, hemoliziną, nekrotizuojančius ir difuzinius faktorius, kurie gali sukelti jungiamojo audinio pagrindinės medžiagos nekrozę ir suskystėjimą.

Remiantis jų gebėjimu gaminti toksiną, difterijos korinebakterijos skirstomos į toksigenines ir netoksogenines.

Difterijos toksinas yra stiprus bakterijų egzotoksinas, lemiantis tiek bendruosius, tiek vietinius ligos klinikinius požymius. Toksigeniškumas yra genetiškai nulemtas. Netoksigeninės difterijos korinebakterijos ligos nesukelia.

Pagal kultūrinius ir morfologinius ypatumus visos difterijos korinebakterijos skirstomos į 3 variantus: gravis, mitis ir intermedius. Ligos sunkumas tiesiogiai nepriklauso nuo difterijos korinebakterijų varianto. Kiekviename variante yra ir toksigeninių, ir netoksinių padermių. Visų variantų toksigeninės korinebakterijos išskiria identišką toksiną. [ 1 ]

Struktūra, klasifikacija ir antigenų tipai

Corynebacterium diphtheriae yra gramteigiamos, nejudrios, kuokos formos lazdelės formos bakterijos. Audiniuose arba senesnėse in vitro kultūrose augančios padermės ląstelių sienelėse turi smulkių dėmelių, kurios leidžia blukti Gramo dažymo metu ir sukelia kintamą Gramo reakciją. Senesnėse kultūrose dažnai yra metachromatinių granulių (polimetafosfato), kurios metileno mėlynuoju dažymu nusidažo melsvai violetine spalva. Ląstelės sienelių cukrūs yra arabinozė, galaktozė ir manozė. Be to, galima išskirti toksišką trehalozės 6,6'-esterį, kuriame yra korinemikolio ir korinemikoleno rūgščių ekvimolinėmis koncentracijomis. Skiriami trys skirtingi kultūrų tipai: mitis, intermedius ir gravis.

Daugumai padermių augimui reikalingos nikotino ir pantoteno rūgštys; kai kurioms taip pat reikia tiamino, biotino arba pimelo rūgšties. Optimaliai difterijos toksino gamybai terpėje turi būti aminorūgštys ir ji turi būti atidėta.

Jau 1887 m. Loeffleris aprašė avirulentinių (netoksinių) C. diphtheriae išskyrimą, kurių buvo neįmanoma atskirti nuo virulentinių (toksinių) padermių, išskirtų iš sveikų asmenų. Dabar pripažįstama, kad avirulentinės C. diphtheriae padermės gali būti paverstos virulentišku fenotipu po infekcijos ir lizogenizacijos vienu iš daugelio skirtingų korinebakteriofagų, turinčių difterijos toksino struktūrinį geną tox. Lizogeninė avirulentinio fenotipo konversija į virulentinį gali vykti tiek in situ, tiek in vitro. Difterijos toksino struktūrinis genas nėra būtinas nei korinebakteriofagui, nei C. diphtheriae. Nepaisant šio stebėjimo, difterijos toksino genetinis dreifas nebuvo pastebėtas.

[ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Pathogenesis

Infekcijos patekimo taškai yra burnos ir ryklės, nosies, gerklų gleivinės, rečiau akių ir lytinių organų gleivinės, taip pat pažeista oda, žaizdų ar nudegimų paviršiai, vystyklų bėrimas, negyjanti bambos žaizda. Patekimo taške dauginasi difterijos korinebakterija ir išskiria egzotoksiną.

Eksudatas, kuriame gausu fibrinogeno, išsiskiria ir, veikiant epitelio ląstelių nekrozės metu išsiskiriančiai trombokinazei, paverčiamas fibrinu. Susidaro fibrininė plėvelė – būdingas difterijos požymis.

