Imunologiniai tyrimai urologijoje

Imunogramos skyrimas urologiniam pacientui reiškia, kad gydantis gydytojas įtaria imuninės sistemos sutrikimus. Pasikartojančios bakterinės, virusinės, grybelinės infekcijos, alerginės apraiškos, sisteminės ligos gali būti šių sutrikimų požymiai, kuriems būdingi keli sindromai (infekcinis, onkologinis, alerginis, autoimuninis, limfoproliferacinis). Vienas pacientas gali turėti kelis sindromus. Pavyzdžiui, lėtinės infekcinės ligos (infekcinis sindromas) gali sukelti imunodeficitą, o imunodeficitas gali pasireikšti kaip polinkis sirgti infekcinėmis ir onkologinėmis ligomis (onkologinis sindromas). Polinkis į infekcijas gali atsirasti antrinio imunodeficito, kuris išsivystė dėl limfoproliferacinės ligos, tokios kaip leukemija, fone. Yra trys pagrindinės imuninės sistemos patologinių pokyčių grupės:

• kiekybinis arba funkcinis vieno ar kito imuninės sistemos ryšio trūkumas, dėl kurio atsiranda imunodeficito būsena;
• imuninės sistemos antigenų atpažinimo sutrikimas, dėl kurio vystosi autoimuniniai procesai;
• hiperreaktyvus arba „iškreiptas“ imuninis atsakas, pasireiškiantis alerginių ligų išsivystymu.

Yra atrankinės (1 lygio tyrimai) ir patikslinančiosios (2 lygio tyrimai) imunodiagnostikos metodai. Pirmieji skirti imuninės sistemos sutrikimams registruoti, antrieji – jų įgyvendinimo mechanizmams nustatyti, siekiant atlikti tolesnę imunokorekciją.

B ląstelių imunitetas

Atrankos metodai

• Santykinio ir absoliutaus B limfocitų skaičiaus nustatymas imunofluorescencijos arba srautinės citofluorometrijos metodu su monokloniniais antikūnais prieš B ląstelių antigenus (CD19, CD20, kur CD – diferenciacijos klasteriai). Normalus B limfocitų kiekis suaugusiesiems yra 8–19 % bendro leukocitų skaičiaus arba 190–380 ląstelių/μl. B limfocitų kiekis padidėja sergant ūminėmis ir lėtinėmis bakterinėmis ir grybelinėmis infekcijomis, lėtinėmis kepenų ligomis, sisteminėmis jungiamojo audinio ligomis, lėtine limfocitine leukemija ir mieloma.
• Nespecifinių imunoglobulinų (F, M, G, E) koncentracijos nustatymas paprastosios radialinės imunodifuzijos, nefelometrijos arba turbometrijos, radioimuninio arba fermentinio imunologinio tyrimo (ELISA) metodu. Suaugusiųjų normos: imunoglobulinas (Ig) A 0,9–4,5 g/l. IgM 03–3,7 g/l. IgG 8,0–17 g/l. Imunoglobulinų koncentracija padidėja esant toms pačioms patologinėms būklėms, kuriomis padidėja B limfocitų kiekis. Imunoglobulinų koncentracija sumažėja esant įgimtai hipogamaglobulinemijai, imuninės sistemos navikams, pašalinus blužnį, netekus baltymų, esant inkstų ar žarnyno ligoms, gydant citostatikais ir imunosupresantais.

Aiškinimo metodai

• Kraujyje cirkuliuojančių imuninių kompleksų nustatymas selektyviu nusodinimu polietilenglikolyje, po kurio atliekamas spektrofotometrinis tankio tyrimas (norma 80–20 U). Cirkuliuojančių imuninių kompleksų padidėjimas būdingas ūminėms bakterinėms, grybelinėms, virusinėms infekcijoms, autoimuninėms, imuninių kompleksų ligoms, seruminei ligai, 3 tipo alerginėms reakcijoms;
• Specifinių imunoglobulinų, susijusių su bakterijų ir virusų antigenais, deoksiribonukleino rūgšties (DNR) nustatymas kraujyje autoimuninių ligų atveju, antispermos (autoimuninio nevaisingumo) ir antirenalinių antikūnų (pielonefrito ir glomerulonefrito) nustatymas radialinės imunodifuzijos arba ELISA metodu.
• Antispermos antikūnų nustatymas spermoje [MAR testas (mišri antiglobulino reakcija)], normalus - neigiamas rezultatas.
• Imunoglobulinų koncentracijos šlapime nustatymas diferencinei diagnozei tarp pielonefrito ir glomerulonefrito (proteinurijos selektyvumas).
• IgE kiekio nustatymas prostatos sultyse alerginio prostatito diagnozei naudojant radialinį imunodifuzijos metodą arba ELISA.
• B limfocitų blastų transformacijos reakcijos į B ląstelių mitogeną (alkūnės mitogeną, skirtą B limfocitų blastų transformacijos reakcijai stimuliuoti esant T limfocitams) tyrimas, kurio normatyvinė vertė yra 95–100 %.

T ląstelių ryšys imunitete

Atrankos metodai

• Subrendusių CD3 T limfocitų santykinio ir absoliutaus skaičiaus nustatymas imunofluorescencijos reakcijos arba srautinės citofluorometrijos metodu, naudojant monokloninius anti-CD3 antikūnus. Suaugusiesiems norma yra 58–76 % arba 1100–1700 ląstelių/μl. T limfocitų skaičiaus sumažėjimas rodo ląstelinio imuniteto ryšio nepakankamumą. Tai būdinga kai kuriems antriniams ir pirminiams imunodeficitams (lėtinėms bakterinėms ir virusinėms infekcijoms: tuberkuliozei, įgytam imunodeficito sindromui, piktybiniams navikams, lėtiniam inkstų nepakankamumui, traumoms, stresui, senėjimui, nepakankamai mitybai, gydymui citostatikais, jonizuojančiosios spinduliuotės poveikiui). T limfocitų skaičiaus padidėjimas atsiranda esant imuniniam hiperaktyvumui arba limfoproliferacinėms ligoms. Uždegimo metu T limfocitų skaičius pirmiausia padidėja, o vėliau sumažėja. T limfocitų skaičiaus sumažėjimo nebuvimas rodo lėtinį uždegiminį procesą.
• Limfocitų subpopuliacijų įvertinimas.
  • T helperių (anti-CD4 antikūnų) skaičiaus nustatymas. Normaliomis sąlygomis 36–55 % arba 400–1100 ląstelių/mcl. Šių ląstelių skaičius padidėja sergant autoimuninėmis ligomis, Valdenstromo liga, suaktyvėjus antitransplantaciniam imunitetui; T helperių skaičius sumažėja sergant lėtinėmis bakterinėmis, virusinėmis, pirmuonių infekcijomis, tuberkulioze, įgytu imunodeficito sindromu, piktybiniais navikais, nudegimais, traumomis, nepakankama mityba, senėjimu, gydymu citostatikais, jonizuojančiosios spinduliuotės poveikiu.
  • T-slopintojų (anti-CD4 antikūnų) skaičiaus nustatymas. Paprastai 17–37 % arba 300–700 ląstelių/μl. T-slopintojų skaičiaus padidėjimas vyksta tomis pačiomis sąlygomis, kuriomis T-helperių skaičius mažėja, o jų sumažėjimas – tomis pačiomis sąlygomis, kuriomis T-helperių kiekis padidėja.
  • Imunoreguliacijos indeksas CD4/CD8, paprastai 1,5–2,5. Hiperaktyvumas, kai vertės didesnės nei 2,5 (alerginės ir autoimuninės ligos); hipoaktyvumas – mažesnis nei 1,0 (polinkis į lėtines infekcijas). Uždegiminio proceso pradžioje imunoreguliacijos indeksas padidėja, o jam sumažėjus, normalizuojasi.