Besimptomis nosiaryklės nešiojimas dažnas difterijos endeminiuose regionuose. Jautriems asmenims toksigeninės padermės sukelia ligą replikuodamos ir išskirdamos difterijos toksiną nosiaryklėje arba odos pažeidimuose. Difterijos pažeidimą dažnai dengia pseudomembrana, sudaryta iš fibrino, bakterijų ir uždegiminių ląstelių. Difterijos toksinas gali būti proteolizės būdu suskaidomas į du fragmentus: N-galinį fragmentą A (katalizinis domenas) ir fragmentą B (transmembraninis ir receptorius surišantis domenai). Fragmentas A katalizuoja NAD+ priklausomą elongacijos faktoriaus 2 ADP-ribozilinimą, tokiu būdu slopindamas baltymų sintezę eukariotinėse ląstelėse. Fragmentas B prisijungia prie ląstelės paviršiaus receptoriaus ir palengvina fragmento A patekimą į citozolį.

Apsauginis imunitetas apima antikūnų atsaką į difterijos toksiną po klinikinės ligos arba į difterijos toksiną (toksiną, inaktyvuotą formaldehidu) po imunizacijos.

Kolonizacija

Mažai žinoma apie veiksnius, kurie skatina C. diphtheriae kolonizaciją. Tačiau akivaizdu, kad virulentiškumui įtakos turi ir kiti veiksniai, ne tik difterijos toksino gamyba. Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad tam tikras lizotipas populiacijoje gali išlikti ilgą laiką. Vėliau jį gali pakeisti kitas lizotipas. Naujo lizotipo atsiradimas ir vėlesnis dominavimas populiacijoje greičiausiai susijęs su jo gebėjimu kolonizuotis ir efektyviai konkuruoti savo nosiaryklės ekologinės nišos segmente. Corynebacterium diphtheriae gali gaminti neuraminidazę, kuri skaido ląstelės paviršiaus sialo rūgštį į jos komponentus – piruvatą ir N-acetilneuramino rūgštį. Virvelės faktorius (6,6'-di-O-mikoloil-α, α'-D-trehalozė) yra C. diphtheriae paviršiaus komponentas, tačiau jo vaidmuo kolonizuojant žmogaus organizmą nėra aiškus.

Difterijos toksinų gamyba

Difterijos toksino struktūrinis genas tox priklauso glaudžiai susijusių korinebakteriofagų šeimai, iš kurių geriausiai ištirtas β-fagas. Difterijos toksino ekspresiją reguliuoja geležies aktyvuojamas represorius DtxR, kurį koduoja C. diphtheriae genomas. Toksino ekspresija priklauso nuo C. diphtheriae fiziologinės būsenos. Esant sąlygoms, kai geležis tampa augimo greitį ribojančiu substratu, geležis atsiskiria nuo DtxR, aktyvuojamas toksikodendrono genas, o difterijos toksinas sintetinamas ir išskiriamas į kultūros terpę maksimaliu greičiu.

Difterijos toksinas yra neįprastai stiprus; jautrioms rūšims (pvz., žmonėms, beždžionėms, triušiams, jūrų kiaulytėms) mirtina vos 100–150 ng/kg kūno svorio dozė. Difterijos toksiną sudaro viena 535 aminorūgščių polipeptidinė grandinė. Biocheminė, genetinė ir rentgeno struktūros analizė rodo, kad toksiną sudaro trys struktūriniai/funkciniai domenai:

• N-galinė ADP-riboziltransferazė (katalizinis domenas);
• regionas, kuris palengvina katalizinio domeno perdavimą per ląstelės membraną (transmembraninis domenas);
• eukariotinių ląstelių receptorių surišantis domenas.

Po švelnaus tripsino suskaidymo ir redukcijos denatūravimo sąlygomis, difterijos toksinas gali būti specifiškai suskaidomas ties proteazei jautria kilpa į du polipeptidinius fragmentus (A ir B). Fragmentas A yra toksino N-galinis 21 kDa komponentas ir jame yra katalizinė vieta elongacijos faktoriaus 2 (EF-2) ADP-ribozilinimui.