Aiškinimo metodai

• Natūralių žudikų (NK ląstelių) skaičiaus nustatymas – anti-CD16 ir anti-CD56 antikūnai. CD 16 limfocitų norma yra 6–26 %, CD56 – 9–19 %. NK ląstelių skaičius padidėja transplantato atmetimo metu, sumažėja – sergant virusinėmis infekcijomis, vėžiu, pirminiais ir antriniais imunodeficitais, nudegimais, traumomis ir stresu, gydant citostatikais ir veikiant jonizuojančiajai spinduliuotei.
• T limfocitų, turinčių interleukino-2 receptorių (aktyvacijos žymenį) – anti-CD25 antikūnų, skaičiaus nustatymas. Norma yra 10–15 %. Jų skaičiaus padidėjimas stebimas sergant alerginėmis ligomis, transplantato atmetimo reakcija, reaguojant į užkrūčio liaukos priklausomus antigenus ūminiu pirminės infekcijos laikotarpiu, sumažėjimas – sergant tomis pačiomis ligomis, kuriomis sumažėja NK ląstelių skaičius.
• Aktyvacijos žymens – II klasės histosuderinamumo molekulės HLA-DR – raiškos tyrimas. Padidėjusi raiška pasireiškia uždegiminių procesų metu, sergantiems hepatitu C, celiakija, sifiliu, ūminėmis kvėpavimo takų ligomis.
• Limfocitų apoptozės įvertinimas. Apytikslį supratimą apie limfocitų pasirengimą apoptozei galima susidaryti pagal Fas receptoriaus (CD95) raišką jų paviršiuje ir bd-2 protoonkogeno raišką mitochondrijose. Limfocitų apoptozė įvertinama juos veikiant dviem fluorescenciniais dažais: propidžio jodidu, kuris jungiasi prie DNR fragmentų, ir aneksinu Y, kuris jungiasi prie fosfatidilserino, kuris atsiranda ant ląstelės membranos apoptozės pradžioje. Rezultatai įvertinami naudojant srauto citofluorometrą. Rezultatai apskaičiuojami pagal skirtingais dažais nudažytų ląstelių santykį. Nenudažytos ląstelės yra gyvybingos, ląstelės, prisijungusios tik prie aneksino Y, yra ankstyvos apoptozės apraiškos, su propidžio jodidu ir aneksinu Y – vėlyvos apoptozės apraiškos, dažymas tik propidžio jodidu rodo nekrozę.
• T limfocitų proliferacijos įvertinimas in vitro.
  • Ląstelių blastogenezės pokyčiai – limfocitų blastų transformacijos reakcija. Leukocitai inkubuojami su bet kokiu augalinės kilmės mitogenu (lektinais). Fitohemagliutininas dažniausiai naudojamas 72 valandas, tada imamas tepinėlis, dažomas ir skaičiuojamas blastų skaičius! Stimuliacijos indeksas – tai transformuotų ląstelių procentinės dalies eksperimente (kultūra su fitohemagliutininu) ir transformuotų ląstelių procentinės dalies kontrolinėje grupėje (kultūra be fitohemagliutinino) santykis. Limfocitų blastų transformacijos reakciją galima įvertinti įtraukiant radioaktyviąją žymę (ZN-timdiną) į kultivuojamas ląsteles, nes DNR sintezė padidėja ląstelių dalijimosi metu. Proliferacinio atsako sutrikimai pasireiškia tiek pirminio, tiek antrinio imunodeficito atvejais, susijusiais su infekcijomis, vėžiu, inkstų nepakankamumu ir chirurginėmis intervencijomis.
  • Šių tyrimų metu vertinama aktyvacijos žymenų (CD25, transferino receptoriaus - CD71) ir pagrindinio audinių suderinamumo komplekso II klasės HLA-DR molekulės, kurių ramybės būsenos T limfocituose praktiškai nėra, raiška. T limfocitai stimuliuojami fitohemagliutininu, po 3 dienų aktyvacijos žymenų raiška analizuojama tiesioginės arba netiesioginės imunofluorescencinės reakcijos metodu, srautine citofluorometrija, naudojant monokloninius antikūnus prieš izoliuotus receptorius.
  • Aktyvuotų T limfocitų susintetintų mediatorių [interleukino (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferono ir kt.] kiekio matavimas naudojant radioimuninį tyrimą arba ELISA. Ypač svarbu įvertinti γ-interferono ir IL-4, kaip Th1 ir Th2 žymenų, koncentraciją aktyvuotų kultūrų supernatate ir ląstelės viduje. Jei įmanoma, naudinga nustatyti atitinkamo citokino genų ekspresiją pagal matricos ribonukleino rūgšties kiekį gamybinėje ląstelėje ir atitinkamų citokinų receptorių ekspresijos intensyvumą.
    
• Limfocitų migracijos slopinimo reakcija. Jautrinti T limfocitai, reaguodami su antigenu, išskiria limfokinus, įskaitant limfocitų migraciją slopinančius veiksnius. Slopinimo reiškinys stebimas, kai į ląstelių kultūrą įvedami mitogenai. Slopinimo laipsnio įvertinimas leidžia spręsti apie limfocitų gebėjimą išskirti citokinus. Normaliomis sąlygomis migracijos dažnis, priklausomai nuo konkretaus mitogeno, yra 20–80 %.
• NK ląstelių citotoksiškumo įvertinimas. Nustatomas natūralių žudikių ląstelių gebėjimas sunaikinti K-562 eritromieloidinės linijos tikslines ląsteles. Jei vertinamas nuo antikūnų priklausomas citotoksiškumas, naudojamos IgG antikūnais padengtos tikslinės ląstelės. Tikslinės ląstelės žymimos 3H-uridinu ir inkubuojamos su efektorinėmis ląstelėmis. Tikslinių ląstelių žūtis įvertinama išskiriant radioaktyvųjį žymeklį į tirpalą. Citotoksiškumo sumažėjimas stebimas esant piktybiniams navikams. Kai kuriais atvejais, kai reikia numatyti gydymo interleukinais veiksmingumą, NK ląstelių citotoksiškumas įvertinamas inkubacijos su tam tikrais citokinais metu.

Fagocitų funkcijos tyrimas

Atrankos metodai

Mikrobinių ląstelių absorbcijos fagocitais intensyvumo tyrimas (latekso dalelių fagocitozė, stafilokokų, E. coli arba iš paciento išskirti mikroorganizmai). Centrifuguojant heparinizuotą kraują, išskiriama leukocitų suspensija, į ją įpilama IV kraujo grupės serumo opsonizacijai (opsoninai yra baltymai, stiprinantys fagocitozę). Mikrobinė suspensija praskiedžiama, sumaišoma su leukocitais ir inkubuojama 120 minučių, mėginiai analizei imami praėjus 30, 90, 120 minučių nuo inkubacijos pradžios. Iš surinktos leukocitų suspensijos daromi tepinėliai. Nustatomi šie fagocitozės rodikliai:

• fagocitinis indeksas – ląstelių, kurios per 30 ir 120 inkubacijos minučių pradėjo fagocitozę, procentinė dalis; standartinė fagocitinio indekso (30) vertė yra 94 %, fagocitinio indekso (120) – 92 %;
• fagocitinis skaičius – vidutinis tarpląsteliniu būdu esančių bakterijų skaičius; standartinė fagocitinio skaičiaus (30) vertė yra 11 %, fagocitinio skaičiaus (120) – 9,8 %;
• fagocitų skaičiaus koeficientas – fagocitų skaičiaus (30) ir fagocitų skaičiaus (120) santykis; paprastai 1,16;
• Neutrofilų baktericidinis indeksas – tai fagocituose sunaikintų mikrobų skaičiaus ir bendro absorbuotų mikrobų skaičiaus santykis; paprastai 66 %.

Aiškinimo metodai

• Fagocitų baktericidinio gebėjimo tyrimas nitromėlynuoju tetrazoliu (NBT) – NBT testas. Į leukocitus pridedama geltonojo nitromėlynojo tetrazoliu dažo. Kai neutrofilas absorbuoja dažus, laisvųjų deguonies radikalų veikiamas vyksta redukcijos procesas, dėl kurio susidaro mėlyna spalva. Reakcija atliekama 96 šulinėlių plokščiadugnėje plokštelėje. Į pirmuosius tris šulinėlius su NBT ir leukocitų mišiniu įpilama Hankso tirpalo (savaiminio NBT), o į antrąją – latekso dalelių; mišinys inkubuojamas 37 °C temperatūroje 25 minutes. Rezultatai nuskaitomi skaitytuvu, esant 540 nm bangos ilgiui, ir išreiškiami savavališkais vienetais. Apskaičiuojamas stimuliacijos koeficientas (K _st ), lygus optinio tankio stimuliuojamose šulinėlėse ir vidutinio optinio tankio šulinėlėse be stimuliacijos santykiui. Sveikiems žmonėms NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stimul = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Adhezijos molekulių tyrimas. Srauto citofluorometrija naudojama paviršiaus antigenų CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18 raiškai nustatyti. Imunodeficitas su sutrikusia adhezija pasireiškia pasikartojančiomis infekcijomis, lėtu žaizdų gijimu ir pūlių nebuvimu infekcijos židiniuose.