Monomerinio natūralaus difterijos toksino rentgeno kristalinės struktūros juostelės diagrama (modifikuota iš Bennett MJ, Choe S, Eisenberg D: Domenų keitimas: baltymų įsipainiojimas. Proc Natl Acad Sci, JAV, 91: 3127, 1994). Parodytos katalizinio, transmembraninio ir receptorių surišančio domenų santykinės padėtys. Nepažeistą toksiną gali skaldyti tripsino tipo proteazės Arg190, Arg192 ir (arba) Arg193, kurios yra proteazėms jautrioje kilpoje (PSL). Redukuojant disulfidinį tiltelį tarp Cys186 ir Cys201, toksiną galima suskaidyti į A ir B fragmentus. Parodytas nepažeisto toksino amino galas (N) ir karboksi galas (C). Juostinė diagrama buvo sukurta naudojant MOLESCRIPT programą.

C-galinis fragmentas, fragmentas B, turi toksino transmembraninį ir receptorius surišantį domenus.

Vienos eukariotinės ląstelės apsinuodijimas difterijos toksinu apima bent keturis skirtingus etapus:

1. toksino prisijungimas prie jo receptoriaus ląstelės paviršiuje;
2. įkrautų receptorių susikaupimas dengtose duobutėse ir toksino internalizavimas receptorių sukeltos endocitozės būdu; po endocitinės pūslelės parūgštinimo membrana susijusiu, ATP valdomu protonų siurbliu,
3. transmembraninio domeno įterpimas į membraną ir palengvintas katalizinio domeno patekimas į citozolį, ir
4. EF-2 ADP-ribozilinimas, dėl kurio negrįžtamai slopinama baltymų sintezė.

Įrodyta, kad vienos katalizinio domeno molekulės, pristatytos į citozolį, pakanka, kad būtų mirtina ląstelei.

Difterijos intoksikacijos jautriose eukariotų ląstelėse schema.

Toksinas jungiasi prie savo ląstelės paviršiaus receptoriaus ir yra internalizuojamas per receptorių sukeltą endocitozę; parūgštinus endosomą, transmembraninis domenas įterpiamas į pūslelės membraną; katalizinis domenas patenka į citozolį, slopindamas baltymų sintezę ir sukeldamas ląstelių mirtį.

Epidemiologija

Prieš masinę JAV gyventojų imunizaciją difterijos toksoidu, difterija dažniausiai buvo vaikų liga. Svarbus masinės imunizacijos difterijos toksoidu aspektas yra tas, kad didėjant gyventojų, turinčių apsauginį antitoksininį imunitetą (≥ 0,01 TV/ml), procentui, toksigeninių padermių išskyrimo iš populiacijos dažnis mažėja. Šiandien Jungtinėse Valstijose, kur klinikinė difterija beveik visiškai išnyko, toksigeninių C. diphtheriae padermių išskyrimas yra retas. Kadangi subklinikinė infekcija nebesuteikia sąlyčio su difterijos antigenu šaltinio ir, nebent būtų sustiprintas imunitetas antitoksinui, didelis procentas suaugusiųjų (30–60 %) turi antitoksinų lygį žemiau apsauginio lygio ir jiems gresia pavojus. Jungtinėse Valstijose, Europoje ir Rytų Europoje pastaruoju metu difterijos protrūkiai daugiausia pasitaikė tarp asmenų, kurie piktnaudžiauja alkoholiu ir (arba) narkotikais. Šioje grupėje toksigeninių C. diphtheriae nešiotojai turi vidutiniškai aukštą antitoksinio imuniteto lygį. Neseniai Rusijoje žlugus visuomenės sveikatos priemonėms, difterija tapo epidemija. Iki 1994 metų pabaigos Rusijoje buvo užregistruota daugiau nei 80 000 atvejų ir daugiau nei 2 000 mirčių.

Židininiai difterijos protrūkiai beveik visada susiję su imuninės sistemos nešiotoju, grįžusiu iš regiono, kuriame difterija yra endeminė. Iš tiesų, pastarieji klinikinės difterijos protrūkiai Jungtinėse Valstijose ir Europoje buvo susiję su keliautojais, grįžusiais iš Rusijos ir Rytų Europos. Toksigeninės C. diphtheriae padermės perduodamos tiesiogiai iš žmogaus žmogui ore esančiais lašeliais. Yra žinoma, kad toksigeninės padermės gali tiesiogiai kolonizuoti nosiaryklės ertmę. Be to, toksigeninis genas gali plisti netiesiogiai, išskiriant toksigeninį korinebakteriofagą ir lizogeniškai transformuojant netoksogeninius autochtoninius C. diphtheriae in situ. [ 5 ]