Komplemento sistemos tyrimas

Atrankos metodai

Komplemento hemolizinio aktyvumo nustatymas yra klasikinio komplemento aktyvacijos kelio tyrimas. Į antikūnais padengtus eritrocitus pridedami skirtingi sergančio ir sveiko žmogaus serumo skiediniai. Hemolizinio aktyvumo vienetas yra atvirkštinė serumo skiedimo, kuriam esant sunaikinama 50 % eritrocitų, vertė. Hemolizės laipsnis įvertinamas fotometriškai pagal hemoglobino išsiskyrimą į tirpalą. Komplemento hemolizinio aktyvumo sumažėjimas stebimas sergant sistemine raudonąja vilklige su inkstų pažeidimu, ūminiu glomerulonefritu, kombinuotais imunodeficitais, miastenija, virusiniu hepatitu, limfomomis, padidėjimas – sergant obstrukcine gelta, Hašimoto tiroiditu, reumatu, reumatoidiniu artritu, mazgeliniu periarteritu, dermatomiozitu, miokardo infarktu, opiniu kolitu, Reiterio sindromu, podagra.

Aiškinimo metodai

• Komplemento komponentų nustatymas. Kiekybinis nustatymas atliekamas radialine imunodifuzija ir nefelometrija.
  Tyrimas nėra informatyvus, nebent pakistų komplemento komponentų antigeninės savybės.
• Nustatyta, kad komplemento Clq komponentas sustiprina fagocitozę ir tarpininkauja ląstelių citotoksiškumui. Jo sumažėjimas pasireiškia sergant imuninio komplekso ligomis, sistemine raudonąja vilklige, pūlingomis infekcijomis ir navikais.
• C3 komponentas dalyvauja klasikinio ir alternatyvaus komplemento signalų perdavimo mechanizmų aktyvavime. Jo koncentracijos sumažėjimas siejamas su lėtinėmis bakterinėmis ir grybelinėmis infekcijomis, cirkuliuojančių ar audinių imuninių kompleksų buvimu.
• C4 komponentas dalyvauja klasikinio kelio aktyvavime. Jo koncentracijos sumažėjimas yra susijęs su ilgalaikiu komplemento aktyvavimu imuniniais kompleksais ir C1 inhibitoriaus, kontroliuojančio klasikinio komplemento kelio aktyvaciją, koncentracijos sumažėjimu. C4 trūkumas pasireiškia sergant sistemine raudonąja vilklige, C4 padidėjimas – sergant inkstų ligomis, transplantato atmetimo reakcija, ūminiu uždegimu ir virškinimo trakto ligomis.
• C5a yra mažas C5 molekulės fragmentas, kuris nuo jos atsiskiria aktyvuojant komplemento sistemą. Jo koncentracija padidėja uždegimo, sepsio, atopinių ir alerginių ligų metu.
• Cl inhibitorius yra daugiafunkcis faktorius. Jis kontroliuoja komplemento komponento C1 aktyvaciją, slopina kalikreino, plazmino ir aktyvuoto Hagemano faktoriaus, Cls ir Or proteazių aktyvumą. C1 inhibitoriaus trūkumas sukelia angioneurozinę edemą.
• Funkciniai komplemento tyrimai. Tiriamojo serumo priedas pridedamas prie standartinio serumo, kuriame nėra jokio komplemento komponento, ir nustatomas komplemento hemolizinis aktyvumas. Jei hemolizinis aktyvumas neatstatomas iki normalaus lygio, laikoma, kad šio komplemento komponento aktyvumas tiriamajame serume yra sumažėjęs.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]