Be C. diphtheriae izoliatų biotipo ir lizotipo nustatymo, molekulinės biologijos metodai dabar gali būti naudojami difterijos protrūkiams tirti. Klinikiniams protrūkiams tirti buvo naudojami C. diphtheriae chromosomų DNR restrikcijos endonukleazės skaidymo modeliai, taip pat klonuotų korinebakterijų įterpimo sekų naudojimas kaip genetinis zondas.

Šiko testas daugelį metų buvo naudojamas imunitetui difterijos toksinui įvertinti, nors dabar daugelyje sričių jį pakeitė serologinis specifinių antikūnų prieš difterijos toksiną testas. Šiko testo metu nedidelis kiekis difterijos toksino (maždaug 0,8 ng 0,2 ml) suleidžiamas į odą į dilbį (tiriamoji vieta), o 0,0124 μg difterijos toksino 0,2 ml suleidžiama į odą į kontrolinę vietą. Rodmenys imami po 48 ir 96 valandų. Nespecifinės odos reakcijos paprastai pasiekia piką po 48 valandų. Po 96 valandų eriteminė reakcija su galima nekroze tyrimo vietoje rodo nepakankamą antitoksinį imunitetą toksinui neutralizuoti (≤ 0,03 TV/ml). Uždegimas tiek tyrimo, tiek kontrolinėje srityse po 48 valandų rodo padidėjusio jautrumo reakciją į antigeno preparatą.

Formos

Corynebacterium diphtheriae užkrečia nosiaryklę arba odą. Toksigeninės padermės išskiria stiprų egzotoksiną, kuris gali sukelti difteriją. Difterijos simptomai yra faringitas, karščiavimas ir kaklo arba aplink odos pažeidimą esančios srities patinimas. Difterijos pažeistus plotus dengia pseudomembrana. Toksinas per kraują plinta į tolimus organus ir gali sukelti paralyžių bei stazinį širdies nepakankamumą. [ 6 ]

Yra du klinikinės difterijos tipai: nosiaryklės ir odos. Ryklės difterijos simptomai svyruoja nuo lengvo faringito iki hipoksijos dėl pseudomembranos užkimštų kvėpavimo takų. Kaklo limfmazgių pažeidimas gali sukelti stiprų kaklo patinimą (jaučio kaklo difterija), pacientui gali pasireikšti karščiavimas (≥ 103°F). Odos pažeidimai sergant odos difterija paprastai yra padengti pilkai ruda pseudomembrana. Dėl difterijos toksino poveikio periferiniams motoriniams neuronams ir miokardui gali išsivystyti gyvybei pavojingos sisteminės komplikacijos, daugiausia motorinės funkcijos praradimas (pvz., rijimo sutrikimas) ir stazinis širdies nepakankamumas.

Valdymas

Difterijos kontrolė priklauso nuo tinkamos imunizacijos difterijos toksoidu: difterijos toksinu, inaktyvuotu formaldehidu, kuris išlieka antigeniškai nepakitęs. Toksoidas paruošiamas inkubuojant difterijos toksiną su formaldehidu 37 °C temperatūroje šarminėje aplinkoje. Imunizacija nuo difterijos turėtų būti pradėta antrąjį gyvenimo mėnesį, skiriant tris pirmines dozes kas 4–8 savaites, o ketvirtąją dozę – maždaug po metų nuo paskutinės pirminės dozės. Difterijos toksoidas plačiai naudojamas kaip difterijos, kokliušo ir stabligės (DPT) vakcinos komponentas. Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad imunizacija nuo difterijos yra maždaug 97 % veiksminga. Nors Jungtinėse Amerikos Valstijose ir Europoje vykdoma masinė imunizacija nuo difterijos, o vaikų imunizacijos rodikliai yra pakankami, didelė dalis suaugusiųjų populiacijos gali turėti antikūnų titrus, mažesnius už apsauginį lygį. Suaugusieji turėtų būti revakcinuojami difterijos toksoidu kas 10 metų. Iš tiesų, keliautojams, vykstantiems į vietoves, kuriose yra didelis endeminės difterijos paplitimas (Centrinė ir Pietų Amerika, Afrika, Azija, Rusija ir Rytų Europa), reikėtų skirti revakcinaciją difterijos ir stabligės toksoidu. Pastaraisiais metais imunizacijai naudojant labai išgrynintus toksoidų preparatus sumažėjo kartais pasitaikančių sunkių padidėjusio jautrumo reakcijų. Revakcinacija difterijos ir stabligės toksoidu turėtų būti atliekama keliautojams, vykstantiems į vietoves, kuriose yra didelis endeminės difterijos paplitimas (Centrinė ir Pietų Amerika, Afrika, Azija, Rusija ir Rytų Europa). Pastaraisiais metais imunizacijai naudojant labai išgrynintus toksoidų preparatus sumažėjo kartais pasitaikančių sunkių padidėjusio jautrumo reakcijų. Revakcinacija difterijos ir stabligės toksoidu turėtų būti atliekama keliautojams, vykstantiems į vietoves, kuriose yra didelis endeminės difterijos paplitimas (Centrinė ir Pietų Amerika, Afrika, Azija, Rusija ir Rytų Europa). Pastaraisiais metais imunizacijai naudojant labai išgrynintus toksoidų preparatus sumažėjo kartais pasitaikančių sunkių padidėjusio jautrumo reakcijų.

Nors antibiotikai (pvz., penicilinas ir eritromicinas) yra naudojami gydant difteriją, greita pasyvi imunizacija difterijos antitoksinu yra veiksmingiausia mažinant mirtingumą. Ilgas specifinio antitoksino pusinės eliminacijos laikas kraujyje yra svarbus veiksnys, užtikrinantis veiksmingą difterijos toksino neutralizavimą; tačiau, kad antitoksinas būtų veiksmingas, jis turi sureaguoti su toksinu, kol nepatenka į ląstelę.

Difterijos toksino reinžinerija eukariotinių receptorių specifinių citotoksinų kūrimui

Baltymų inžinerija yra nauja ir sparčiai besivystanti molekulinės biologijos sritis; ji derina rekombinantinės DNR metodus ir kietosios fazės DNR sintezę, siekiant sukurti ir konstruoti chimerinius genus, kurių produktai pasižymi unikaliomis savybėmis. Difterijos toksino struktūros ir funkcijos ryšių tyrimai aiškiai parodė, kad šis toksinas yra trijų domenų baltymas: katalizinis, transmembraninis ir receptorinis. Genetiškai buvo įmanoma pakeisti natyvų difterijos toksino receptorių surišantį domeną įvairiais polipeptidiniais hormonais ir citokinais (pvz., α-melanocitus stimuliuojančiu hormonu [α-MSH], interleukinu (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-7, epidermio augimo faktoriumi). Gauti chimeriniai baltymai arba susiliejimo toksinai sujungia citokino receptorių surišimo specifiškumą su toksino transmembraniniu ir kataliziniu domenais. Kiekvienu atveju buvo parodyta, kad susiliejimo toksinai selektyviai nuodija tik tas ląsteles, kurios turi atitinkamą taikinį receptorių. Pirmasis iš šių genetiškai modifikuotų susiliejimo toksinų, DAB 389IL-2, šiuo metu yra vertinamas klinikiniuose tyrimuose su žmonėmis, siekiant gydyti refrakterines limfomas ir autoimunines ligas, kurių patogenezėje svarbų vaidmenį atlieka ląstelės su didelio afiniteto IL-2 receptoriais.[ 7 ] Įrodyta, kad DAB 389 IL-2 vartojimas yra saugus, gerai toleruojamas ir gali sukelti ilgalaikę ligos remisiją be jokio rimto šalutinio poveikio. Tikėtina, kad difterijos toksino pagrindu sukurti susiliejimo toksinai taps svarbiais naujais biologiniais vaistais, skirtais specifiniams navikams arba ligoms, kurių atveju galima paveikti specifinius ląstelių paviršiaus receptorius, gydyti.